欧共体委员会  文件类型：PDF/Adobe Acrobat   文件大小：字节

1
第四卷
2
欧共体委员会
布鲁塞尔, 29/10/2003
COM(2003) 664 临时版本
2003/0256(COD)
2003/0257(COD)
第四卷—法规提案附X,B部分
关于化学品的注册,评估,授权和限制(REACH),建立欧洲化学
品管理局并修订指令1999/45/EC和法规(EC)(有关持久
有机污染物)
欧洲议会和理事会法规提案
为使指令适应欧洲议会和理事会关于化学品的注册,评估,授权和
限制法规(EC)而修订理事会指令67/548/EEC的指令
欧洲议会和理事会指令提案
(由欧委会提交)
{SEC(2003)1171}
3
目录
B部分:确定毒性及其他健康效应的化学方法.................................... 28
引言:B部分......................................................................................... 28
用于测定方法B部份术语的一般定义................................................ 28
B.1.急性-重复剂量毒性 / 亚慢性及慢性毒性.................................... 30
B.2诱变(性)-生殖毒性.................................................................. 31
B.3致癌物质.......................................................................................... 34
B.4生殖毒性.......................................................................................... 34
B.5.神经毒剂....................................................................................... 35
B.6免疫毒性.......................................................................................... 35
B.7 毒性动力学..................................................................................... 35
C.测定物质的性质................................................................................. 36
D.动物样品的培养................................................................................. 36
E.动物样品的保护................................................................................. 38
F 其它测定方法.................................................................................... 39
G 实验结果评估和解释........................................................................ 40
H.文献注释............................................................................................ 40
B.1两步法 急性毒性(口饲)-固定剂量方法................................... 41
1. 方法............................................................................................. 41
1.1. 引言.................................................................................... 41
1.2. 定义.................................................................................... 41
1.3. 参考物质............................................................................ 41
4
1.4. 测定方法原理..................................................................... 41
1.5.质量标准.............................................................................. 42
1.6.测定方法的描述................................................................... 42
2.实验数据....................................................................................... 46
3.实验结果报告............................................................................... 47
3.1.测定结果报告....................................................................... 47
3.2. 实验结果评价与分析....................................................... 48
4. 参考文献..................................................................................... 49
B.1 三步法 急性毒性 (口饲) -急性毒性等级方法............................ 50
1. 方法............................................................................................. 50
1.1. 引言.................................................................................... 50
1.2. 定义.................................................................................... 50
1.3. 测定方法原理..................................................................... 51
1.4. 测定方法的描述................................................................. 51
2. 实验数据................................................................................... 55
3. 实验结果报告............................................................................ 55
3.1. 实验结果报告................................................................... 55
4. 参考文献................................................................................... 56
B.2.剧毒毒性测定(吸入药剂).......................................................... 62
1. 方法........................................................................................... 62
1.1. 引言.................................................................................. 62
1.2. 定义.................................................................................. 62
5
1.3. 参考物质........................................................................... 62
1.4. 测定方法原理................................................................... 62
1.5. 质量标准........................................................................... 63
1.6. 实验方法的描述............................................................... 63
2. 实验数据................................................................................... 67
3. 实验结果报告............................................................................ 67
3.1. 实验结果报告................................................................... 67
3.2. 实验结果评价及分析....................................................... 69
4. 参考文献................................................................................... 69
B.3. 急性毒性(皮肤)........................................................................ 70
1. 方法........................................................................................... 70
1.1. 引言.................................................................................. 70
1.2. 定义.................................................................................. 70
1.3. 参考物质........................................................................... 70
1.4. 测定方法原理................................................................... 70
1.5. 质量标准........................................................................... 70
1.6. 实验方法描述................................................................... 71
2. 实验数据................................................................................... 74
3. 实验结果报告............................................................................ 74
3.1. 实验结果报告................................................................... 74
3.2. 实验结果评价及分析....................................................... 76
4. 参考文献................................................................................... 76
6
B.4.急性毒性(皮肤刺激).................................................................. 77
1方法............................................................................................... 77
1.1.引言...................................................................................... 77
1.2.定义...................................................................................... 77
1.3.参考物质.............................................................................. 77
1.4.测定方法原理....................................................................... 77
1.5.质量标准.............................................................................. 78
1.6.测定方法描述....................................................................... 78
2.实验数据....................................................................................... 81
3.实验结果报告............................................................................... 81
3.1.实验结果报告....................................................................... 81
3.2.实验结果评价与分析........................................................... 82
4.参考文献....................................................................................... 82
B.5.急性中毒(眼部刺激).................................................................. 84
1.方法............................................................................................... 84
1.1.引言...................................................................................... 84
1.2.定义...................................................................................... 84
1.3.参考物质.............................................................................. 84
1.4.测定方法原理....................................................................... 84
1.5质量标准.............................................................................. 85
1.6测定方法描述....................................................................... 85
2.实验数据....................................................................................... 88
7
3实验结果报告............................................................................... 88
3.1测定结果报告....................................................................... 88
3.2.实验结果评价与分析........................................................... 89
4.参考文献....................................................................................... 89
B.6.皮肤致敏性测定.............................................................................. 92
1.方法............................................................................................... 92
1.1.引言...................................................................................... 92
1.2.定义...................................................................................... 93
1.3.参考物质.............................................................................. 94
1.4.测定方法原理....................................................................... 94
1.5.测定方法描述....................................................................... 95
2.实验数据(GPMT和BUEHLER测定)................................. 101
3.实验结果报告............................................................................. 101
4.参考文献..................................................................................... 103
B.7. 重复剂量 (28 天) 毒性(口饲)................................................... 105
1.方法............................................................................................. 105
1.1引言.................................................................................... 105
1.2定义.................................................................................... 105
1.3测定方法原理..................................................................... 105
1.4. 测定方法描述................................................................... 105
2. 实验数据................................................................................... 113
3. 实验结果报告........................................................................... 113
8
4.参考文献..................................................................................... 115
B.8. 重复剂量 (28 天) 毒性( 吸入)................................................. 116
1. 测定方法................................................................................... 116
1.1. 引言................................................................................ 116
1.2. 定义.............................................................................. 116
1.3. 参考物质....................................................................... 116
1.4. 测定方法原理............................................................... 116
1.5. 质量标准....................................................................... 117
1.6. 测定方法描述............................................................... 117
2. 实验数据................................................................................... 121
3. 实验结果报告........................................................................... 122
3.1. 测定结果报告................................................................... 122
3.2. 实验结果评价与分析....................................................... 123
4. 参考文献................................................................................... 124
B.9. 重复剂量 (28 天) 毒性(皮肤)................................................... 125
1. 方法........................................................................................... 125
1.1. 引言.................................................................................. 125
1.2. 定义.................................................................................. 125
1.3. 参考物质.......................................................................... 125
1.4. 测定方法原理................................................................... 125
1.5. 质量标准.......................................................................... 125
1.6. 测定方法的描述............................................................... 125
9
2.实验数据..................................................................................... 130
3实验结果报告............................................................................. 130
3.1. 实验结果报告................................................................... 130
3.2. 实验结果评价与分析....................................................... 131
4参考文献..................................................................................... 131
B.10. 诱变(性)-体外哺乳动物染色体变异测定............................ 132
1.方法............................................................................................. 132
1.1. 绪论.................................................................................. 132
1.2. 定义.................................................................................. 133
1.3.测定方法原理..................................................................... 134
1.4. 实验步骤.......................................................................... 134
2. 实验数据................................................................................... 141
2.1.结果的处理......................................................................... 141
2.2. 结果评估及解释............................................................... 141
3. 实验结果报告........................................................................... 142
4. 参考文献................................................................................... 145
B.11诱变(性)-体内哺乳动物骨髓染色体变异测定........................ 150
1. 方法......................................................................................... 150
1.1. 引言.................................................................................. 150
1.2. 定义.................................................................................. 151
1.3. 测定方法原理................................................................... 152
1.4. 测定方法的描述............................................................... 152
10
1.5. 测定步骤.......................................................................... 154
2. 实验数据................................................................................... 157
2.1. 结果处理.......................................................................... 157
2.2. 实验结果评价与分析....................................................... 158
3. 报告........................................................................................... 159
4. 参考文献................................................................................... 161
B.12. 诱变(性)-体外哺乳动物红血球测定...................................... 164
1. 方法........................................................................................... 164
1.1. 引言.................................................................................. 164
1.2. 定义.................................................................................. 165
1.3. 测定方法原理................................................................... 166
1.4. 测定方法的描述............................................................... 166
1.5. 实验步骤.......................................................................... 169
2. 数据........................................................................................... 172
2.1. 结果的处理....................................................................... 172
2.2. 实验结果评价与分析....................................................... 173
3. 实验结果报告........................................................................... 174
4. 参考文献................................................................................... 176
B.13 / 14. 诱变(性):利用细菌进行的回复突变测定.................... 180
1.方法............................................................................................. 180
1.1. 引言.................................................................................. 180
1.2. 定义.................................................................................. 181
11
1.3. 初始条件................................................................................ 181
1.4. 测定方法原理......................................................................... 182
1.5. 测定方法的描述............................................................... 183
2. 实验数据................................................................................... 191
2.1. 结果处理.......................................................................... 191
2.2. 实验结果评价与分析....................................................... 191
3. 实验结果报告........................................................................... 192
4. 参考文献................................................................................... 194
B.15.诱变性测定和致癌基因变异监测-啤酒酵母基因.................. 199
1.方法............................................................................................. 199
1.1.引言.................................................................................... 199
1.2.定义.................................................................................... 199
1.3.参考物质............................................................................ 199
1.4.测定方法原理..................................................................... 199
1.5.质量标准.................................................................................. 200
1.6.测定方法的描述....................................................................... 200
2. 实验数据................................................................................... 202
3.实验结果报告............................................................................. 202
3.1.检测报告............................................................................ 202
3.2.实验结果评价与分析......................................................... 203
4. 参考文献................................................................................... 203
B.16啤酒酵母作用下的染色体重组.................................................. 204
12
1.方法............................................................................................. 204
1.1.引言.................................................................................... 204
1.2.定义.................................................................................... 204
1.3.参考物质............................................................................ 204
1.4.测定方法原理..................................................................... 204
1.5.质量标准............................................................................ 205
1.6.测定方法描述..................................................................... 205
2.实验数据..................................................................................... 207
3.实验结果报告............................................................................. 208
3.1.测试报告............................................................................ 208
3.2.实验结果评价与分析......................................................... 208
4.参考文献..................................................................................... 208
B.17.诱变性—体外哺乳动物细胞的基因突变测定.......................... 209
1.方法............................................................................................. 209
1.1.引言.................................................................................... 209
1.2.定义.................................................................................... 210
1.3.测定方法原理..................................................................... 211
1.4. 测定方法描述................................................................... 212
2.实验数据..................................................................................... 217
2.1.实验结果处理..................................................................... 217
2.2.实验结果评价与分析......................................................... 218
3.实验结果报告............................................................................. 219
13
4.参考文献..................................................................................... 222
B.18. DNA的损坏和修复-DNA期(S期)外合成-体外哺乳动物细胞
.............................................................................................................. 227
1.方法............................................................................................. 227
1.1.前言.................................................................................... 227
1.2.定义.................................................................................... 227
1.3.参考物质............................................................................ 227
1.4.测定方法的原理................................................................. 227
1.5 质量标准........................................................................... 228
1.6 实验方法描述.................................................................... 228
2.实验数据..................................................................................... 231
2.1.放射自显影法测定............................................................. 231
2.2. LSC的测定....................................................................... 232
3. 实验结果报告........................................................................... 232
3.1.测定结果报告..................................................................... 232
3.2.实验结果的评价与分析..................................................... 233
4.参考文献..................................................................................... 233
B.19. 体外姊妹染色单体的交换测定................................................ 234
1.方法............................................................................................. 234
1.1 引言................................................................................. 234
1.2 定义................................................................................. 234
1.3.参考文献............................................................................ 234
14
1.4.测定方法原理..................................................................... 234
1.5.质量标准............................................................................ 235
1.6.测定方法描述..................................................................... 235
2. 数据........................................................................................... 238
3.实验结果报告............................................................................. 238
3.1. 测定结果报告................................................................... 238
3.2.实验结果的评价与分析..................................................... 239
4. 参考文献................................................................................... 239
B.20. 黑腹果蝇的伴性隐性致死测定................................................ 240
1. 方法........................................................................................... 240
1.1. 引言.................................................................................. 240
1.2. 定义.................................................................................. 240
1.3. 参照物.............................................................................. 240
1.4. 测试方法原理................................................................... 240
1.5. 定量.................................................................................. 241
1.6. 检测方法概述................................................................... 241
2.实验数据..................................................................................... 243
3.实验报告..................................................................................... 243
3.1. 检测报告.......................................................................... 243
3.2. 实验结果的评价与分析................................................... 244
4. 参考文献................................................................................... 244
B.21. 体外哺乳动物的细胞迁移测定................................................ 245
15
1. 方法........................................................................................... 245
1.1. 引言.................................................................................. 245
1.2. 定义.................................................................................. 245
1.3. 参照物.............................................................................. 245
1.4. 测试方法原理................................................................... 245
1.5. 质量标准.......................................................................... 246
1.6. 实验方法描述................................................................... 246
2.实验数据资料............................................................................. 248
3.实验报告..................................................................................... 248
3.1. 检测报告.......................................................................... 248
3.2. 实验结果的评价与分析................................................... 249
4. 参考文献................................................................................... 249
B.22. 啮齿动物显性致死基因测定.................................................... 250
1. 方法......................................................................................... 250
1.1. 引言.................................................................................. 250
1.2. 定义.................................................................................. 250
1.3. 参考物质.......................................................................... 250
1.4. 实验方法原理................................................................... 250
1.5. 质量评价标准................................................................... 251
1.6. 检测方法描述................................................................... 251
2. 实验数据资料........................................................................... 253
3. 实验报告................................................................................... 254
16
3.1. 检测报告.......................................................................... 254
3.2. 实验结果的评价与分析................................................... 255
4. 参考文献................................................................................... 255
B.23 哺乳动物精囊染色体畸变测定........................................... 256
1. 方法........................................................................................... 256
1.1 引言................................................................................... 256
1.2. 定义.................................................................................. 257
1.3. 检测方法原理................................................................... 258
1.4.检测方法概述..................................................................... 258
1.5.实验步骤............................................................................ 260
2. 实验数据................................................................................... 263
2.1. 结果处理.......................................................................... 263
2.2. 实验结果的评价与分析................................................... 264
3. 实验报告................................................................................... 265
4. 参考文献................................................................................... 267
B.24. 小鼠的现场测定........................................................................ 270
1.方法............................................................................................. 270
1.1. 引言.................................................................................. 270
1.2. 定义.................................................................................. 270
1.3. 参考物质.......................................................................... 270
1.4.测定方法原理..................................................................... 270
1.5. 质量标准.......................................................................... 271
17
1.6. 测定方法描述................................................................... 271
2. 实验数据................................................................................... 273
3. 实验结果报告........................................................................... 273
3.1. 测定结果报告................................................................... 273
3.2. 实验结果评价与分析....................................................... 274
4. 参考文献................................................................................... 274
B.25. 小鼠遗传性变异测定................................................................ 275
1.方法............................................................................................. 275
1.1. 引言.................................................................................. 275
1.2. 定义.................................................................................. 275
1.3. 参考物质.......................................................................... 275
1.4. 测定方法原理................................................................... 275
1.5. 质量标准.......................................................................... 276
1.6. 测定方法的描述............................................................... 276
2. 实验数据................................................................................... 279
3. 实验结果报告........................................................................... 280
3.1. 测定报告.......................................................................... 280
3.2. 实验结果的评价与分析................................................... 281
4. 参考文献................................................................................... 281
B.26. 啮齿动物重复口饲毒性物质90天的亚慢性毒性研究........... 282
1.方法............................................................................................. 282
1.1. 引言.................................................................................. 282
18
1.2. 定义.................................................................................. 282
1.3.测定方法原理..................................................................... 283
1.4.测定方法描述..................................................................... 283
1.5. 实验步骤.......................................................................... 286
2.实验数据和实验报告.................................................................. 291
2.1. 实验数据.......................................................................... 291
2.2. 实验报告.......................................................................... 291
3. 参考文献................................................................................... 293
B.27. 非啮齿动物重复口饲毒性物质90天的亚慢性毒性研究....... 295
1.方法:......................................................................................... 295
1.1引言.................................................................................... 295
1.2. 定义.................................................................................. 295
1.3. 测定方法原理................................................................... 296
1.4. 测定方法的描述............................................................... 296
1.5. 实验步骤.......................................................................... 297
2. 实验数据及实验结果报告........................................................ 303
2.1. 实验数据.......................................................................... 303
2.2. 测试报告.......................................................................... 304
B. 28啮齿类动物皮肤重复吸收毒性物质90天的亚慢性毒性研究307
1. 方法........................................................................................... 307
1.1. 引言.................................................................................. 307
1.2. 定义.................................................................................. 307
19
1.3. 参考物质.......................................................................... 307
1.4. 测试方法原理................................................................... 307
1.5. 质量标准.......................................................................... 307
1.6. 测试方法的描述............................................................... 307
2. 数据........................................................................................... 313
3. 报告........................................................................................... 314
3.1. 试验报告.......................................................................... 314
3.2. 实验结果的评价与分析................................................... 315
4. 参考........................................................................................... 315
B.29啮齿动物重复吸入毒性物质90天的亚慢性毒性研究............. 316
1.方法............................................................................................. 316
1.1. 引言.................................................................................. 316
1.2. 定义.................................................................................. 316
1.3. 参考物质.......................................................................... 316
1.4. 测定方法原理................................................................... 316
1.5. 质量标准.......................................................................... 316
1.6. 测定方法描述................................................................... 316
2.实验数据..................................................................................... 322
3.实验报告..................................................................................... 323
3.1. 测定结果报告................................................................... 323
3.2. 实验结果评价与分析....................................................... 325
4. 参考文献................................................................................... 325
20
B.30 慢性毒性测试.......................................................................... 326
1. 方法....................................................................................... 326
1.1. 引言.................................................................................. 326
1.2. 定义.................................................................................. 326
1.3. 参考物质.......................................................................... 326
1.4. 测试方法的原理............................................................... 326
1.5. 质量标准.......................................................................... 326
1.6. 测试方法描述................................................................... 326
2. 实验数据................................................................................... 335
3. 实验报告................................................................................... 335
3.1. 测试报告.......................................................................... 335
3.2. 实验结果的评价与分析................................................... 337
4. 参考文献................................................................................... 337
B.31致畸变性测定-啮齿动物和非啮齿动物.................................. 338
1.方法............................................................................................. 338
1.1. 引言.................................................................................. 338
1.2. 定义.................................................................................. 338
1.3. 参考物质.......................................................................... 338
1.4. 测定方法原理................................................................... 338
1.5. 质量标准.......................................................................... 338
1.6. 测试方法描述................................................................... 339
2. 实验数据................................................................................... 341
21
3. 实验报告................................................................................... 342
3.1. 测试结果报告................................................................... 342
3.2. 实验结果的评价与分析................................................... 343
4. 参考文献................................................................................... 343
B.32致癌性测定.................................................................................. 344
1.方法............................................................................................. 344
1.1. 引言.................................................................................. 344
1.2. 定义.................................................................................. 344
1.3. 参考物质.......................................................................... 344
1.4. 测定方法原理................................................................... 344
1.5. 质量标准.......................................................................... 344
1.6. 测定方法描述................................................................... 344
2. 实验数据................................................................................... 351
3. 实验结果报告........................................................................... 352
3.1. 测定结果报告................................................................... 352
3.2. 实验结果评价与分析....................................................... 353
4. 参考文献................................................................................... 353
B.33慢性毒性作用与致癌作用的综合检测...................................... 354
1. 方法........................................................................................... 354
1.1. 引言.................................................................................. 354
1.2. 定义.................................................................................. 354
1.3. 参考物质.......................................................................... 354
22
1.4. 测定方法原理................................................................... 354
1.5. 质量标准.......................................................................... 355
1.6. 测定方法描述................................................................... 355
2. 实验数据................................................................................... 364
3. 实验结果报告........................................................................... 364
3.1. 实验结果报告................................................................... 364
3.2. 实验结果评价与分析............................................................. 366
4. 参考文献............................................................................. 366
B.34. 繁殖一代毒性作用检测............................................................ 367
1.方法............................................................................................. 367
1.1. 引言.................................................................................. 367
1.2. 定义.................................................................................. 367
1.3. 参考物质.......................................................................... 367
1.4. 测定方法原理................................................................... 367
1.5. 质量标准.......................................................................... 368
1.6. 测定方法描述................................................................... 368
2. 实验数据................................................................................... 373
3.实验结果报告............................................................................. 373
3.1. 测定结果报告................................................................... 373
3.2. 实验结果评价与分析....................................................... 374
4. 参考文献................................................................................... 374
B.35. 繁殖二代毒性作用检测............................................................ 375
23
1.方法............................................................................................. 375
1.1. 引言.................................................................................. 375
1.2. 定义.................................................................................. 375
1.3. 参考物质.......................................................................... 375
1.4. 测定方法原理................................................................... 375
1.5. 质量标准.......................................................................... 376
1.6. 测定方法的描述............................................................... 376
2. 实验数据................................................................................... 381
3.实验结果报告............................................................................. 381
3.1. 测试报告.......................................................................... 381
3.2. 实验结果评价与分析....................................................... 382
4. 参考文献................................................................................... 382
B. 36. 毒物动力学............................................................................... 383
1.方法............................................................................................. 383
1.1. 引言.................................................................................. 383
1.2. 定义.................................................................................. 383
1.3. 参考物质.......................................................................... 383
1.4. 测定方法原理................................................................... 383
1.5. 质量标准.......................................................................... 383
1.6. 测定方法的描述............................................................... 384
2. 实验数据................................................................................... 387
3. 实验结果报告........................................................................... 388
24
3.1. 测试报告.......................................................................... 388
3.2. 实验结果评价与分析....................................................... 389
4. 参考文献................................................................................... 389
B.37. 急性接触有机磷物质的延迟性神经毒性................................ 390
1.方法............................................................................................. 390
1.1. 引言.................................................................................. 390
1.2. 定义.................................................................................. 390
1.3. 参考物质.......................................................................... 391
1.4. 测定方法原理................................................................... 391
1.5. 测定方法的描述............................................................... 391
2. 实验数据................................................................................... 396
3. 实验结果报告........................................................................... 396
3.1. 测定动物.......................................................................... 396
3.2. 实验条件.......................................................................... 397
3.3. 结果.................................................................................. 397
4. 参考文献................................................................................... 398
B.38 有机磷物质28天重复剂量的延迟性神经毒性....................... 399
1. 方法........................................................................................... 399
1.1. 引言.................................................................................. 399
1.2. 定义.................................................................................. 399
1.3. 测定方法原理................................................................... 400
1.4. 测定方法的描述............................................................... 400
25
2.实验数据..................................................................................... 404
3. 实验结果报告........................................................................... 405
3.1. 测试报告.......................................................................... 405
3.2. 实验条件.......................................................................... 405
3.3. 实验结果.......................................................................... 406
4. 参考文献................................................................................... 406
B.39. 体外哺乳动物肝脏细胞S期外DNA合成测定...................... 407
1.方法............................................................................................. 407
1.1. 引言.................................................................................. 407
1.2. 定义.................................................................................. 408
1.3. 测定方法原理................................................................... 408
1.4. 测定方法描述................................................................... 409
1.5. 实验步骤.......................................................................... 411
2. 实验数据................................................................................... 414
2.1. 处理和结果..................................................................... 414
2.2. 实验结果评价与分析....................................................... 414
3.实验结果报告............................................................................. 415
4. 参考文献................................................................................... 418
B.40皮肤腐蚀...................................................................................... 420
1.方法............................................................................................. 420
1.1.引言.................................................................................... 420
1.2 定义................................................................................... 420
26
1.3 参考物质........................................................................... 420
1.4 测定测定方法原理—大鼠三次皮肤测试分析................ 420
1.5. 测定测定方法的描述—大鼠皮肤三次测试分析............ 421
1.6. 测定方法原理 -人皮肤模拟分析.................................... 425
1.7. 测定方法的描述 -人皮肤模拟分析................................ 425
2. 实验数据................................................................................... 427
2.1. 结果的处理....................................................................... 427
2.2 实验结果评价与分析........................................................ 428
3. 实验结果报告........................................................................... 428
4. 参考文献................................................................................... 429
B.41. 光毒性-体外 3T3 NRU光毒性测定..................................... 434
1. 方法........................................................................................... 434
1.1. 引言.................................................................................. 434
1.2. 定义.................................................................................. 435
1.3. 参考物质.......................................................................... 437
1.4. 首先考虑.......................................................................... 437
1.5. 测定方法原理................................................................... 437
1.6. 质量标准.......................................................................... 438
1.7. 测定方法的描述............................................................... 439
2. 实验数据................................................................................... 446
2.1. 实验数据的质量和数量................................................... 446
2.2. 实验结果处理................................................................... 447
27
2.3. 实验结果的评估(预测模型)....................................... 447
2.4. 实验结果的分析............................................................... 449
3. 实验结果报告........................................................................... 450
3.1. 测定化学物质: ................................................................. 450
3.2. 溶剂: ................................................................................. 450
3.3. 细胞: ................................................................................. 450
3.4. 测定情况: ......................................................................... 451
3.5. 结果: ................................................................................. 452
3.6. 测定接受标准: ................................................................. 453
4. 参考文献................................................................................... 453
28
B部分:确定毒性及其他健康效应的化学方法
引言:B部分
B部份测定方法术语的一般定义
(i) 急性中毒是被测物在给予一定的剂量在一定的时间内 (通常14
天)发生有害作用.
(ii) 明显毒性是用来描述给予测定物一定剂量后发生明显的作用的
通用术语.这对危险评估应该是充分的,而且剂量的增加可使
被测物的征兆更加明显,还可能导致死亡率的上升.
(iii) 剂量是测定物质的数量.剂量被表示成重量(克或毫克) 或如测
定动物样品的每单位重量测定物质的重量(例如,每公斤身体重
量毫克), 或直接用浓度的大小来表示(每公斤食物的百万分之
一或毫克).
(iv) 识别剂量是不会引起与化合物相关的动物死亡( 包括人类的死
亡)的水平最高的固定的剂量的四分之一.
(v) 药量是一个一般的术语包含剂量,其频率和持续时间.
(vi) LD50(半数致死量) 是指统计上获得的,预计引起动物半数死亡
的单一剂量. LD50 值表达为每单位重量测定动物所含的测定
物质的重量术语 (毫克/千克).
(vii) LC50(半数致死浓度) 是指能引起一群受试对象50%个体死亡
29
所需的浓度. LC50 表示成每一标准的体积空气中测定物质的
重量 (毫克/千克).
(viii) NOAEL 是用最大试用剂量或最高暴露标准而没有观察到不利
作用的缩写.
(ix) 重复的剂量/亚慢性的毒性是指每天对动物使用一定剂量的药
品或在一段时间内对动物使用一定剂量的药品所产生的有害作
用.
(x) 最大耐药力剂量 (MTD) 是指某实验总体的一组受试动物中不
引起动物死亡的最大药物剂量.
(xi) 皮肤刺激是在使用测定物质以后皮肤产生激烈的变化 .
(xii) 眼睛刺激是在使用测定物质以后眼睛表面产生的变化.
(xiii) 皮肤过敏 (过敏性皮炎) 是皮肤对被测化学物质的反应.
(xiv) 皮肤腐蚀是皮肤在使用测定物质之后 3 分钟到 4个小时后不
能再生性还原损害的皮肤组织
(xv) 毒物动力学是对测定物质吸收,分布,新陈代谢和排泄的研究.
(xvi) 吸收是被测定的物质进入身体的过程 .
(xvii) 排泄是被测定的物质和/或它的新陈代谢产物从身体被排出的
过程.
(xviii) 分布是被测定的物质和/或它在身体里面的新陈代谢产物扩散.
30(xvv)代谢是被测定的物质由酶或非酶反应在身体中产生化学结构
和物理性质的变化过程.
B.1.急性-重复剂量 / 亚慢性及慢性毒性
使用多种多样的毒性测定方法(方法 B.1-B.5) 跟随单一剂量,对物质
的急性毒性对器官或全身毒性作用进行评估,可以对毒性进行大概的
指示.
对于物质的毒性,虽然在吸入研究中没有提及极限测定,但是可以考
虑极限测定方式或完整的 LD50测试,因为现今还不太可能对单一吸
入接触极限下定义.
我们应该考虑使用尽可能少的动物,并且把动物的痛苦减少到最小的
程度, 比如固定剂量的方法 (方法 B.1两步法) 和急性毒性级别法
(方法 B.1 三步法). 第二项研究可能弥补第一项研究得出的结论.
在这种情况下,可能会用一个标准的测定方法或一种对更少的动物采
取测定的方法.
重复剂量毒性测定 (方法 B.7 , B.8 和 B.9) 包括从重复的实验中
评估毒性作用.为了获得尽可能多的实验数据,强调对动物样品细心
的临床观察. 这些测定帮助识别毒性的目标器官和毒性剂量.另外,
在长期的科研中需要进行进一步的深入研究 (方法 B.26- B.30 和
B.33).
31
B.2诱变(性)-生殖毒性
诱变性指的是细胞或生物的遗传基因的材料结构或数量上可遗传的
突变的归纳方法.这些变化"突变"可能发生于单一基因或基因片段,
一组基因或者整个的染色体. 染色体变异可能是结构的或数量的变
化.
物质的致突变作用,在基本集信息中,通过细菌的基因(点)突变(方
法B.13/14)和哺乳动物样品的结构染色体细胞失常(方法B.10)的体
外分析进行评估.
在体内程序中也是如此,例如,微核测定 (方法 B.12) 或骨髓细胞分
裂中期分析,.(方法 B.11) 不管用任何办法, 体外方法是无任何禁忌
的首选.
附加的对诱变性深远的或现今对致癌性的研究调查是批量生产[或]
管理,进行一个危险评估的需要,这些可用于许多方面: 确定在基础模
型中获得的结果;在基础模型中没有涉及到的终点测试,在活体研究
中开始或扩充,开始和扩充在体内的研究.
为了这些目的,方法 B.15 到 B.25 既包括体内和体外真核细胞系统
又包括广泛的生物学终端测试. 这些测定提供比细菌模型更复杂的
关于点突变的信息和其它终点测试的信息.
作为基本原则, 考虑进一步研究诱变性的实验步骤 ,应该提供有关诱
导有机体突变的物质和/或物质的致癌潜在性的附加信息.
32
在实际研究中一种合适的详细的例证须依据诸多因素, 包括物质的
化学和物理特性, 开始的细菌和细胞学的化验,物质新陈代谢的简述,
其他的毒性研究结果和已知的物质的用途.选择固定的测定时间表对
于应当考虑到可能的各种因素是不恰当的.
一些测定方案总的原则是93/67/EEC制定的, 但是一些用于危险评估
的详细的测试方法可以在技术指导文件上查阅,它们是不固定的并且
可以根据具体的环境进行调整.
进一步的调查的方法列在下面, 以其遗传基因的终点测试为标准:
调查基因(点)突变的研究
(a)使用真核微生物(啤酒酵母)进行正向和反向突变的研究 (方法
B.15)
(b)体外研究哺乳动物细胞的正向突变,(方法 B.17)
(c) 黑腹果蝇的伴性-隐性致死测定,(方法 B.20)
(d)体内体细胞突变测定 , 小鼠现场测定,(方法 B.24)
染色体异常研究
(a)哺乳动物体内细胞遗传研究; 如果这些研究没有被包含在初始评
估中,体内骨髓细胞的分裂中期分析应该被考虑进去 (方法 B.11).
除此之外, 应该探索体内生殖细胞的细胞遗传性 (方法 B.23)
(b) 哺乳动物体外细胞增生研究,如果这没有被包含在最初的评估
中,(方法 B.10)
33
(c)啮齿类动物显性致死因子的研究,(方法 B.22)
(d)小鼠遗传性变异测定,(方法 B.25)
遗传性作用 - 对DNA 影响
遗传毒性, 确认为在遗传基因的材料上的有害作用未必与诱变性有
关, 因为其没有对 DNA 的伤害直接的证据. 以下使用真核微生物
或哺乳动物细胞的方法可适当地用于此项调查:
(a)啤酒酵母的有丝分裂的重组,(方法 B.16)
(b) DNA 损坏和修复- S期外DNA合成 - 哺乳动物细胞 -体外.(方
法 B.18)
(c) 哺乳动物样品细胞中姐妹染色体交换 -体外,(方法 B.19)
调查致癌潜在性的替代方法
哺乳动物细胞的变化分析对于测量物质在细胞培养时对它的形态和
行为的诱导是有用的,这和体内恶性肿瘤细胞的迁移有关(方法
B.21). 许多的不同细胞类型和标准可能在测试时被用到.
哺乳动物遗传效应的危险评估
许多基因(点)突变方法可以用来测量哺乳动物样品的遗传效应,例
如小鼠特性现场测定, 为了测量第一代生殖细胞突变,( 不包含在这
一个附属物中), 或为染色体变异,例如小鼠可遗传突变的测定,.(方法
B.25) 当估计一物质对人遗传基因的危害的时候 , 可以用这种方法.
然而,这些复杂性的测定及这些测定需要非常大量的动物,特别是实验
34
需特殊场所,故在实施这些研究时需要充分的论证.
B.3致癌物质
化学药品依据作用机制分,可以描述为神经毒性或非神经毒性致癌物
质.
现在关于神经毒性物质的致癌潜在性信息可能是从诱变性/神经毒性
研究获得.从重复的剂量实验,亚慢性的或慢性的毒性测定,重复的
剂量毒性测定中可获得附加的实验数据.
方法 B.7 和比较长的重复剂量研究包括在在重复的剂量毒性测定中
观察以评估生理的变化.例如某些组织的增生应该得到关注.这些研
究和毒物动力学实验数据可能帮助识别化学药品致癌潜在性, 这些
可能需要在致癌性测定 (方法 B.32) 或经常的慢性毒性/致癌性的综
合性研究中获得.(方法 B.33)
B.4生殖毒性
生殖毒性可以用不同的方法检测.例如男性和女性生殖功能的损害,
确认为'在生殖力方面的影响', 或归纳为后裔不可遗传的有害的作
用,分泌乳汁期间的致畸性和作用也被确认为"发展的毒性"'.
对致畸性的研究,作为正在发展的毒性测定的部份,测定方法(方法
B.31)主要通过口饲途径. 另外,其他的途径依靠测定物质的物理性
质以及人类接触途径. 在此种情况下,测定方法应该适合应用于 28
天的测定.第三代的生殖 (生殖力) 测定是需要的,二代的生殖的测定
35
描述方法 (方法 B.35),可延伸至第三代.
B.5. 神经毒性
神经毒性可以以不同的方式来检测,例如中枢或周围神经系统方面的
功能的变化和/或结构的生物化学变化.神经毒性的早期迹象可以从
急性毒性测定中获得.为了获得很多的实验数据,必须采用重复剂量
毒性测定方法 B.7, 包括神经毒性作用的评估 , 仔细的观察动物样
品的临床表现. 方法应该帮助识别有神经毒性化学药品,这可能需
要对这一个方面进行比较深入的调查. 此外,必须着重考虑物质的
潜在的引起特定的神经毒性作用,这些潜在的作用在其他的毒性研究
中不能被发现. 例如, 某有机磷物质可延缓神经毒性作用并且可以
在方法 B 37 和 B.38 中被评估.
B.6免疫毒性
免疫毒性可用多种方法检测,如免疫抑制剂法和/或超敏反应或应激
自动免疫增强信号法.重复剂量毒性测定,B.7方法,包括免疫毒性
因子的评估.该方法有助于识别潜在的免疫毒性化学物质,但有待于
进一步讨论.
B.7 毒性动力学
毒性动力学的研究有利于对毒性的阐述和评价.这些研究是为了通过
测定阐明化学药品毒物的特性以及对未来毒性研究带来帮助.
并不是在每一种情况下所有的参数都要被测定.只有在极少的情况
36
下,整个系统的毒性影响参数(吸收,排泄,分布和新陈代谢)才都
需要测定.对于某些特定的化合物来说,这一系列的因素的变化可以
是有帮助作用的或者某一特定单独计量研究可以是很充分的.(方法
B.36)
关于化学结构和物理化学性质的信息可以通过指定路线的药剂使用
方法和新陈代谢组织分布的可能性来提供关于吸收性质的说明.通过
先前有关毒性和毒性扩散的研究,也可以得到的有关毒性控制因素的
信息.
C.测定物质的性质
在任何毒性研究开始前,我们必须了解实验物质的组成.它包括主要
成分的不纯程度和包含稳定性在内的物理化学性质.
实验物质的物理化学性质为实验方法的选择,每个特定研究的设计和
实验物质的处理和储存提供了重要信息.
在开始实验前,我们要设计出实验物质在药剂介质和生物材料中定性
定量分析的方法.
所有有关论证,物理—化学性质,纯度和实验物质的行为的信息都应
在实验结果报告中给出.
D.动物样品的饲养
在毒性实验中,对饲养环境条件进行严格的控制和合适的饲养动物样
37
品的技术是必须的.
(i)饲养环境
在实验动物样品的笼子中,要提供适合该实验动物种类生存的环境条
件.对于大鼠,小鼠和天竺鼠而言,合适的条件为笼子温度为
22 ±3 ,℃℃相对湿度为30%~70%;对兔子而言,温度为20 ±3℃℃,相
对湿度为30%~70%.
有些技术对温度的作用特别敏感,在这种情况下,有关合适的测定条
件的细节会在实验方法的描绘中有所说明.在所有关于毒性作用的研
究中,温度和湿度的信息都应被监控,记录并写在最终的实验研究结
果报告中.
光照条件应被人工控制为12小时白天,12小时黑夜.光照类型的细
节应该记录并写在最终的研究实验结果报告中.
除非在实验方法中有特别的说明,动物一般可以分别饲养或把少量的
同性别的动物共同饲养;对于共同饲养来说每个笼子中的动物数量不
应超过5只.
在关于动物样品的实验结果报告中,在化学分析和任何结果观察阶
段,把关养类型和每个笼子中关养动物样品的数目交代清楚是很重要
的.
(ii)喂养条件
食物应该满足被实验的动物样品的所有的营养需求.当实验物质在食
38
物中给动物使用时,食物的营养价值可能因实验物质与食物成分的相
互作用而降低了其营养价值.在得出实验结果时,这种相互作用的可
能性应该被考虑.可以不断地提供饮用水来组成实验室的便利食品.
在用这种方法是用实验物质时,食物的选择可能为确定某种实验物质
的某种特定状态的需要而被影响.
已经确认能够产生毒性影响的食物污染物不应该作为干扰因素.
E.动物样品的保护
当设计实验方法时,我们必须考虑如何减轻动物痛苦的问题.下面将
给出一些例子,但并不全面.准确的说明或条件应该能在方法的全文
中找到:
- 对于急性口饲毒性实验,"固定剂量实验方法"和"急性中毒分级
方法"这两种方法应被考虑."固定剂量实验方法"并不利用死亡
作为终点,它使用的动物数量很少."急性中毒分级方法"使用的
动物样品的数量平均比B.1法少70%.这两种方法比传统的方法
能造成较少的痛苦.
- 使用的动物数量减少到科学上可以接受的最小的数目.对于方法
B.1和B.3来说,每个计量等级只测定同种性别的5只动物;对于
用天竺鼠(方法B.6)来做皮肤致敏的测定实验的最大化的方法,
也只有10只动物被使用(只有5只作为阴性对照组);当测定体
内的突变性时用作阳性控制组所需的动物量也减少了.(方法B.11
39
和方法B.12)
- 在实验过程中应该把动物样品的疼痛和痛苦减到最小;对非常痛
苦的动物应该采取人道主义的方法宰杀;在定量实验中由于腐蚀
或刺激导致显著疼痛的物质最好不要采用(方法B.1,方法B. 2
和方法B.3).
- 不仅在急性中毒实验(方法B.1,B.2和B.3),而且在体内的突变性
实验中,用无联系的高剂量进行测定都应当通过极限实验的说明
来避免.
- 当能够提供充足的科学证据时,对刺激测定的方案现在允许非行
动测定或减少到用单个动物个体的研究.
这些科学证据可以基于物质的物理化学性质,即其它有效实验的结
果,或是在体外实验中获得的良好结果上.例如, 一个皮试急性中毒
测定在限制性剂量水平下进行,并且没有观察到皮肤敏感度现象,就
不需要进行进一步测定了.在皮试过敏测定中确认有腐蚀性或导致严
重皮肤敏感度的物质(方法B4)不应进一步去做眼睛过敏的实验.
(方法B5)
F 其它测定方法
欧盟的一个科学目标是研究出一种有效的替代技术.它能像现有的动
物测定方法一样提供同水准的信息,却用很少的动物,引起较少的痛
苦甚至完全不用动物.
40
当这种技术变得可行时,就得考虑是否能用来划分物质的危险性及其
其带来的影响以及用做潜在危险的标识.
G 实验结果评价与分析
当实验结果评价与分析时,必须考虑测定结果可以在何种程度上推广
到人的情况.因此,在人身上的副作用,如果可能,就可作为测定结
果的确证.
用这些方法测定的结果可以用于分类,标识现有以及新的对人类的健
康有作用的化学药剂.对应的附件Ⅵ中分类与标识标准也和这些测定
方法中的测定原理根本上相似.
这些结果也可以用在风险评估性的测定中.对于新的和现有的化学药
剂,在相应的参考文献中应能找到合适的测定方案.
H.文献注释
这些方法绝大多数都是在为世界经济合作和发展组织项目框架下建
立起来的"实验指导"下发展起来的.为了确保实验数据的尽可能的
相互认可,使用这些方法时必须遵循"实验室良好行为规范"的原则.
其它的信息可以在经济合作和发展组织指导方针的注释里面以及相
关的文献中找到.
41
B.1两步法 急性毒性(口饲)-固定剂量方法
1. 方法
1.1. 引言
见总述B部分A.
1.2. 定义
见总述B部分B
1.3. 注释
无.
1.4. 测定方法的原理
急性毒性口饲方法能测定摄取一定剂量测定物质在短时间内的副作
用.
确定剂量方法分两个阶段进行.
在预备的测定阶段,强制性给同种同性动物样品口饲的不同剂量的作
用都顺序地调查记录下来.通过该阶段能得到剂量与毒性的关系,包
括估计的最小的致死剂量.一般情况下,所用动物样品的数量不超过
5只.
在主要的实验阶段,测定物质以预设剂量之一(5,50,500 或
2000mg/kg)分别口饲给5个雄性动物组和5个雌性动物组.根据预
42
备阶段的结果使用剂量并且要有利于在动物身上产生明显毒性却不
致死.
依据实验步骤,观察产生的作用.
当初始剂量水平能产生明显中毒,但无致死现象时,就不需要进一步
测定了.
当所使用的剂量未产生明显中毒,测定物质就需要使用更高的剂量重
新测定;相反,如果动物死亡或发生严重中毒以至需要人道宰杀动物
时,测定物质就需要使用更低的剂量重新测定.
此实验步骤允许"差别剂量"鉴定(见1.2.定义).这是不会引起死
亡(包含人道宰杀)的最高预定剂量.
如果动物表现的很悲伤或承受巨大的疼痛,就需要安乐死.由于腐蚀
和刺激的特性而能引起明显的疼痛的化学品,剂量测试因此无须被实
行.
1.5.质量标准
无
1.6.测定方法的描述
1.6.1.准备
1.6.1.1.实验的动物
如果没有特别说明,小白鼠是用来实验的最佳选择.
43
使用实验室普遍使用的种类.在实验的开始阶段,对不同性别,所使
用动物样品的体重范围应该不超过规定的体重的±20%.
在实验进行前,将动物在实验室里喂养至少五天.实验开始前将健康
的成年动物随机打乱,然后分成供观测实验和主要实验使用的一系列
的实验组.事实上,每种性别只有一组在主要实验中使用.
1.6.1.2.药剂的准备和使用
必要时,将实验物质溶解或悬浮在适当的媒介物中.最好在可能的情
况下首先考虑使用水溶液,接着考虑使用菜油溶液,然后考虑其他的
合适的溶液或悬浮液.对于非水溶液在实验前或实验同时应了解或测
定出它的毒性.对于鼠类动物,药剂的使用量不要超过10ml/kg(药
剂量/体重),水溶液也可用20ml/kg的使用量.实验中药剂的用量应
该尽可能的减少,通过调整溶度以保证其在所有药品的规定使用量
内.
在药品的使用前动物需要禁食.对于鼠类,喂的食物不能是隔夜的,
水的用量没有限制.第二天需要测量动物样品的体重,接着将实验的
物质配成单一剂量来使用.如果单一剂量很难达到作用,可以在不超
过24小时的时间内将药剂分成更小的份量来使用.在实验物质被使
用后的3-4小时后,可以不喂食.当被分成小份量的药剂在一段时间
内使用时,有必要依据这段时间的长短来给动物提供食物和水.
1.6.2.实验过程
1.6.2.1.观察实验
44
不同药剂的作用可以通过对一种的动物研究表现出来.由于雄性动物
样品的一般都比雌性动物更加敏感些,一般的,雌性动物被用在研究
动物对信息刺激的迟钝上.需要连续用药,每种动物至少需要用药
24个小时.仔细观察所有动物对毒物的反应至少七天;如果适度的
毒性反应持续了7天,那么这只动物需要继续再被观察7天.以下几
种级别的初始的药剂用量被考虑使用:5,50,500和2000mg/kg.如
果所选的一种初始用量没有导致强烈的药物反应而高一级的又导致
了死亡,那么可以选择一种或多种两等级之间的合适的量来进行研
究.在使用这种方法时有必要建立一些信息,关于何种等级的用量导
致对毒药的反应,以及最少的可以导致死亡的用量.
需要用一种方法通过相关化学物的证据来选择初始用量.如果缺乏这
样的信息,一般建议在第一例中使用500mg/kg的用量.如果初始用
量没有引起毒药反应,接着用更多的用量来实验.如果在2000mg/kg
都没有出现死亡率,观测实验就结束了,接着从这一用量开始进行主
要测定.如果反应很强,出于人道主义一般在初始用量(比如
500mg/kg)将其宰杀,接着将较低的用量(比如50mg/kg)用在下一只
动物身上.如果这只动物存活下来了,以后的动物可以用两种用量之
间的用量.一般在一次实验过程中,不使用超过5只的动物.
1.6.2.2.主要实验
每一级被用来研究的药剂的用量一般都用至少10只动物(5只雌的,
5只雄的)来实验.雌的必须没怀孕而且没生育过.
45
在进行主要实验时用适宜的用量作为原则.
禁止使用会使被测动物致死的剂量.
在测定中使用的药剂的量必须从四种规定药量的等级中选择,为5,
50,500或者2000mg/kg.选择的初始用量应该可以产生明显的毒药
反应但不能造成过高死亡率(包括人道的宰杀;意外死亡可以不包括
但必须记载下来).当该剂量既可以产生明显的毒物反应又不会造成
高死亡率,就可以不必做进一步的测定了.
当选择的药剂等级没有产生明显的毒性反应,该药剂不能再用高一级
的用量使用.可是动物应该继续被观察直到观察期结束.当剧烈的毒
性反应导致需要采取人道宰杀或者造成了高死亡率,该药剂可以在低
一级的用量中使用.同样,不需要人道宰杀的动物需要继续被观察直
到观察期满.
根据使用,需要有系统进行观察并记录下来.每个记录结果对应每个
动物.
观察期至少得14天.但是观察时间不能够硬性的规定.它应该根据
对毒药的反应,发作率以及痊愈时间进行考虑;有必要时可以延长.
毒性出现和消失的时间以及死亡的时间非常重要,尤其是有一个趋势
使得毒性信号被推迟.
在用药期间每天至少有2次仔细的临床检查,在用药后每天至少一
次.明显十分疼痛的动物或者表现得非常痛苦的动物要人为的宰杀.
如果给药后的几天里动物仍表现出毒性的反应,额外的观察则十分的
46
必要.如果表明开始的用量太高的话则测定应该结束.
观察的内容还包括皮肤,粘膜以及呼吸系统,循环系统,周围神经系
统和中枢神经系统,生理活动以及行为的变化.应该对颤栗,痉挛,
唾液分泌,腹泻,昏睡,麻痹和昏迷等现象尤其要关注.
在测定药物使用前的短时间内需对动物个体的体重进行测量,需要持
续几天或几星期每天测量.在实验中死亡的动物以及一直活到实验结
束的动物需要验尸或测体重.全部的病理的变化都需要纪录下来.如
果有指示,组织需要拿去做组织病理的测定.
在特殊情况下,根据先前的药剂用量,对第二第三的药剂用量的测定
也是需要的.
如果药剂在5mg/kg的体重的用量下也导致高死亡率(或者观测实验
表明在那种剂量下会导致高死亡率),那么这种具有急性中毒的物质
需要进一步的研究.
2.实验数据
从观测实验以及主要实验中得出的实验数据需要被总结在表格里,用
来表明在开始实验时每种等级药量所用的动物样品的数目;对毒性有
所表现的动物样品的数目;死亡的动物样品的数目,包括在实验过程
中死掉的和因人道主义而宰杀的;在主要实验中的对毒性作用的描述
和与混合物有关的毒性是否被观测到;毒性性物质作用的时间长短;
以及被发现尸体的量.存活超过一天体重的变化必须被计算和记录下
47来.
由于十分的痛苦而被人道的宰杀的动物需要被记录下来作为一种复
杂原因的死亡.
3.实验结果报告
3.1.测定结果报告
如果可能的话观测实验和主要测定的实验结果报告应当的包括以下
信息:
- 动物种类,品系,来源,环境条件,饮食等等.
- 测定条件
- 药剂用量[器具(如果使用)和浓度]
- 所有剂量的观测结果.
- 包含性别和剂量响应实验数据的表格(例如,所使用的动物样品
的数量;体重变化;可能的话,还包括在测定中自然死亡和人为
杀死的动物数量;有中毒迹象的动物数量;药物的特性,过敏性
和作用的持续性)
- 中毒反应的时间进程以及是否存在相反的情况
- 动物死亡或被宰杀的时间,以及使用药剂后动物存活的时间,还
包括人道宰杀的原因和标准.
- 验尸发现
48
- 组织病理上相关的发现
- 结果的讨论
- 测定结果的解释,包括确诊的中毒迹象和测定中药剂用量的关系.
3.2. 实验结果评估和解释
剂量
5mg/kg.b.w
50mg/kg.b.w
500mg/kg.b.w
2000mg/kg.b.w
结果
少于100%的存活率
100%存活率,但中毒明显
100%存活率,无明显中毒现象
少于100%的存活率
100%存活率,但中毒明显
100%存活率,无明显中毒现象
少于100%的存活率
100%存活率,但中毒明显
100%存活率,无明显中毒现象
少于100%的存活率
100%存活率,无明显中毒现象或
中毒明显
解释
剧毒物质
毒性物质
参照50mg/kg.剂量的解释
可能是毒性或剧毒.参照
5mg/kg.b.w
有害物质
参照500mg/kg.b.w
毒性或有害物质.参照
50mg/kg.b.w
无明显毒性物质
参照2000mg/kg.b.w
参照500mg/kg.b.w
无明显毒性物质
也可以参照总述Part B (D)
49
4. 注释
见总述PartB(E)
50
B.1 三步法 急性毒性 (口饲) -急性毒性等级方法
1. 方法
1.1. 引言
急性毒性分级方法给危险性评估和危险性分类提供信息.
基于研究的结果,这种方法使用三份固定的剂量使一个化合物被足够
地分开以至能够分类. 此外,在这一个测定方法中被描述的实验步
骤允许选择使用三个附加的固定剂量.它们可以也被当作假设结论的
选项,又可以用作更进一步的选项.在更进一步的改良值得去做或需
要去做的情况下,我们将考虑附加药剂的使用.
方法使用定义了初始剂量,但这并不意味着计算精确可达到 LD50.
相反,由于动物样品的死亡是整个实验的终点,当死亡可以预料时,
超出一定范围的剂量也是允许的. 实验的结果应该允许根据附件 Ⅵ
标准来分类.依据这种方法持续性,测定的时间可以比B.1中描述的
要长.这种方法的主要优点是,它所需的动物数量比急性毒性(口饲)
(B.1)和选择性固定剂量方法(B.1 两步法)要少.
也见一般引言 B部分 .
1.2. 定义
见一般引言B部份.
51
1.3. 测定方法原理
对一组实验动物通常使用一种改良了的剂量,使用渐进的实验步骤来
测定实验物质的性质.每一步使用同性别的三只动物.没有必要进行
实验前的光照研究.关系到动物死亡率的物质缺少或存在的剂量使用
取决于上一步的剂量,例如:
- 没有必要进行更深一步的测定
- 下一步,药剂的剂量没有改变,但被用于另一种性别的动物
- 下一步,将使用下一个更高或更低的剂量水平
1.4. 测定方法的描述
1.4.1. 准备阶段
随机选取健康年轻的动物,标上记号以示区别,为了让它们熟悉环境,
还得在测定前五天把它们关进笼子里.这些动物可以根据性别和剂量
水平进行划组归笼,但每个笼子里面动物不能太多以至干扰了对每个
个体的清晰观察.
测定物质以确定的剂量用胃管或插管强食地注入动物体内.
如果需要,测定物质要被溶解或悬浮在合适的媒介物质中.建议只要
可能的话,首先考虑用水,再考虑用油或其他媒介物.对于非水溶性
测定物,在测定前必须知道或确定媒介物的毒性.
动物在使用剂量前应该禁食;但水要保证供给.
52
1.4.2. 测定条件
1.4.2.1. 测定动物
除非有禁忌症,一般老鼠是常用的啮齿动物.雌性必须是未生育的和
没有怀孕的.
在研究的开始阶段,每种性别的体重差别不得超过平均水平的20%.
1.4.2.2.数量和性别
每一步骤用同性别的三只动物. 在开始,性别可以任选.
1.4.2.3.剂量水平
使用的初始剂量是从三个确定的水平里选择的,如25, 200 和
2000mg/kg .而且初始剂量应该有利于导致部分样品的死亡.在附件Ⅰ
里面描述的操作流程也可以依据初始剂量做相应的参考文献.
对于性别和初始剂量的选择,应该利用所有可用的信息,包括组织活
性相关的信息.当结果显示死亡并不是出现在最大使用剂量时,就应
该进行限制的测定.如果不了解被测定物质的情况,出于动物生存着
想,建议使用200 mg/kg的初始剂量.
有时,非常需要得到比确定剂量水平更高的精度,在这种情况下,就
需要考虑额外的剂量水平如5,50 或500 mg/kg等.
由于腐蚀性或严重的刺激性反应能引起明显的痛苦的剂量无需实施.
处理组之间的时间间隔在毒性迹象的初始,中期和最严重时分别测
53定.其他性别的动物或下个剂量的处理要延迟直到我们相信前一个剂
量下的动物能存活下来.
1.4.2.4.极限测定
在一个药剂等级中,两组异性动物(每组3只)需要消耗至少
2000mg/kg的试剂.若出现与化合物有关的死亡,则需考虑进一步消
耗200mg/kg的试剂来测定.
1.4.2.5.观察期
观察期需延续至少14天,除非动物已死或者需要中止研究并人道宰
杀.当然,其长度并非严格规定的,需就实验中毒发反应,开始毒发
的比率以及康复期的长度等具体情况作适当调整.毒发开始及结束,
出现死亡的时刻十分重要,特别是当中毒反应的出现有延迟的迹象
时.每一只动物样品的观察结果需独立地,系统地记录下来.
1.4.3. 实验步骤
在测定动物样品的禁食期过后称重,再使其与测定物质接触,接触过
后,3-4小时内动物不得进食进水.如果药剂是连续分批提供给动
物样品的,则视接触期的长度以供给动物食物.
一次提供给动物样品的液态药剂的最大量由动物样品的体格大小决
定.供给啮齿类动物,用量通常不超过1ml/100g;如果是含水的溶液,
则2ml/100g也可行.应通过调节药剂浓度来将所需药剂量的变化降
至最低,以保证所有药剂浓度等级的量恒定.若不能一次性提供给动
54
物以药剂,则可以分批供给,但供给期不得超过24个小时.
测定步骤的细节参看附录1.
1.4.3.1. 总体观察
与药剂接触的当天至少需要对测定动物进行两次详细地临床观察,在
动物有反应的当天需要进行更多次的临床观测,之后每天起码一次.
垂死的以及呈现出持续经历剧痛的动物需被人道无痛宰杀.人道宰杀
的动物也被视为测定致死.
当动物死亡或被人道宰杀时,应尽量准确地把时间记录下来.如果有
动物持续显示出中毒迹象,则需特别观察.观察应包括以下方面的变
化情况:皮肤及毛发,眼睛,黏液膜,呼吸系统,循环系统,自主系
统,中枢神经系统,肢体运动神经活动以及行为方式.特别需要对以
下几方面关注:呼吸行为,惊恐,抽筋,唾液分泌,下痢腹泻,无知
觉无感觉,睡眠和昏迷.
每一只动物样品的所有观察结果需独立地,系统地记录下来.
1.4.3.2. 体重
在与测定物质接触前,所有动物均需称重,测定开始后,每周也至少
称重一次.需计算和记录其体重变化情况.测定结束后,所有仍生还
的动物需先称重再人道宰杀.
1.4.3.3. 解剖
所有被测定的动物(包括在测定过程中死亡或被中止测定的)均需被
55
解剖.每只动物样品的肢体病理学变化均应记录下来.还应考虑对器
官进行显微镜检查所得到的肢体病变的信息(当动物存活了24小时
或更长时间).
2. 实验数据
应提供动物样品的独立实验数据.另外,每个测定小组都应以表格形
式对实验数据进行总结.表格应表明以下几个方面:测定所使用的测
定动物样品的数目,呈现中毒迹象的动物样品的数目,测定过程中死
亡或人为处死的动物样品的数目,每只动物样品的死亡时间,中毒迹
象出现以及消失的时间以及对此现象的描述以及解剖发现.
有关对实验结果进行评价讨论的指导参看附录 2.
3. 实验结果报告
实验结果报告
测定结果应包含以下几方面信息:
测定动物:
- 测定动物种类,来源;
- 测定动物样品的已知的微生物状况;
- 测定动物样品的数量,年龄及性别;
- 动物来源,饲养环境,饮食情况等;
56
- 每一只动物在以下几个时刻的体重:测定开始时,开始后每周以
及测定结束时.
测定条件:
- 如不用水,选用其他媒介物的理由;
- 向测定动物提供测定物质的细节,包括药剂的量以及接触时间;
- 供给的水与食物质量的详细情况,包括其来源和种类;
- 选择何种初始剂量的合理理由.
实验结果:
- 某一性别,药剂浓度等级的响应实验数据制成表格形式(即测定
动物所显示的中毒迹象,包括:死亡率,类型,程度及持续时间);
- 每只动物从开始呈现中毒迹象到恢复(如果有恢复)所经历的时
间过程;
- 每只动物样品的解剖结果以及任何组织病理学上的发现.
结果讨论
结论
4. 参考文献
此方法与OECD TG 423相类似.

57
附录1
检 测 步 骤
1. 按1.4.2.3.所示,起始剂量应在被测定动物之中造成一定的死亡
率.以下是一些用以选择起始剂量的凭据:
- 物理化学性质数据;
- 组织-行为关系;
- 其他毒性测定实验的实验数据;
- 对测定物质的前期使用情况.
2. 在此附录中,每一种起始剂量都有其独立的测试步骤,测试程序
随后给出.根据人道宰杀的动物样品或测试中死亡动物的数目依图表
箭头来选择测定步骤.
3. 当起始剂量为25或200mg/kg时,另一性别的动物死亡数目为一
只时,通常来说,不要进行进一步的测定.然而,如果从另外五只动
物身上无法观察到中毒现象,分析时应考虑到死亡数与施以药剂无
关;这样,则需提高药剂的浓度等级继续实验.
4. 当药剂量为2000mg/kg时两个性别各有一只动物死亡,做LC50
测定的结果应该会超过这个值.然而,由于这个结果是不定的,所以
需要仔细观察参考文献两性各剩余的两只动物样品的反应,这四只动
物样品的明显的中毒迹象的出现可以很好地导致符合LC50值
(2000mg/kg或更少)的种类的出现,并且为同浓度等级的药剂的进
58
一步的测定提供依据.
5. 这个过程允许检测以三种附加的固定剂量(选项2). 这种选项
要能够在特定的时候转为另一种可选择的操作, 或者能够用于在实
际测定结束以后的更进一步测定(选项1).选项1中,测定步骤用
粗箭头表示,而在选项2中,测定步骤用细箭头来表示.
59
附录2
有关选项1测定结果的说明
在此附录表中,"不要进一步测定"一格下的灰格表示分类的临界值.
依照选项1规定的实验步骤,顺着合适的箭头往下直到涉及的"灰格
子".
60
61
62
B.2.急性毒性测定(吸入药剂)
1. 测定方法
1.1. 引言
测定之前有必要掌握有关测定物质的以下几点预备知识:粒子大小分
布,蒸气压,熔点,沸点,闪点(闪燃点)和爆炸极限.
参看总引言部分B(A).
1.2. 定义
参看总引言部分B(B).
1.3. 参考物质
无.
1.4. 测定方法的原理
将若干组测定动物分别与不同浓度的测定物质相接触(被测定物质接
触)一定时间(一种浓度配一组动物)后,观察其产生的影响和死亡
现象,在实验过程中死亡的动物以及测定完结后仍然生还的动物均需
做尸体解剖.
那些呈现出持续经历剧痛的动物需被人道无痛宰杀;不要使用因含有
某些腐蚀性或强刺激性的成分而在某种程度上导致动物产生剧痛的
药剂测定物质.
63
1.5. 质量标准
无.
1.6. 实验方法的描述
1.6.1. 准备工作
测定之前,将年轻健康的待测定动物随机分配至各个实验小组,并将
其在待测定条件下饲养至少五天,在获得可以使用接触仪器的指令之
前,不得将其接触.
若测定物质为固态,则需将其弄碎至合适的微粒大小.
如有需要,可以在测定物质中添加合适的媒介物,以便配制在实验气
压环境下的所需浓度的测定物质,此时应使用一载体对照组.如果配
制药剂时使用了上述媒介物或者其他添加剂,必须确保其不会对测定
动物产生毒效应.需要时可参考文献上合适的历史实验数据.
1.6.2. 测定条件
1.6.2.1.测定动物
如无特别指示,一般用鼠类动物——且是实验室通用的种类——进行
测定.在测定之前,同性别的动物样品的体重变化范围不得超过实验
所要求的平均水平的20%.
1.6.2.2.数量及性别
每一级浓度需要至少10只测定动物(5雌5雄),雌性动物必须是无
64
身孕且未生产过的.
备注:在这个测定中,若使用较啮齿类动物高级的动物进行实验,则
需考虑减少测定动物数量.需谨慎挑选药剂,确保其不超过适度的毒
性,更不能使用致死剂量的测定物质.
1.6.2.3.接触浓度
需准备不同接触浓度的测定物质(起码有间隔合适的三组浓度),这
样才能呈现出由中毒到死亡的不同结果.还需要收集足够的实验数据
以绘制"浓度-死亡数目"曲线,并且在条件允许时用半数致死浓度
(LC50)进行测定.
1.6.2.4.极限测定
若此五雌五雄测定动物被接触于浓度为20mg/L的气体或浓度为
5rug/L的烟雾剂,或是微粒状物质中(或由于测定物质本身含有的某
些物理化学性质——甚至是爆炸性质——而导致的其仅能达到的最
大浓度中)4小时后,在14天内无复杂相关的死亡率,则无需进行
下一步测定.(18th ATP, dir. 93/21/EEC, Ll10/93)
1.6.2.5.接触时间
接触过程需4个小时.
1.6.2.6.实验仪器
测定动物样品的测定需在吸气装置中进行,此装置需能维持其中的气
流流动每小时至少12次,以确保仪器内有足够的氧气含量以及接触
65
气压的平衡分布.测定动物所处的吸气室需能将室内的拥挤程度降至
最低,并且将测定动物与测定物质的接触程度提至最高.就一般规律
来说,为了确保室内气压的稳定,测定动物样品的总体积不能超过吸
气室体积的5%.也可使用鼻-嘴,头或是整个身体的独立吸气室接
触,前两者相对于其他方式可有助于将对测定物质的吸收能力降至最
低.
1.6.2.7.观察期
观察期需延续至少14天.当然,其长度并非严格规定的,需就实验
中毒发反应,开始毒发的比率以及康复期的长度等具体情况作适当调
整.毒发开始及结束,出现死亡的时刻十分重要,特别是当死亡现象
的出现有延迟的迹象时.
1.6.3. 实验步骤
将测定动物称重,当指定仪器中的吸气室内的测定物质气压平衡之
后,将其放入接触4个小时.气压平衡时间需短,测定过程中温度控
制在22+3 C之间,理想湿度控制在30%-70%之间,但在某些条件
下(例如测定物质为某些烟雾剂时),此湿度无法保证.保持室内有
一微弱的反向压力(如5mm水)可避免测定物质向外界泄露.接触
期间不能让测定动物进食进水.接触过程中需使用合适的测定气压的
发生及追踪监测系统,此系统可保证实验过程中能最快地使接触环境
恢复稳定.吸气室在设计以操作时应确保其中的测定气压能够同样分
布.
66
应对以下各项进行测量或者追踪监测:
(a) 空气流动率(连续地).
(b) 测定物质的精确浓度——在呼吸区中测量,全接触过程中不少于
三次(某些气压,如高浓度下的烟雾剂的气压,需要更频繁的追
踪监测).接触过程中测定浓度的变化范围不得超过平均值的
15%;然而若使用某些烟雾剂时,浓度变化会超过这个范围,但
也是可以接受的.使用烟雾剂时,应经常对微粒进行分析(至少
每测定组一次).
(c) 温度及湿度,尽可能连续性测量.
在接触过程中以及接触过后,需有系统地进行观察并记录现象(从第
一日开始,每日多次观察),且每只测定动物均需独立的记录.每日
至少需要进行一次详细的临床检查和其他的观察,并采取某些合适的
措施以将测定动物样品的伤亡率降至最低,例如,将已死亡的测定动
物解剖或冷冻,并且将虚弱或垂死的测定动物隔离或人工宰杀.
对测定动物进行的观察应包括以下方面的变化情况:皮肤及毛发,眼
睛,拈液膜,呼吸系统,循环系统,自主系统,中枢神经系统,肢体
运动神经活动以及行为方式.特别需要对以下几方面关注:呼吸行为,
惊恐,抽筋,唾液分泌,下痢腹泻,无知觉无感觉,睡眠和昏迷.记
录死亡时间需越准确越好.接触过后测定动物每周需称重,死亡后也
要称重.
在测定过程中死亡以及测定结束后依然生还的测定动物需被解剖,届
67
时需特别注意其上呼吸道和下呼吸道的变化.
所有测定动物肉体上的明显的病理学变化都需记录下来.如有需要,
需采取其组织结构进行组织病理学检查.
2. 实验数据
每个测定小组需以表格形式对实验数据进行总结.表格应表明以下几
个方面:测定开始时测定动物数目,每只动物样品的死亡时间,呈现
其他中毒迹象的动物样品的数目,中毒反应的现象描述以及尸体解剖
发现.测定动物样品的体重变化应被记录下来.由于复杂相关的紧张
和痛苦而被人道无痛处死的动物应被记录为复杂相关的死亡.还应用
合适的方式进行半数致死浓度(LC50)分析.数值评估应包括以下几
个方面:测定动物样品的接触与所有异常现象发生率之间的关系,动
物行为与临床检查的异常现象,肉体损伤,体重变化,死亡率以及任
何其他的毒性效应.
3. 实验结果报告
3.1. 实验结果报告
如果可能,测定结果报告应包含以下几方面信息:
- 测定动物种类,来源,环境情况,饮食情况等;
- 测定条件:对接触仪器的描述
应包括其:设计,型号,尺寸大小,气体来源,烟雾剂的生产体系,
68
调节气体的方法,测定室内蓄养测定动物样品的方法等,以及对用以
测量温度,湿度,烟雾剂浓度和微粒分布的仪器的描述.
接触实验数据
接触实验数据应制成表格,显示其平均值和变化程度(如标准偏差),
并尽可能包含以下几点:
(a)吸气仪器内的气流变化率;
(b)气体的温度和湿度;
(c)理论浓度(由注入吸气室内的测定物质总量以及气体体积计算);
(d)如有使用媒介物,其性质;
(e)测定呼吸带内的实际浓度;
(f) 质量中质空气流动力学直径(MMAD)和几何偏差(GSD);
(g)平衡期;
(h)接触期;
- 性别,浓度等级的响应实验数据制成表格形式(即:测定过程中
死亡或人道宰杀的动物数目,显示中毒迹象的动物数目,与药剂
接触的动物样品的数目);
- 接触过程中或接触过后死亡数目,对测定动物人为处死的原因及
判断准则;
- 所有观察现象;
69
- 观察期后每只动物样品的LC50测定值;
- LC50测定值的95%的可信区间;
- "药剂-死亡率"曲线以及其斜率;
- 尸体解剖结果;
- 任何组织病理学上的发现;
- 结果讨论(特别需注意测定过程中被人为处死的动物对LC50值所
造成的影响);
- 关于结果的说明.
3.2. 结果评价及解析
参看总引言部分 B(D).
4. 参考文献
参看总引言部分B(E).
70
B.3. 急性毒性(皮肤)
1. 测定方法
1.1. 引言
参看总引言部分B(A).
1.2. 定义
参看总引言部分 B(B).
1.3. 参考物质
无.
1.4. 测定原理
将若干组不同浓度的测定物质与测定动物样品的皮肤相接触(一种浓
度配一组动物)后,观察其产生的影响和死亡现象,在实验过程中死
亡的动物以及测定完结后仍然生还的动物均需做尸体解剖.
那些呈现出持续经历剧痛的动物需被人道无痛处死;不应使用因含有
某些腐蚀性或强刺激性的成分而在某种程度上导致动物产生剧痛的
药剂测定物质.
1.5. 质量标准
无.
71
1.6. 实验方法描述
1.6.1. 准备工作
测定之前,将年轻健康的待测定动物随机分配至各个实验小组,并将
其在待测定条件下在笼中饲养至少五天.测定前24小时左右,为动
物肢体的主要部分褪毛(刮或剃),其面积不小于肢体面积的10%,
并小心不要伤及皮肤,否则会影响表皮的渗透性.若测定物质为固态,
则需将其适当弄碎至粉末状,并用水或者合适的媒介物充分湿润以确
保其能与动物表皮的充分接触;若使用媒介物,则需考虑其对测定物
质对表皮的穿透力的影响.液态的测定物质无需稀释.
1.6.2. 测定条件
1.6.2.1.测定动物
可用成年的鼠类或兔类进行实验,且是实验室通用的种类,其他动物
若符合要求也可使用.在测定之前,同性别的动物样品的体重变化范
围不得超过实验所要求的平均水平的±20%.
1.6.2.2.数量及性别
每一个浓度等级需要至少5只测定动物,且需同性,雌性动物必须是
无身孕且未生产过的.若有资料证实某一性别的动物格外敏感,则使
用此性别的动物.
备注:在这个测定中,若使用较啮齿类动物高级的动物进行实验,则
需考虑减少测定动物数量.需谨慎挑选药剂,确保其不超过适度的毒
72
性,更不能使用带致命性药剂的测定物质.
1.6.2.3.药剂标准
需准备不同浓度的测定物质(起码有间隔合适的三组浓度),这样才
能呈现出由中毒到死亡的不同结果.在决定药剂标准时需考虑其可能
带来的刺激性或腐蚀性的效应.还需要收集足够的实验数据以绘制
"浓度-死亡数目"曲线,并且在条件允许时用半数致死浓度(LC50)
进行测定.
1.6.2.4.极限测定
使用前面描述的测试程序,在至少2000mg/kg(剂量/体重)的剂量水
平下,在一组五雌五雄的动物中进行极限测定.若出现复杂相关死亡
率,则需考虑全面研究.
1.6.2.5.观察期
观察期需持续至少14天.当然,其长度并非严格规定的,需就实验
中毒发反应,开始毒发的比率以及康复期的长度等具体情况作适当调
整.毒发开始及结束,出现死亡的时刻十分重要,特别是当死亡现象
的出现有延迟的迹象时.
1.6.3. 实验步骤
每只动物均需要独立的笼子,且应以同样的部位去接触测定物质(接
触面积不得少与肢体总面积的10%,且测定物质在表皮上的附着应尽
量薄且均匀).若测定物质毒性较强,则需减小接触面积.
73
与动物表皮接触时,测定物质需置于一层无刺激性的,有渗透性的薄
纱带内,接触时间为24小时.测定位置应被完全覆盖,但要确保此
覆盖方式不会让动物咽下测定物质.必要时可以通过约束动物行动来
避免其咽下测定物质,但全程使用这种方法并不可取.
接触期过后,除去剩余的测定物质,并用水或其他适当方法将表皮清
洗干净.
从观察期的第一日起,需有系统地观察并记录现象(每日多次),且
每只测定动物均需独立的记录.每日至少需要进行一次详细的临床检
查和其他的观察,并采取某些合适的措施以将测定动物样品的伤亡率
降至最低,例如,将已死亡的测定动物解剖或冷冻,并且将虚弱或垂
死的测定动物隔离或人工宰杀.
对测定动物进行的观察应包括以下方面的变化情况:皮肤及毛发,眼
睛,粘液膜,呼吸系统,循环系统,自主系统,中枢神经系统,肢体
运动神经系统以及行为方式.特别需要对以下几方面关注:呼吸行为,
惊恐,抽筋,唾液分泌,下痢腹泻,无知觉无感觉,睡眠和昏迷.记
录死亡时间需越准确越好.在测定过程中死亡以及测定结束后依然生
还的测定动物需被解剖.所有测定动物肉体上的明显的病理学变化都
需记录下来.如有指示,需采取其组织结构进行组织病理学检查.
对异性动物样品的毒性反应的评估
对一种性别的动物样品的研究完成后,至少需要对一组异性动物(5
只)进行同样的测定,以证实此性别的动物对相同毒剂无更加急性反
74
应.在这种情况下,减少测定动物样品的数量也是可行的.当已有足
够的资料表明这一性别的动物对毒剂有较明显的敏感,则无需对另一
性别动物进行测定了.
2. 实验数据
每个测定小组需以表格形式对实验数据进行总结.表格应表明以下几
个方面:测定开始时测定动物数目,每只动物样品的死亡时间,呈现
其他中毒迹象的动物样品的数目,中毒反应的现象描述以及尸体解剖
发现.应记录每一只测定动物在以下几个时间的体重:开始与药剂接
触之前,此后每过一周以及死亡时,还有体重变化.由于复杂相关的
紧张和痛苦而被人道无痛宰杀的动物应被记录为复杂相关的死亡.还
应用合适的方式进行半数致死浓度(LC50)分析.
数值评估应包括以下几个方面:测定动物样品的接触与所有异常现象
发生率之间的关系,动物行为与临床检查的异常现象,肉体损伤,体
重变化,死亡率以及任何其他的毒效应.
3. 实验结果报告
3.1. 实验结果报告
如果可能,测定结果应包含以下几方面信息:
- 测定动物种类,来源,环境情况,饮食情况等;
- 测定条件(应包括:净化表皮的方法,薄纱带的类型——闭塞型
75
或非闭塞型);
- 药剂标准(如使用了媒介物,其浓度);
- 测定动物样品的性别;
- 某一性别,药剂浓度等级的响应实验数据制成表格形式(即:测
定过程中死亡或人道宰杀的动物数目,显示中毒迹象的动物数目,
与药剂接触的动物样品的数目);
- 与药剂接触过后的死亡数目,对测定动物人道宰杀的原因及判断
准则;
- 所有观察现象;
- LC50 对性别差异的值做各全面的研究, 用抽样检测法求出第14
天的值;
- LC50测定值的95%的可信区间;
- "药剂-死亡率"曲线以及其斜率;
- 尸体解剖结果;
- 任何组织病理学上的发现;
- 关于异性测定的结果;
- 结果讨论(特别需注意测定过程中被人道宰杀的动物对LC50值所
造成的影响);
- 关于结果的说明.
76
3.2. 结果评价及解析
参看总引言部分 B(D).
4. 参考文献
参看总引言部分 B(E).
77
B.4.急性毒性(皮肤刺激)
1.测定方法
1.1.引言
见描述部分B(A)
1.2.定义
见描述部分B(B)
1.3.参考物质
无.
1.4.测定方法原理
初步考虑
在可能产生严重反应的条件下,应仔细考虑物质所有可得的信息,以
使测定物的用量为最少.当考虑完整的实验,单体动物实验,是否进
行进一步实验时,以下信息是有用的.
1物理化学特性和化学反应.如果预期到有严重损伤,强酸或强碱物
质就不必测定,(例如pH小于2或大于11.5的物质).应考虑酸或碱
产生的作用.
2 如果有可信的证据表明在有效验证的体外测定中会产生严重的后
果,就不必进行完整的实验.
78
3 急性毒性研究的结果.如果皮肤急性毒性实验需要用的测定物超过
限定用量(2000毫克/千克体重)和没有观察到皮肤有发炎,不必进
行进一步的皮肤发炎实验.另外,不必对已知的对皮肤有剧毒的物质
进行测定.
将单一剂量测定物注入实验动物样品的皮肤,每一动物自我对测定物
产生抵抗.在特定的间隔观察和评定发炎的程度,进行进一步观察,
以作出对此反应的完整评定.观察时间应足够长,以使可消除的反应
能被完整观察到.
表现出强烈持久痛苦的动物应被人道宰杀.
1.5.质量标准
无.
1.6.测定方法描述
1.6.1.预备
实验24小时前,剪去或剃去动物背部的毛.
剪毛或剃毛的时候,应小心避免损伤皮肤.只有皮肤健康完整无损的
动物才可用于实验.
某些种类的兔子在某个季节会有明显的浓密的岛状毛.测定物不应注
入浓毛生长的地方.
当测定固体(需要的话碾碎)时,测定物应用水弄湿或如需要用合适
79
的介质使其更好地附着于皮肤上.当使用别的介质时,应考虑介质对
测定物引起的皮肤发炎的影响.液体测定物不必经过稀释便可使用.
1.6.2.实验条件
1.6.2.1.实验动物
尽管可使用多种哺乳动物,但白公兔是最佳选择.
1.6.2.2动物数量
如果根据屏蔽效应或其它因素估计物质会产生坏疽(即腐蚀),应考
虑做单体动物实验.如果结果表明实验不会产生腐蚀,应用至少2只
附加动物完成实验.
对于整个完整的实验,至少需要用3只健康公兔子.不必分隔未经过
处理的对比组动物.附加动物用于弄清不确定的反应.
1.6.2.3.试剂用量
如果没有特殊要求,应使用0.5毫升的液体测定物或0.5克的固体或
半固体测定物.每只动物未经处理的皮肤作为实验对比.
1.6.2.4观察期限
观察期限的长短不必严格限定.应有足够的时间进行完整观察可消除
的和不可消除的反应,但通常不会超过注射后的14天.
1.6.3.实验步骤
动物应被单独关入笼中.测定物应涂于小面积的皮肤(约6平方厘米)
80
而且使其在合适的无发炎处成为薄膜覆盖于表面.如果测定物是液体
或粘稠物,就要先使其成为薄膜状再涂于皮肤.在接触阶段,应用合
适的闭合或半闭合绑带将测定物松散地固定在皮肤上.应该避免动物
接触测定物和测定物的摄入,吸收.
在接触时期结束时,剩余的测定物应被擦净,使用适量的水或其他适
合的溶剂,避免引起已存的反应的变化和损害表皮的完整.
一般的接触时间是4小时.
如果预料测定物会产生坏疽(即产生腐蚀),那么应缩短接触的时间
(如1小时或30分钟).如果测定物产生的对皮肤的严重毒性不能被
排除,应使用单一动物作以下测定,将三份测定物同时涂于一只动物
上.3分钟后擦洗去第一份测定物.如果皮肤没有严重的反应,1小
时后擦洗去第二份测定物.如果在这期间的观察表明4小时的接触是
需要的和可受控制的,那么4小时后擦洗去第三份测定物,此时反应
升级.在这个情况下(即4小时的接触时间是需要的),要另外使用
至少2只动物完成实验,除非此实验是不人道的(例如在4小时的接
触时间内观察到坏疽的产生).
如果在1小时或3分钟内观察到严重的皮肤反应(例如坏疽),测定
应立即结束.
更长的接触时间应在特定的条件下(例如人的使用和接触的预期方
式)进行.
1.6.3.1.观察和评级
81
观察动物产生的红斑和浮肿,在洗去测定物的60分钟,24,48,72
小时后对动物产生的反应进行评级.根据表一记录和对动物皮肤发炎
评级.如果在72小时内可消除的反应未完全消除,则可适当延长观
察时间.除了观察发炎,还应详细记录任何严重的损害如腐蚀(表皮
的不可消除的损害)和其它毒性作用.
对折叠的皮肤使用一定的技术如组织病理学测定来查清被测定物污
染而产生的可疑的反应和结果.
2.实验数据
实验数据应以表格的形式列出,列出每一只动物在观察阶段发炎产生
红斑和浮肿的程度.记录所有严重的损伤,发炎性,可消除的反应或
被腐蚀的程度和特征,以及其它毒性反应.
3.实验结果报告
3.1.实验结果报告
可以的话,实验结果报告应包括以下内容:
- 动物种类,族系,来源,环境条件,食物等;
- 实验条件(包括有关的化学物质的物理化学特性,预处理和清洗
皮肤方法,绷带类型(半封闭或全封闭式));
- 列表记录每只动物在每个观察阶段(如洗去测定物的1,24,48,
72小时等)的炎症反应;
82
- 描述所有观察到的严重损伤,包括受腐蚀;
- 描述观察到的发炎程度和特征,所有组织病理学上的发现;
- 描述非皮肤发炎的所毒性性反应;
- 结果讨论;
- 结果说明;
3.2.实验结果评估和解释
见描述部分B(D).
4.参考文献
见描述部分B(E).
83
附录
表格:皮肤反应程度等级
红斑和焦痂的形成
无红斑 0
极小的红斑(几乎不可见) 1
明显红斑 2
一定量严重红斑 3
严重红斑(火红色)或焦痂(在深处)妨碍红斑的观察
浮肿物
无浮肿 0
极少浮肿(几乎不可见) 1
少量浮肿(浮肿边缘明显胀起) 2
一定量浮肿(边缘胀起约1毫米) 3
严重浮肿(胀起超过1毫米和延伸至接触部分之外) 4
84
B.5.急性毒性(眼部发炎)
1.测定方法
1.1.引言
见描述部分B(A).
1.2.定义
见描述部分B(B).
1.3.参考物质
无.
1.4.测定方法原理
最初考虑
在可能产生严重反应的情况下,仔细考虑任一物质的所有的可获得的
资料,以减少对此物质的测定步骤.以下信息将有助于这种考虑.
1 物理化学特性和化学反应性.如果预期到有严重损伤,强酸或强碱
物质就不必测定,例如对眼睛而言,pH小于2或大于11.5的物质.
应考虑酸或碱产生的作用.
2 来自有根据的选择性研究结果;有潜在腐蚀性或严重刺激性的物质
不能用于进一步的眼睛感染实验,估计在这个实验中,这样的物质会
使眼睛产生严重的反应.
85
3 皮肤发炎研究的结果.在皮肤发炎研究中被证明对皮肤有明显腐蚀
或刺激作用的物质不能用于眼睛感染的进一步实验,估计这样的物质
会对眼睛产生严重的后果.
将一份测定物涂于每一只实验动物样品的一只眼睛,另一只未处理的
眼睛用于提供核对信息.在特定的时间段评估和划分发炎的等级,同
时作进一步的描述完整评价所产生结果的.要有足够的观察时间完成
对可消除和不可消除反应的观察.
表现出强烈持久痛苦的动物应被人道宰杀.
1.5质量标准
无
1.6测定方法描述
1.6.1.预备
在测定开始24小时前检查每一只被选定做测定的实验性动物样品的
双眼.眼睛感染的,有缺陷的,或原有眼角膜损害的动物不能使用.
1.6.2.测定条件
1.6.2.1实验动物
尽管可以使用过多种实验性动物,但建议实验时使用健康的白公兔.
1.6.2.2动物数量
86
如果预期到会产生显著的作用,此单一动物实验需经慎重考虑.如果
用所述方法进行实验,其中一只兔子产生的反应表明测定物会引起严
重的发炎(可消除的)或腐蚀(不可消除的),对随后其他动物眼部
发炎的进一步测定就不必进行.特殊情况下,对附加的动物样品的进
一步测定会有利于特定方面的研究.
以防万一除了单一-动物测定之外,实验至少使用3只动物.附加的
动物可能要用于弄清不确定的结果.
1.6.2.3.试剂用量
测定的液体用量为0.1毫升.测定的固体,浆糊和微粒物质用量为0.1
立方厘米或约0.1克(使用量需记录).如果测定物质是固体或颗粒
状的,需将其碾碎成均匀粉末.将粉末轻轻压紧后测其体积,例如轻
拍测定容器.
因为测定物是装于喷雾器内,装入的液体应先喷出0.1毫升,再滴入
眼睛.
1.6.2.4.观察周期
观察周期的持续时间不应严格固定.应该要有足够的时间观察可消除
和不可消除的反应结果,但通常不超过注射后的21天.
1.6.3.实验步骤
动物应被单独关入笼中.轻轻拨开下眼皮,将测定物注入每只动物样
品的一只眼睛的结膜囊.然后轻轻合并眼帘约1秒钟以防注射液流
87
出.未经处理的另一只眼用做对比观察.
如果预期到注射物会引起较大痛感,可以在注入测定物前对动物进行
局部麻醉.局部麻醉剂的种类,浓度和使用时间需慎重考虑,以确保
不会因其使用而使测定物产生明显不同的实验结果.测定眼也应实行
局部麻醉.
注入测定物的24小时内不可清洗实验动物样品的眼睛.如果认为可
行,24小时后可对实验动物样品的眼睛进行清洗.
由于测定中的部分物质会产生刺激,需用兔子作附加实验,将测定物
注入兔子眼睛后立刻进行清洗并描述结果.在这个情况下,建议使用
3只兔子.注射半分钟后,清洗半分钟,使用的液体量和速度应不会
引起伤害.
1.6.3.1.观察和评级
在注射后1,24,48,72小时检查动物样品的眼睛.如果72小时后
动物眼睛并无任何受损,实验可结束.
如果有持久的眼部受损或其他眼部发炎,则要进行额外的观察来确定
受损的程度和其是可消除的还是不可消除的.对角膜,虹膜和眼球结
膜所观察到的任何受损应作记录和实验结果报告.眼部受损的等级应
在实验时作记录.(眼睛的反应等级受制于各种不同的解释.因此需
要使用眼睛受损程度的等级说明指南.)
使用显微镜,手提缝灯,活组织显微镜或其它合适的仪器有利于实验
88
结果的观察.记录了24小时的观察结果后,所有兔子的眼睛应用荧
光素辅助实验作进一步检查.
2.实验数据
实验数据应制成表格的方式,列出每一只动物在指定观察时间的眼睛
受损程度.描述受损的程度和特征,若出现严重的受损和除眼睛以外
的任何受损都应记录.
3实验结果报告
3.1测定结果报告
如果可能,测定结果报告应包括以下内容:
- 动物资料(种类,种属,来源,环境因素,食物,等);
- 测定条件(包括测定物质的有关物理化学特性);
- 用表格列出每只动物在每个观察时间(例如1,24,48,72小时)
时的受到发炎或腐蚀的反应实验数据.
- 描述任何观察到的严重损害.
- 叙述观察到的发炎或损害的程度和特征,包括受损眼角膜的面积
和恢复程度.
- 描述在1,24,48,72小时观察到的发炎程度的鉴定方法.(例如
手提长缝灯,活组织显微镜,荧光素);
89
- 描述任何没有明显的局部的眼部作用.
- 结果讨论.
- 结果说明.
3.2.实验结果评价与分析
见综述部分B(D).
4.参考文献
见综述部分B(E).
90
附录
视觉受损等级
眼角膜
不透明度:厚度(取最厚处的面积作观察)
无腐烂或不透明部分 0
不透明部分散乱分散(或略比正常光泽暗),虹膜细节清晰可见 1
半透明部分清晰可见,虹膜细节略模糊 2
受损部分如珍珠质状,虹膜细节不明,瞳孔大小几乎不可辨认 3
眼角膜不透明,虹膜变暗而不可辨 4
虹膜
正常 0
明显的深的折皱,充血,肿胀,中度角膜充血或其综合症状, 1
虹膜仍然对光有反应(包括迟缓的反应)
对光无反应,出血,全部受损(其中之一) 2
连接
发红(指相对被测定的眼而言眼帘和球状连接受损最严重的部分)
血管正常 0
部分血管明显充血 1
91
有散布的深红颜色,个别血管不可见 2
散布的红块 3
眼结膜水肿:眼帘或瞬膜
无肿胀 0
有不正常的肿胀(包括眼膜) 1
眼帘局部明显肿胀 2
眼帘肿胀而约半闭 3
眼帘肿胀,眼睛超过半闭 4
92
B.6.皮肤敏感度测定
1.测定方法
1.1.引言
注释:
在与大众健康相关的毒性分类系统中,找寻潜在的人类皮肤感光剂的
实验的灵敏度和能力是很重要的.
没有一种方法能对所有的对人类皮肤有潜在致敏性的物质或者所有
相关的物质都合适.
选择实验方法时,要考虑各种因素,例如测定物的物理特性,包括其
对皮肤的刺激性.
两种使用天竺鼠的实验正在发展:一种是佐剂类型,在完全佐剂
(FCA)下,强行消除或延缓测定物对过敏症状的作用;另一种是非佐
剂类型.
佐剂类型实验比其它不使用完全佐剂的实验更能准确预计人类皮肤
对物质作用作出的敏感反应.
天竺鼠极限化测试(GPMT)是辅助类型的实验.尽管还有其它一些实
验方法可以测定物质引起皮肤敏感反应的能力,GPMT仍是最可取的
辅助类型的方法.
关于物质化学特性的分类有多种,非佐剂类型(Buehler实验较佳)
93
被认为灵敏度较差.
在某些情况下,更适宜采取进行局部注射的Buchler实验,而不是使
用天竺鼠极限化皮肤注射的实验.当使用Buchler实验的时候,应给
出科学理由.
这个实验同时描述了GPMT方法和Buchler方法.只要可行和有科学
的根据,也可使用其它方法.
如果在一个公认的实验中观察到阳性现象,应指出测定物是潜在的感
光剂,同时不必做进一步的天竺鼠实验.然而,如果在实验中观察到
负反应现象,则要使用本实验所描述的方法进行天竺鼠实验.
见描述部分B.
1.2.定义
皮肤过敏:(过敏性皮肤炎)是皮肤对物质的免疫反应.对于人类来
说,这种反应可分为瘙痒,红斑,水肿,丘疹,小囊或这些症状的综
合.在其它物种中,反应现象可能不同,可能只有红斑和水肿.
接触感应:让实验动物接触一段时间,使其对测定物产生过敏性反应.
感应时间:接触感应后至少维持一星期,让过敏性症状形成.
接触质疑:让先前涂了诱导处理过的测定物的动物接触一段时间,以
确定此动物是否产生过敏性反应.
94
1.3.标准物质
每六个月,用已知的对皮肤有轻度到中度过敏刺激的物质测定实验技
术的灵敏度和可信度.
在准确进行的实验中,辅助类型的实验应有30%,非辅助类型的实
验应有15%的轻度到中度过敏反应现象.
建议使用以下物质.
CAS实验数据 EINECS 实验
数据
EINECS 名称 普通名称
101-86-0 202-983-3 α-己基肉桂醛 α-己基肉桂醛
149-30-4 205-736-8 2-巯基苯并噻唑
(快热粉)
kaptax
94-09-7 202-303-5 苯唑卡因 norcaine
在有合适理由的情况下,可以使用其它符合以上标准的物质.
1.4.测定方法原理
测定物通过皮内注射和/或表皮注射注入实验动物.注射一定刺激量
测定物后休息10到14天(诱导期),在这期间免疫反应渐形成.将
经过接触刺激的动物与注射了刺激性测定物而在诱导阶段未经处理
95
的对比动物样品的皮肤反应的范围和程度进行对比.
1.5.测定方法描述
如果测定物需要被清洗,应使用水或合适的溶剂,避免改变已有的反
应和损害表皮的完整性.
1.5.1. 天竺鼠极限化测试(GPMT)
1.5.1.1.预备
健康的年轻成年白公天竺鼠应至少在实验前5天开始适应实验室条
件.实验前将动物随机分成几组.根据实验使用方法,将动物样品的
毛剪去,剃去或可能的话用化学方法除去.小心避免损伤皮肤.实验
开始前和结束后将动物称重.
1.5.1.2.实验条件
1.5.1.2.1.实验动物
通常使用实验室饲养的白公天竺鼠.
1.5.1.2.2.数量和性别
可用雄性和/或雌性动物.如果使用雌性动物,其应是未生育和非怀
孕的.
实验组至少有10只动物,对比组至少包括5只动物.当使用少于20
只实验动物和10只对比动物和不能确定测定物是否一种感光剂时,
建议附加使用至少20只实验动物和10只对比动物实验.
96
1.5.1.2.3.试剂浓度
用于每个接触感应阶段的测定物的浓度应是能被组织忍受和引起轻
度到中度皮肤发炎的最大量.用于接触刺激阶段的浓度应是不引起发
炎反应的最大量.如果得不到其它信息,应用2到3只动物进行实验
性测定以确定最佳浓度.若使用FCA处理的动物应仔细考虑测定物
的浓度.
1.5.1.3.步骤
1.5.1.3.1.前言
第0天,实验组
在动物样品的两边肩膀皮内注射三种物质,每种0.1毫升,肩膀应脱
净毛,以使每种注射的物质位于身体中线对称的两边.
注射物1:FCA与水或生理盐水1:1(体积比)混合物.
注射物2:合适的状态和浓度的测定物.
注射物3:合适浓度的测定物与FCA/水或生理盐水的1:1(体积比)
混合物.
对于注射物3,水溶性物质应溶于水然后再与FCA混合.脂溶性或
非水溶性物质悬浮与FCA中与水相结合.测定物的最后浓度应与注
射物2中使用的相等.
注射物1和2注射在离头部最近处,彼此相邻,而注射物3注射在测
定部分的尾部.
97第0天,对比组
皮内注射三种物质,每种0.1毫升,注射在与实验组动物相同的部位.
注射物1:FCA与水或生理盐水1:1(体积比)混合物.
注射物2:未冲淡的媒介物
注射物3:50%的媒介物与FCA/水或生理盐水1:1的混合物.
第5-7天,实验组和对比组
如果测定物不是皮肤刺激性的,在局部诱导的约24小时前,剪去或
剃去毛的测定部分应用0.5毫升10%的用凡士林处理的硫酸钠,以使
其产生局部发炎.
第6-8天,实验组
除去实验部分的毛.将覆盖了最佳形态的测定物滤纸(2×4厘米)贴
于动物样品的实验部分,绑上绷带48小时.应选择合适的媒介物.
固体应先碾碎制成合适的形态.可能的话,不要稀释液体.
第6-8天,对比组
除去实验部分的毛.用同样的方法将赋形剂贴于动物实验部分,绑上
绷带48小时.
1.5.1.3.2.刺激
第20-22天,实验组和对比组
除去实验组和对比组动物侧腹上的毛.将测定物涂于动物样品的一边
98
侧腹,另一边侧腹涂媒介物.用绷带固定24小时.
观察和评级:实验组和对比组
- 在移去补丁约21小时后,如有必要需清洁挑战部位并仔细剪或刮
使脱毛.
- 再过大概3小时后,也就是离开始测定其应用性48小时左右,可观
察到皮肤反应,并根据附录中的程度等级做记录.
- 离这次观察约24小时后,再进行一次72小时观察和记录.
对测定组和对照组动物样品的盲读是被支持的.
如果有必要阐明第一次测定的结果,那么在上次测定的约一星期后就
要考虑又一次测定.下次测定也需用原来的对照组.
所有来源于实验进程的皮肤反应以及任何异常现象,包括全身反应都
要观察并根据Magnusson/Kligman(见附录)衡量等级记录下来.可
以进行其它过程如历史病理检查,皮肤折层厚度测量等,以此来阐明一
些可疑反应.
1.5.2. Buehler测定
1.5.2.1. 准备工作
在测定前让健康年轻的成年白化天竺鼠在实验室环境中至少适应5
天.并且这些动物事先随机分配到治疗组.根据实验方法的不同,选
择或剪或刮或用化学脱毛剂的手段来去除动物毛发,且要小心勿弄伤
皮肤.测定的开始和结束分别称下动物体重.
99
1.5.2.2. 测定情况
1.5.2.2.1. 测定动物
通常使用实验室品种的白化天竺鼠.
1.5.2.2.2. 数量和性别
雄性的或雌性的动物均可使用.如果使用雌性的动物必须是从未生育
过的或未怀孕的.实验组中最少要20只动物,对照组中至少要10只.
1.5.2.2.3. 剂量标准
用于每个引导接触的测定物质的浓度时能产生温和但不过度刺激的
最高量.而用于免疫性试验接触的浓度是不引起刺激的最高量.有必
要的话可用2,3个动物做个试点实验来得到合适的浓度.
对于水溶性的测定物质,水或稀释的无刺激性的界面活性剂溶液可用
作载体.对于其他测定物质,乙醇/水用于诱导阶段,丙酮用于免疫
性试验阶段.
1.5.2.3. 实验步骤
1.5.2.3.1. 诱导阶段
0天-实验组
清除一侧毛发(仔细修剪).实验补丁系统应准备好充足的已溶在合
适载体中的测定物质(必须证明载体选择的正确性;如果合适的话,
液态的测定物质无需稀释即可应用).
100
实验补丁系统应用于测定区域并且通过一个封闭的补丁或腔和一件
合适的敷料与皮肤保持6小时联系.
实验补丁系统必须是封闭的.一块可方可圆的棉衬垫正合适,但大小
需约4-6平方厘米.使用一个合适的束缚物来约束能确保封闭.如果
使用包装可能会造成额外的接触.
0天- 对照组
清除一侧毛发仔细修剪载体应用类似于上述测定组实验补丁系统应
用于测定区域并且通过一个封闭的补丁或腔和一件合适的敷料与皮
肤保持6小时联系.如果能证明不需要一个阴性对照组,可使用阳性
的对照组.
6-8天和13-15天-实验组和对照组
在第6-8天以及第13-15天在相同侧边的相同测定部位进行和0天一
样的操作(如有需要清除毛发).
1.5.2.3.2. 免疫试验阶段
27-29天-实验组和对照组
清除实验组和对照组动物先前没经处理的一侧毛发(仔细修剪).把
一个含有适量测定物质的密封的补丁或腔应用于实验组和对照组动
物原来没受处理的一侧,药物浓度是不引起刺激的最大量.
当相关时,一个含载体的封闭的补丁或腔也应用于实验组的对照组先
前没受处理的一侧.通过一件合适的敷料保持6小时接触.
101
1.5.2.3.3. 观察和评级
- 在移去补丁约21小时后,清理测定部位的毛发.
- 约3小时后(在应用实验补丁约30小时后),观察皮肤反应并根
据附录中的等级标准做记录.
- 在观察30小时后约24小时(在应用实验补丁约54小时后),再
次观察皮肤反应并记录.
对测定组和对照组动物样品的盲读是被支持的.
如果有必要阐明第一次测定的结果,那么在上次测定约一星期后就要
考虑再一次测定.下次测定也需用原来的对照组.
所有来源于实验进程的皮肤反应以及任何异常现象,包括全身反应都
要观察并根据Magnusson/Kligman(见附录)衡量等级记录下来.可
以进行其它过程如历史病理检查,皮肤折层厚度测量等,以此来阐明一
些可疑反应.
2.实验数据(GPMT和BUEHLER测定)
实验数据需归纳成表格形式,要表示出每次观察中每个动物样品的皮
肤反应.
3.实验结果报告
如果在天竺鼠测定前已进行过一次测定分析,那么关于测定的描述或
参考文献(如局部淋巴结测定(LLNA),鼠耳肿胀实验(MEST)),
102
包括过程细节需连同从测定或参考物质中获得的结果一并给出.
实验结果报告(GMPT和BUEHLER测定)
如果可能的话,实验结果报告要包含以下信息:
测定动物:
- 使用的天葵鼠的品种;
- 动物样品的数目,年龄以及性别 ;
- 来源,房间环境,食物等;
- 测定开始时每个动物样品的体重.
实验状况:
- 补丁固定技术;
- 使用的补丁材料及缝补技术的细节;
- 附带关于将用于实验中诱导阶段和免疫试验阶段的浓度结论
的试点研究的结果;
- 测定物质的准备,应用及清理细节;
- 对于载体选择的证明;
- 用于诱导接触及免疫试验接触阶段的载体和测定物质的浓度
以及用于与诱导阶段和免疫试验阶段的物质总量.
实验结果:
103
- 是对最近的敏感性和可靠性的核查结果的总结(见1.3),包
括了关于使用的物质,浓度和媒介的信息;
- 各个等级系统内的每个动物;
- 是对观察到的自然现象和程度现象的叙述性描述;
- 任何历史病理学的结果.
结果讨论.
结论.
4.参考文献
这种方法类似于OECD TG406.
104
表格:
对于挑战补丁测定反应评估的Magnusson/Kligman等级标准
0=无可见的变化
1=个别的或杂凑的红斑
2=中等程度的或融合性的红斑
3=严重程度的红斑及肿胀
105
B.7. 重复剂量 (28 天) 毒性(口饲)
1.测定方法
1.1引言
见引言B部分
1.2定义
1.3测定方法原理
测定物质以渐变的剂量每天给测定动物口饲,每组一个剂量标准共持
续28天.在喂食的这段时期内每天仔细观察动物有否中毒迹象.在
测定阶段中死去的动物要进行验尸,而测定结束后宰杀仍活着的动物
并进行解剖.
这种方法强调了作为一种独特端点的神经病学作用,而压制了对动物
进行仔细临床观察以此来获取足够多信息的需要.这种方法应确定化
学物质的神经毒素潜能,这能保证在这方面更深入的调查研究.另外,
这种方法可能给出有关免疫学作用和再生器官毒性迹象的暗示.
1.4. 测定方法描述
1.4.1.准备工作
随机分配年轻健康的动物到对照组和测定组.笼子的放置可能造成的
影响必须减至最小.要确认每个动物并在测定开始前将它们置于笼中
106
至少五天,以使之适应实验室环境.
测定物质或通过管饲法或经由食物或饮水喂食.口饲喂食方法取决于
研究目的和物质的物理,化学性质.
如有必要,测定物质要溶解在或悬浮于合适的溶剂.推荐一旦有可能,
首先考虑使用水溶液或悬浮液,其次是油溶液或乳状液(如谷油),
最后才是其他溶剂溶液.对于除水以外的其他溶剂必须知其毒性,测
定物质在溶剂中的稳定性也需探明.
1.4.2. 测定条件
1.4.2.1. 动物样品
倾向于使用啮齿目的鼠,尽管其他啮齿目动物也可使用.实验室通常
仍使用的品种是年轻健康的成年动物.雌性动物需是从未生育过的的
或未怀孕的.在动物断奶后尽可能早地开始给其喂食药剂并且无论如
何要在动物九周大以前开始.
在研究刚开始时,要减少使用的动物间体重的差异并且不超过每种性
别平均体重的±20%.
一旦重复口饲剂量研究作为一个初试到一个长期研究来进行,那么应
在这两个研究中使用来源于同一种源的合适动物.
1.4.2.2. 数量和性别
在每个剂量水平使用至少10只动物(5只雄的5只雌的).如果考虑
到中期的死亡,就必须在研究完成前在动物数量上增加预计要死掉的
107
个数.
另外,一个附属的10只动物组(每种性别各5只)可每天喂以最高
剂量水平的测定物质持续28天并在喂食结束后的14天中进行对恢复
性或毒效持续性或毒效滞后表现的观察.
1.4.2.3. 剂量水平
一般来说,至少使用三个测定组和一个对照组.除了不喂食测定物质
外,必须以对待测定组动物相同的方式来对待对照组动物.如使用某
种溶剂来喂食测定物质,则对照组动物需接受使用的最高剂量的溶
剂.
如果从其它实验数据的评估得知1000mg/kg bw/d的剂量不足以产生
任何作用的话,就可进行一个极限测定.如果无法得到任何合适的实
验数据,可进行一个范围结果研究以此来帮助选定将使用的剂量.
剂量水平的选择需考虑到任何存在的毒效以及可获得的有关测定物
质或相关物质的(毒药的)运动实验数据.最高的剂量水平是根据能
诱导毒性作用而不致死或重伤的目的来选择的.此后剂量水平的依次
递减应根据能验证任何有关剂量大小的反应以及在最低剂量水平不
应有任何可见的不好现象(NOAEL)这一原则来选择的.在设定递
减的剂量水平时,通常2-4个交叉区间是最理想的.而另外的第四个
测定组最好在相间的剂量水平间使用很大区间(如大于10的因子).
对于通过饮食或饮水喂食的情况来说,保证含有的测定物质不影响正
常营养或水平衡这一点是很重要的.当测定物质通过食物喂食时,不
108
管是基于动物体重的恒定的食物浓度(ppm)还是恒定的药剂量水平
都可采用;必须详细阐明在上述二个选择中选择使用的那种方案.对
于经由管饲法喂食的情况,必须每天以类似次数喂给药物并根据需要
调整以此来保证一个恒定的基于动物体重的药物剂量水平.
一旦重复的剂量研究被作为一个初试到一个长期研究来进行,在两次
研究中应使用类似食谱.
1.4.2.4. 极限测定
如果有一个通过食物或饮水喂食的测定,也使用了这个研究描述的过
程,其剂量水平是至少1000mg/kg体重/天或在饮食或饮水中占相等
的百分比(根据体重确定),而不产生任何可观察到的毒效并且如果
来自结构上相关物质的实验数据显示无法得到毒效,那么使用三个剂
量水平的全面研究可能不需要了.这个限制测定在除了从人类接触显
示应使用更高剂量水平的情况下应用.
1.4.2.5. 观察期
观察时期为28天.计划要进行追踪观察的附属组中的动物要持续至
少14天不喂食药剂,以此检查毒效的滞后反应现象或毒效的持续性
或恢复情况.
1.4.3. 测定步骤
在28天的时间内每周七天要天天喂食动物以测定物质.每周五天的
喂药法有待证明.当测定物质经有管饲法喂食时要使用一根胃管或合
109
适的插管把单一药剂喂给动物.一次喂给液体的最大量是由动物样品
的大小决定的.喂食量不能超过1ml/100g体重,除非在水溶液情况
下最多可超过2ml/100g体重.除了那些在更高浓度下会产生恶化作
用的刺激性或腐蚀性物质外,必须通过调整浓度来减少喂食量的不
同,以保证在所有剂量水平上恒定的量.
1.4.3.1. 综合观察
综合的临床观察每天必须进行至少一次,最好是每天相同时间,次数
并考虑在喂药后达到预期作用的顶峰时段进行.要记录下动物样品的
健康状况.每天至少两次观察所有动物以得到发病率和死亡率.一旦
发现濒死动物以及处于严重危险或病痛的动物,要移出去人道的宰杀
并验尸.
在第一次接触前对所有动物进行一次详细的临床观察并且在之后一
星期内也至少进行一次.这些观察需在笼子外的一个标准场地进行且
最好每次都在同一时间.要仔细做记录,最好使用由测定实验室清楚
定义的记录系统.努力确保减少测定环境的差异,并且最好由不知情
人士来进行观察.迹象记录包括了但不仅限于皮肤的,毛皮的,眼睛
的,粘膜的,分泌物的以及排泄和自发活动的变化(如眼泪分泌过度,
瞳孔大小,异常的呼吸方式).在步态,姿势,反应,以及抽筋或僵
硬动作(如过度增长,重复循环)或怪异行为(如自残,倒步走)的
表现上的变化也要记录下来.
在接触的第四周,要进行对不同类型刺激(如听觉的,视觉的,本体
110
感受的刺激)的感觉反应以及紧握力量和肌肉运动活性的评估.在文
献上给出了可执行过程的更多细节(见引言B部分).
当研究室作为由初试研究转向为后来的次长期(90天)研究来进行
时,就可以忽略在第四个接触周内进行的功能观察.在那种情况下功
能观察需包含在接下来的研究中.另一方面,从重复剂量测定的功能
观察中得到的实验数据可以增加随后次长期研究选择药剂量水平的
能力.
例外的,对于那些在其他方面显现出毒性迹象已达到明显妨碍功能测
定施行这一程度的组,功能观察也可忽略.
1.4.3.2. 体重和食物/水的消耗
所有的动物每星期必须称重一次.消耗的食物和水至少每周称量一
次.如果测定物质经由水喂食,每星期称量饮水至少一次.
1.4.3.3. 血液研究
接下来的血液测定需在测定的最后进行:血球密度,血球蛋白浓度状
态,红血球数量,全部的和不同的白血球数量,血小板数量以及凝血
时间的测量.
血样应从一个标记的位置采集,且是刚好在宰杀动物之前或作为宰杀
动物过程的一部分进行,并在合适的条件下储存血样.
1.4.3.4. 临床生物化学
为了研究在组织中的尤其是在肾和肝的主要毒性作用而进行的临床
111
生化探究需在这样获得的血样上进行:这些血样是刚好在宰杀动物之
前或作为宰杀动物过程的一部分采集的(除了那些濒死的和/或并发
死亡的).推荐在采血前对动物进行整夜禁食1.血浆或血清测定需包
括钠,钾,葡萄糖,全部胆固醇,尿素,肌酸酐,全部蛋白质,白蛋
白,以及至少两种与肝细胞作用有关的酶(如丙氨酸转氨酶,天门冬
氨酸转氨酶,碱性磷酸酶,γ-谷氨酸酶和山梨糖醇脱氢酶).额外的
酶(肝的或其他器官的)以及胆汁酸的测量在一定情况下能提供有用
信息.
接下来的尿检可随意在研究的最后一周内进行,使用定时收集的尿
液;外观,体积,特定重力,ph值,蛋白质,葡萄糖以及血液/血细
胞.
另外,要考虑用以探究广泛组织损伤的血清标记的研究.如果测定物
质的已知性质可能或猜想会影响到包括钙,磷酸盐,甘油三酸酯,特
定激素,以及乙酰碱酯酶在内的新陈代谢概况的话就要进行另一些研
究.对于处在特定种类或基础上的物质,上述这些都需要确认.
总的来说,有必要根据动物种类和由给定物质产生的被观察的和/或
期待的作用来制定一个弹性方案.
1对于许多在血清或血浆中的测量来说,最好是整夜禁食,这一点对于葡萄糖来说尤其显著.主要原因是由
于不进食产生的更多的变化会掩盖更多微妙细小的现象并造成解释上的困难.另一方面,整夜禁食可能会
妨碍动物一般的新陈代谢以及影响每日在测定物质中的接触,尤其在喂食研究中.如果采用整夜禁食方案,
临床生化研究就应在研究第四周的功能观察后进行.
112
如果前期的基础实验数据不够充足,要在开始之前就要考虑由血液学
的临床生化学的变异得出的结论.
1.4.3.5. 身体解剖
研究中所用的所有动物都要接受一次完整仔细的包括了体表所有通
气口以及头盖骨的,胸部的和腹部的空腔及其内容物的检查的身体解
剖.所有动物样品的肝脏,肾脏,肾上腺体,睾丸,附睾,胸腺,脾
脏,脑部以及心脏需整理成任何相连的合适的组织.并且在切割下来
后要尽可能早地称量它们的湿重以防止变干.
以下组织需保存在对于组织类型以及打算接下来进行的历史病理学
检查来说都是最合适的固定环境中:脑部(包括大脑,小脑以及连接
部分区域)脊髓,胃,小肠和大肠(包括派尔集合淋巴结),肝,肾,
肾上腺,脾脏,心脏,胸腺,甲状腺,气管,肺(用固定剂填充并浸
没保存),性腺,附属性器官(如子宫,前列腺),泌尿膀胱,淋巴结
(最好是一个覆盖了服药路经的淋巴结和另一个远离服药路经来覆
盖系统作用的淋巴结),末梢神经(髋部的或胫骨的)最好临近肌肉
以及一段骨髓(或者二者选其一地,一段新鲜骨髓抽取).临床的及
其他结果可能暗示检查额外组织的必要性.同样,任何根据已知测定
物质性质被认为有可能成为目标器官的器官也要保存.
1.4.3.6. 组织病理学检查
必须对所有对照组和高剂量组的动物样品的保存器官做全面的组织
病理学检查.如果在高剂量组中观察到与喂药有关的变化,这些检查
113
就要扩展到所有其他剂量组的动物.
检查所有组织损伤器官.
当使用一个附属组时需像对待测定组那样对其组织和器官进行组织
病理学检查.
2. 实验数据
需提供个体实验数据.另外所有实验数据需总结成表格形式,内容包
括每个测定组在测定开始时的动物数量,测定期间自然死亡或因人为
因素杀死的动物数量和死亡时间,表现出中毒迹象的动物数目,对观
察到的包括开始时间,持续时间以及中毒作用的严重程度的中毒迹象
的描述,有器官损坏现象的动物数量,损伤类型和显示每种损伤类型
现象的动物所占百分数.
如有可能,数字结果应按照一种合适的且被广泛接受的统计方法进行
评算.应在测定设计阶段选择统计方法.
3. 实验结果报告
实验结果报告
如果可能,实验结果报告应该包含下列信息:
实验动物:
- 动物的种/属;
- 动物样品的数量,年龄和性别;
114
- 来源,饲养环境和食物等;
- 在测定开始时以及此后的每周,直至测定结束时动物个体的
重量.
测定条件:
- 如果溶剂不是水,合理的选择介质.
- 剂量水平选择的理论依据.
- 有关测定物质的组成/食物配置品的细节,包括配置品达到的
浓度,稳定性和均匀性.
- 对测定物质管理的细节.
- 如果可行,要求从食物/饮用水中测定物质的浓度(ppm)到
实际剂量(mg/kg体重/天).
- 食物和水质的细节.
结果:
- 体重/体重变化.
- 食物消耗,水消耗.(如能得到)
- 依照性别和剂量水平的毒效应实验数据,包括毒性表现.
- 自然,严谨和持续性的临床观察结果(不管是否能被反复)
- 感觉活动,控制能力和肌肉运动的评估.
115
- 相关基础水平下的血液学测定.
- 相关基础水平下的临床生化测定.
- 死亡时的体重和器官重量实验数据.
- 验尸结果.
- 组织病理学结果的详细描述.
- 吸收实验数据.(如果可测)
- 对结果适当的统计处理.
对结果的讨论.
结论.
4.参考文献
方法类似于 OECD TG 407.
116
B.8. 重复剂量 (28 天) 毒性( 吸入)
1. 测定方法
1.1. 引言
预先了解有关该物质颗粒大小分布,蒸汽压力,溶点,沸点,燃点和
爆炸性(如果存在)的信息是有益的.
请同时看引言部分B(A).
1.2. 定义
见引言部分B(B).
1.3. 参考物质
无.
1.4. 测定方法原则
动物样品的若干组每天被定时的接触在某个级别浓度的测定物质中,
每种浓度对应一组,如此持续28天时间.当一种溶剂被用来产生测
定物质在空气中的一个合适浓度时,一个溶剂对照组就会被用到.测
定期间每天要观察动物样品的中毒现象.实验中死亡的动物要被解
剖,而且在测定结束时,存活的动物也要被解剖.
117
1.5. 质量标准
无.
1.6. 测定方法描述
1.6.1 准备工作
至少在测定前五天,动物就要被养在实验室以及相应的饲养环境中.
在测定前,健康的年轻动物被作上标记并随即分散到各组中.如果必
要,一种合适的溶剂可以被加入到测定物质中来帮助产生该物质在空
气中的一个合适浓度,如果一种溶剂或其他添加剂被用来改善剂量,
它必须被确认不产生中毒效应.如果合适,历史实验数据也可被使用.
1.6.2. 测定状况
1.6.2.1. 动物样品
除非有抵抗现象,否则白鼠是合适的种群.通常被使用的实验室品种
中的年轻健康的.
在研究开始时,动物体重差异的范围不能超过合适平均值的±20%.
1.6.2.2. 数量和性别
至少每个测定组中要有10个动物(5只雄性和5只雌性).雌性动物
应当从未生殖过且未怀孕.如果计划中有临时的宰杀,那么数量应当
增加以满足计划中测定结束前要死亡的量.另外,一个有10只动物
(每个性别5只)组成的附属组可以被用来测定28天高浓度水平,
118
并且为了14天的后处理要观察毒效应的可恢复性,顽固性或滞后表
现.一个有10只对照组动物(每个性别5只)组成的附属组也应当
被使用.
1.6.2.3. 接触浓度
至少需要三种浓度以及一个参比或一个溶剂参比(相应于最高水平的
溶剂浓度),如果使用溶剂的话.除了不使用测定物质外,需以对待
测定组动物样品的方式同样对待对照组动物.最高浓度应产生中毒作
用但不导致或几乎不导致死亡.最低浓度应不产生任何中毒迹象.如
果有对人类接触的可用估计值,最低浓度应超过这个估计值.理想的
中间浓度应产生最小的可观察到的中毒作用.在低,中浓度组及对照
组中,死亡率必须足够低,以此才有可能得到一份有意义的结果评估.
1.6.2.4. 接触时间
每日接触应持续6个小时,但其他时间可根据满足特定要求而定.
1.6.2.5. 装置
动物应在一个被设计成能维持每小时至少12次空气变化的动态气流
以保证充足的氧气的含量以及平均分布的接触空气的吸入设备中进
行测定.当使用一个室时,他的设计应是动物样品减少拥挤状况并增
加它们通过吸入测定物质的接触程度.作为一个确保室内空气稳定性
的通用规则,动物样品所占"体积"不得超过室内体积的5%.可使
用鼻的,仅头部的或个体的整个身体的接触,前两方案将减少通过其
他途径吸入的量.
119
1.6.2.6. 观察期
在整个喂药及康复期间要每天观察动物样品的中毒迹象.动物死亡时
间以及中毒迹象的出现时间和消失时间都要记录下来.
1.6.3. 测定步骤
在28天实验周期中,动物要每周5-7天全天接触测定物质.计划用
于追踪观察的附属组动物需持续14天断药,用以查明中毒后的康复
或毒效的持续性.实验温度需保持在22±3℃.
理想的相对湿度需保持在30%-70%,但在某些情况下(如喷雾剂测
定),上述条件可能不可行,在室内保持一个微小的负压(≤5mm水
压)能防止测定物质泄漏到周围地区.进行接触时禁止供应水和食物.
应使用一个带有合适的分析集中控制系统的动态吸入药剂系统.为了
确定合适的接触浓度,推荐进行尝试测定.气流需调节到能保证在接
触室内的环境条件是处处相同的.上述系统应保证尽快达到稳定的接
触环境.
以下需进行测量或监控:
(a) 气流流速(连续地)
(b) 在呼吸区域测量测定物质的实际浓度.在每日接触期内,浓度
的波动范围不能超过平均值的±15%.但对于某些气雾剂而言,
不能达到上述层次的控制范围,一个更宽的波动范围时刻可以
接受的.在研究的整个持续期内,每日的浓度应在可行的情况
120
下尽量保持恒定.对于气雾剂来说,每个测定组每周需进行至
少一次的粒子大小分析.
(c) 温度和湿度,如有可能连续测量
接触期间及以后都要进行系统观察和记录;每个动物都要有个体记
录.每天观察所有动物并且要记录下包括发作开始时间,程度及持续
时间在内的中毒迹象.观察需包括以下内容:皮肤,毛皮和眼睛的变
化,粘膜,呼吸,循环,周围以及中枢神经系统活动以及行为类型.
每周称量动物体重.同时也推荐每周称量饮食.对动物样品的定期观
察是有必要的,它能保证不因同类相残,组织自溶或误放等原因而在
研究中失去动物.在研究周期间的最后阶段,所有不在附属组的测定
组幸存动物都要进行解剖验尸.一旦发现濒死的动物以及处于严重危
险和病痛的动物都要将其移走,人道宰杀并验尸.
测定最后,包括对照组在内的所有动物都要进行以下检查:
(i) 血液病理学,至少包括血球容积测定,血红蛋白集中,红血球
数目统计,白血球总数及类别统计和潜在的血液凝块估计;
(ii) 临床的血液生物化学至少包括肝脏和肾的一个功能参数:血清
中丙氨酸转氨酶(即以前所熟知的谷氨酰丙酮酸转氨酶)的量;
血清中天冬氨酰苯丙氨酸转氨酶(即以前所熟知的谷氨酰丁酮
二酸转氨酶)的量;尿素中氮的含量;血液中白蛋白的量;血
液中肌氨酸的量;胆红素总量及血清中的蛋白质总量.
其他的一些参数包括钙,磷,氯化物,钠,钾的含量; 快速的脂质
121
葡萄糖分析,荷尔蒙测定;酸碱平衡;甲基球蛋白和胆碱酯酶的活动,
对于某些毒性评估是必须的.
在合适的地方,附加的临床生物化学方法测定可以被利用,以便于扩
大对已观察到的毒效的研究.
1.6.3.1. 全面的验尸
被研究的动物应该满足于尸体完整性条件, 至少肝脏,肾,副肾,
肺和睾丸应该在解剖之后尽快地秤重,避免干枯.器官和组织(呼吸
道,肝脏,肾,脾脏,睾丸,肾上腺,心脏以及任何能表现出明显的
损伤和体积变化的器官)应该被保存在合适的媒介中以待以后的组织
病理学测定.肺应该被完好无损的被切割,称重并用合适的方法固定
以确保其结构的完整.
1.6.3.2.组织病理学测定
在高度集中和对照组中,组织病理学测定应该在被保存的组织与器官
上进行. 由于测定药物的高剂量表现出缺陷的组织与器官,应该进
行低药剂测定.在对其它附属小组的动物进行组织测定时,应该对那
些在已处理的小组中,已确定表现出药效的器官与组织,给予特别的
关注.
2. 实验数据
实验数据以表格的形式总结,要显示出测定之初动物样品的总数以及
用于研究各种损伤的动物总数.
122
全部观察结果应该用一个合适的统计方法评估..任何已知的统计方
法均可被利用.
3. 实验结果报告
3.1. 测定结果报告
如果可能的话,测定结果报告将包括下列各项信息:
- 所用动物样品的种类,种属,来源,环境情况,饮食及其它;
- 测定条件;
暴漏装置的描述包括设计,类型,尺寸,空气的来源,喷雾剂发生系
统,空气调节方法,排空手段,如果动物在测定室住宿,还应记录其
住宿方法.用于测量温度,湿度的仪器,在合适的地方,喷雾剂的综
合稳定性或微粒的体积分布应该被描述.
实验数据的发布:
这些实验数据应该与其平均值和其相对于真实值的变化一起作成表
呈现出来(例如标准偏差),并且如果可能的话,应包括:
a) 通过吸入装置的气流速度;
b) 空气的温度和湿度;
c) 额定的浓度(按气体组成划分的吸入仪器摄入的测定物总量);
d) 如果使用媒介物,还应记明其性质;
123
e) 在测定呼吸区域的实际浓度;
f) 质量中质空气流动力学直径 (MMAD) 和几何学的标准偏差
(GSD);
–按照性别和浓度划分的毒性响应实验数据;
–研究中动物样品的死亡时间及是否有动物一直存活到最后;
- 毒性或其它反应描述;无效水平;
–观测到每个反常现象的时间及其接下来的变化过程;
–食物和身体- 重量实验数据;
– 所选用的血液病理学测定方法及其结果;
- 所选用的临床的生物化学测定方法及其结果;
–验尸结果;
–组织病理学调查结果的详细描述;
–可能的结果统计处理
- 结果讨论;
- 结果解释;
3.2. 实验结果评价与分析
见综合引言部分 B(D).
124
4. 参考文献
见综合引言部分 B(E).
125
B.9. 重复剂量 (28 天) 毒性(皮肤)
1. 方法
1.1. 引言
见综合引言部分 B(A).
1.2. 定义
见综合引言部分 B(B).
1.3. 标准物质
无.
1.4. 测定方法原理
测定物以递增的剂量,每天被分别涂抹在几组动物样品样品的皮肤
上,每一组一种剂量, 为时 28 天.在测定期间,动物每天都被观
测毒性表现.在测定中死去的动物要被解剖,在实验结束时仍存活的
动物也要被解剖.
1.5. 质量标准
无.
1.6. 测定方法的描述
1.6.1. 预备
126
早于测定开始前至少五天,动物应处于与测定室住宿和饲养同样的条
件下.在测定之前,健康年轻动物被随机分配到测试和对照组.在测
定前不久,动物背部的毛发应被剪除一部分.也可选用刮的方法,但
必须在实验开始前24小时内完成.重复的剪除或刮除毛发的工作应以
周为间隔进行.当进行这些操作的时候,应尽量小心以避免磨损皮肤.
至少 10% 的身体表面应清洁以便于测定.当决定清除覆盖的毛发面
积时,应对动物样品称重.测定固体经过合适的方法被粉碎,测定物
在研碎后应用水充分润湿,或在必要的地方用一种合适的媒介物来确
保其与皮肤的充分接触.液体测定物质通常不用稀释.日常测定每周
要进行五到七天.
1.6.2. 测定情况
1.6.2.1. 动物样品
可以选用成年的老鼠,兔或天竺鼠. 也可使用其它的物种,但是使
用它们需要合适的理由.在研究开始时,所选用动物样品的重量变化
范围应不超过正常平均值的±20%.
1.6.2.2. 数目和性别
每个剂量标准至少有10只具有健康皮肤的动物(5雌5雄).雌性应该
是未生育过的和非怀孕的. 如果实验中的死亡也被考虑的话,所需动
物总数中应该增加到实验结束之前预定死亡的动物数目.除此之外,
后继的包括10只动物样品的小组(5雌5雄)应该加大剂量进行28天的
测定,并在测定完成后观察毒效的可逆性,持续性,或延缓发生性14
127天.10只动物组成的对照组也被应用.
1.6.2.3. 剂量水平
在一个对照组至少需要三种剂量水平,如果有采用媒介物进行测定
时,每组也至少要有三种剂量水平.每天,测定动物应该被放出来至
少6小时.被测药物每天需在相同的时间涂抹到动物身上,并且要根
据动物样品的体重变化每周或每两周对药量进行调整.除了使用相同
的药物外,测定组与对照组的动物应该处于相同的管理模式之下.借
助于媒介物来辅助药效的对照组,应该按与治疗小组同样的方法施与
药剂.所用药量应与治疗小组的最高药量相同.最高药量应能产生毒
性反应,但又不会造成或造成很少的死亡.最小药量应不产生任何明
显迹象或毒性.最低剂量应比接触人的预计用药量大.理论上,中间
药量应产生可观测到的最小毒性反应.如果不止一种中间药量,它们
的具体药量需要按照毒效逐渐加深来确定.在最低和中间药量组以及
对照组,死亡比率要低,从而允许得到有价值的结果评定.
如果测定物会产生严重的皮肤刺激效应,就应该降低浓度.浓度的降
低可能造成其他毒效的减弱或消失,即使用高剂量,也会产生减弱现
象.此外,如果皮肤遭到了严重的损伤,就需要停止现行测定,改用
低浓度进行新的测定.
1.6.2.4. 极限测定
如果在 1000 毫克/公斤的剂量或比已接触的以人作为实验对象的实
验数据稍高的剂量标准下进行的初步研究中,未产生毒效反应,就没
128
有必要进行更深入的测验.
1.6.2.5. 观察周期
每天都要对动物进行毒效反映的观察.应对动物样品的死亡时间,毒
效反应出现和消失的时间进行记录.
1.6.3.实验过程
动物样品应被单独圈养.理论上,应以每周七天,28天为一周期,对
动物进行药物测定.辅助小组中用于后药效观察的动物应在不用药的
条件下继续被观察14天,以观测对毒性的恢复能力与抵抗性.动物与
外界的接触时间每天应至少为6小时.
测定药物应均匀地被涂于大约占动物样品体表面10%的皮肤上.对于
高毒性的物质,所涂的面积可以减小,但应将药物涂得尽量薄,尽量
均匀.
在动物样品与外界接触的时候,应用多孔渗水纱布和无刺激性带子将
测定物固定于皮肤上.测定部位应以合适的方式进行进一步的包扎,
从而固定纱布和测定物,以及确保测定物不被动物摄入体内.可以用
抑制剂制止动物摄入药物,但用药物完全控制不是一种好的方法.也
可选择颈圈作为保护措施.
所有的动物都要每日观察并记录下因为毒性所发出的呻吟及毒性发
作的时间,程度及持续时间.观察应该包括皮肤和毛发,眼睛及黏膜,
呼吸器,循环器,植物性和中枢神经系统,躯体运动和行为方式的变
129
化.动物样品的重量需要每周进行测量.同时食物消耗量也需要每周
测量.定期的对动物样品的观察是必要的,它可以确保动物没有因为
被同伴吃掉,组织分解,遗忘等原因而丢失.在研究的最后时期,所
有的幸存者在治疗组中被验尸.垂死的和遭受严重精神错乱或痛苦的
动物应该在观察到时就被移走,人道宰杀并验尸.
应该在实验结束时对包括对照组在内的所有动物进行以下的测定:
1) 血液学,至少包括血液的,血红蛋白凝结,红血球数,总数和
差别的白血球数量,血液凝结潜力的测定.
2) 临床血液生化学至少应包括肺和肝功能的参数:血清丙胺酸转
氨酶(谷氨丙酮转氨酶),血清天(门)冬氨酸盐(或酯) 转氨酶( 谷
氨草酰乙酸转氨酶),尿素氮,白蛋白,血肌氨酸酐,蛋红素总
量,血清蛋白质总量;
另一项可能是一项充分的毒性评价所必须的决定因素包括钙,磷,氯,
钠,钾,禁食葡萄糖,脂质分析,激素,酸碱平衡,正铁血红蛋白和
胆碱脂酶活性.
为进一步扩展有效作用的研究,可能应用补充的临床生化学.
1.6.4.完整验尸
应该对在研究中的所有动物进行完整的验尸.至少要测定肝,肺,肾
上腺,睾丸应该在解剖后立即弄湿,防止干枯.器官和组织,例如正
常的和处理过的皮肤,肝,肺,睾丸,脾,肾上腺,心脏和目标器官
130
(那些在大小上表现出总的损伤和变化的器官),应该在合适的介质
中保存为了以后可能的组织病理学的测定.
1.6.5.组织病理学测定
在高剂量的组和对照组中,组织病理学的测定应该在保存的器官和组
织中进行.表现出缺陷的组织和器官可归于高剂量的实验物质应该在
所有低剂量的组中检验.在附属组中的动物应该在组织测定时特别注
意那些在其他处理的组中表现出损伤的器官.
2.实验数据
实验数据要用列表的形式总结表示出测定开始时动物样品的数目,表
现出各种损伤的动物样品的数目.所有的观察结果都要用适当的统计
方法评估.任何已知的统计方法都可以使用.
3实验结果报告
3.1. 实验结果报告
如果可以的话,实验结果报告应该包括下列信息:
- 动物样品数据(例如种类,种属,来源,环境条件,食谱);
- 实验条件(包括敷料类型,封闭的或不封闭的);
- 药剂标准(包括媒介物,如果使用的话)和浓度;
- 无效的水平,如果可能的话;
131
- 不同性别和药剂的毒性反应;
- 研究过程中的死亡时间或者动物生存到实验结束;
- 毒性或其他影响
- 每次不正常现象观察到的时间和它随后的过程;
- 食物和体重实验数据;
- 要进行血液测量,并记录结果;
- 要进行临床生化实验并记录结果;
- 验尸结果;
- 组织病理学的发现的详细描述;
- 如果可以的话,进行实验结果的统计学处理;
- 结果讨论;
- 结果解释说明;
3.2. 实验结果的评价和分析
参照综合引言 B(D)部分.
4参考文献
参照综合引言B(E)部分.
132
B.10. 诱变(性)-体外哺乳动物染色体变异测定
1.方法
这种方法是对1997年进行的试管中哺乳动物染色体异常测定的(the
OECD TG 473)的复制.
1.1. 引言
体外哺乳动物染色体异常实验的目的是证实在人工培养的哺乳动物
细胞(1)(2)(3)中能诱发染色体结构异常的媒质的存在.结构性
异常存在两种方式:染色体异常,或者染色单体异常.大多数诱导有
机体突变的物质会引起染色单体异常,但是染色体异常也会发生.多
倍体的增加也可以证明一种化学物质有诱发染色体数目异常的潜力.
然而,这种方法不是为了测定数目异常而设计的,也不常用于此目的.
染色体变异以及相关变化是很多人类遗传病的起因,并且有确实的现
象证明染色体变异及其相关变化导致的体细胞中治癌基因和肿瘤抑
制基因的变化与人类和动物样品的癌症反应有关.
体外哺乳动物染色体异常实验要进行移植的细胞层,细胞株和初级细
胞群的培养.所选用的细胞应从培养中的生长能力,染色体组型平衡
能力,染色体数目,染色体多样性,和染色体异常的自发频率几方面
进行挑选.
在体外进行的测定通常需要借助于外加的代谢活化系统.在体外的测
定条件下,不可能完全模拟出哺乳动物样品的新陈代谢系统.
133
要小心控制条件,以避免无法表现内在诱变的阳性的结果出现,及
PH值,同渗重摩,细胞内高毒素量(4)(5)的增长.
这个实验是用来辨认可诱导哺乳动物内有机体突变的物质和致癌物
质.哺乳动物体内的致癌物质多数在这个测定中起正反应;但是此测
定并不能完全测定出体内的致癌物.联系是建立在化学物质的种类之
上的.不断的事实证明,那些用此测定未被测定出的致癌物是通过机
械机制作用,而不是通过直接的DNA破坏来作用的.
可参看综合引言B.
1.2. 定义
染色单体变异:通过单个的染色单体分解和染色单体的重组表现的结
构性染色体损伤.
染色体变异:表现为同一位置的两条染色单体的分解,或者分解后又
重组染色体结构损伤.
核内复制:在DNA复制的一个S时期后,核没有进入有丝分裂,却
开始另一个S时期的过程.结果是带有4,8,16, 染色单体的
染色体的出现.
缝隙:在一个染色单体范围内的最小程度的染色单体未对准错误.
有丝分裂指数:细胞转位期在一个细胞群中被总的细胞数目所分隔开
的比率;是对该细胞群的增生扩散程度的反映.
134
数目异常:染色体数目相对于细胞正常数目的变化.
染色多体:单倍染色体(n)的复制而不是双倍数染色体的复制(例
如3n,4n等等);
结构性异常:可由显微镜观测到的有丝分裂细胞分化过程中的染色体
结构变化,能观察到碎片,及内在改变或交换.
1.3.实验原理
细胞株要在有代谢活化作用和无代谢活化作用下与测定物接触.在细
胞株与测定物接触后的一定预定时间间隔后,用中间体捕获物质(如
Colemid或秋水仙素)处理,来捕获过渡期的细胞.过渡期的细胞要
在显微镜下分析其染色体异常表现.
1.4. 实验步骤
1.4.1. 准备
1.4.1.1. 细胞
可选用各种细胞列,细胞株和细胞群包括人的体细胞(如中国鼠类的
纤维原细胞,人类或其他哺乳动物淋巴中的淋巴细胞).
1.4.1.2. 介质和培养条件
应采用合适的培养媒介及培养条件(培养皿,CO2浓度,温度及湿度)
来保存细胞群.需在染色单体数目的稳定性和是否存在支原体污染两
方面对选定的细胞列和细胞株进行定期测定.如已被支原体污染,应
135
不再选用.应该知道正常的细胞存活周期及存活条件.
1.4.1.3.培养准备
选定细胞列和细胞株:从普通的细胞群繁殖细胞,在培养媒介中,以
一种在采样前不会产生细胞群混合的浓度和370C的条件下进行培育.
淋巴球: 血液用抗凝结剂(如肝磷脂)进行处理,后将从建康体中分
离出的淋巴球中加入含有分裂素(如植物血球凝集素)的培养基,并
在37℃下培育.
1.4.1.4.新陈代谢活性
细胞应在存在代谢活性和不存在代谢活性的条件下与测定药物接触.
最常用的活化系统是经诱导酶介质处理的,从啮齿类动物肝脏制备的
cofactor-supplemented post-motochondrial fraction.所用的诱导酶介质
如Aroclor1254(6)(7)(8)(9)获苯巴比酮与β萘黄酮(10)(11)
(12)的混合物.
在最终的测定媒介中,末段线粒体片段常被应用于浓度范围1~10%v/v
之间.代谢活化系统的条件决定于被测定的化学物质.在某些情况下,
可以不止一种末段线粒体浓度被选用.
数目的增长,包括能表达特殊活化作用的酶的经遗传得到的功能性细
胞的构造,可以提供潜在的内部活化作用.应按科学的方法调整对细
胞列的选择(如根据细胞色素P450同功能酶对测定物的新陈代谢的适
应度).
136
1.4.1.5. 测定物质/准备
固体测定物质应该在合适的溶剂或媒介物中被溶解或形成悬浊液,如
果高于细胞处理浓度应进行稀释.液体测定物可直接加入测定体系或
稀释到高于处理浓度.测定物应是新鲜制成的,除非有确切的实验数
据证明储存物的可用性.
1.4.2. 测定条件
1.4.2.1. 溶剂/媒介物
溶剂/媒介物不应该与待测物发生化学反应,并与细胞的存活和S9的
活动相协调.若选用的不是常用的溶剂或媒介物,其成分要有具体的
数字表明其的可用性.能用水作溶剂或媒介物的,应首先考虑水.当
测定的是对水不稳定的物质时,应首先考虑有机溶剂或媒介物.可用
分子筛除去水.
1.4.2.2. 暴漏浓度
在决定最高浓度时,应对标准中的细胞毒素,在测定系统中的溶解度,
PH值的改变或同渗重摩效应进行考虑.
在用细胞完整性和成长程度作为表征的主要实验中,细胞的毒性,需
要由在代谢活化作用和无代谢活化作用下的实验数据共同确定.如细
胞合并的程度,成活细胞数,或有丝分裂指数.它对于初步实验中细
胞毒性和溶解性的确定是非常有用的.
至少应选用三种测定浓度.在产生细胞毒素的地方,浓度范围应从产
137
生最大毒性到产生最小或不产生毒性.这常意味着各浓度间相差从2
到10间的一个值.
在收集观测细胞时,最高浓度的测定条件在细胞的合并程度,细胞数,
有丝分裂指数上表现出明显的降低(降低幅度大于50%).有丝分裂
指数是对细胞毒素效应/细胞抑制效应的间接测量实验数据,它决定
于处理后的时间.但是,对于其它毒性测定方法较麻烦或不可行的悬
浊液体系,有丝分裂指数是适用的.有关细胞循环动力学的实验数据,
如平均产生时间(AGT),能够被用作补充信息.但AGT仅仅是总体
的平均值,不能揭示延迟产生的细胞的存在,并且其微小的变化不能
与细胞最佳异变时间的延迟相联系.
对于相关的无毒性物质,最大测定浓度是5 l/ml,最低测定浓度是
5mg/ml,或0.01M.
对于相关的不溶物,比不溶浓度低的浓度无毒性,所选用的最高级量
应比处理末期其在最后媒介物中的溶解度高.在某些情况下(如仅仅
在比最低不溶浓度高时产生毒性),应该在不止一种浓度下进行测定.
在处理之初和结束时估计溶解度是有用的,因为由于细胞,S9,血清
等的存在会使浓度在测定系统接触于空气的过程中发生改变.肉眼即
可观测到不溶现象.沉淀物不应干扰实验数据.
1.4.2.3. 阴性和阳性对照
并发的阳性和阴性(溶剂或媒质)对照,既要在存在代谢活性又要在
不存在代谢活性的条件下进行,每一次实验都要采用.当代谢活性系
138
统被运用时,阳性对照化学物质应该是要求活化才能产生诱导有机体
突变物质的.
阳性对照应借助于已知的断裂剂,再接触的水平上有望在支配测定系
统灵敏度的背景下产生明显的增长.
应选择阳性对照浓度,从而得到清晰的效果又不直接向读者揭示编码
变化的特性.阳性对照物的例子包括:
新陈代谢活化
条件
物质 CAS NO. EINECS NO.
甲基磺酸盐 66-27-3 200-625-0
乙基磺酸盐 62-50-0 200-536-7
乙基亚硝基脲 759-73-9 212-072-2
丝裂霉素C 50-07-7 200-008-6
无外部代谢活
化系统
N-氧化物-4-硝
基喹啉
56-57-5 200-281-1
存在外加代谢
活化系统
苯并芘 50-32-8 200-028-5
环磷酰胺 50-18-0 200-015-4环
139
环磷酰胺一水
化物
6055-19-2
其他适合的阳性对照物也可使用.化学等级的阳性对照物如果有效,
也可考虑.
阴性对照,由单独的溶剂和媒介物形成的实验介质,要和实验培养基
一样处理,每次收集时都应包括在内.此外,未处理对照也应当被使
用,除非控制过程的历史实验数据表明所选溶剂无毒副作用,也不会
发生任何突变.
1.4.3. 实验步骤
1.4.3.1. 测定物处理
在新陈代谢活化系统存在和不存在情况下,分别以测定物对增殖细胞
作用.刺激有丝分裂后约48小时开始淋巴细胞测定.
1.4.3.2. 在不同浓度培养基下重复培养.强烈建议使用逆向溶剂控
制.能证实两次重复培养之间的历史实验数据的变化最小变
化(13)(14),其他的适当阳性的对照物质可能被用.化学
药品应该被考虑的阳性对照,当可得的.此实验数据即可用于
各浓度的单次培养.
气态或挥发性物质应采用适当方式测定,如在密封的培养皿中进行
(15)(16).
1.4.3.3. 培养物收集时间
140
在第一个实验中,无论有无新陈代谢活性,细胞均应接触在测定物中
3~6小时.实验开始后(12),每个约1.5个正常细胞周期取一次样.
如果在有无活化剂的情况下,取样结果都是逆向的,就需要在无活化
的条件下再做一次.连续处理直至取样周期等于1.5个正常细胞周期.
某些物质更容易在处理/取样周期长于1.5个细胞周期是被测定出来.
新陈代谢活化条件下的逆向结果应在各次测定结果上加以证实.在无
必要进行逆向测定结果确定的情况下,应给出正当的理由.
1.4.3.4. 染色体的准备
有秋水仙素或秋水酰胺处理的细胞培养物一般在1~3小时即可收集.
为了准备染色体,每份细胞培养物应单独收集,处理.染色体的处理
包括细胞低渗处理,固定,染色.
1.4.3.5. 分析
所有的固定切片包括阳性和阴性对照,都应该在显微镜分析前进行独
立的分析.因为固定的过程,经常带来一定量的中期细胞的分裂和染
色体的丧失.标记的细胞因包含很多中心小体,数目几乎与所有细胞
类型样式数2±相当.至少每单位浓度和对照的200个好的细胞经过中
期是应被标记;如果正确的话,能被所有复制品均匀的分开.当更多
的异变发生时,这个数目会下降.尽管测定目的是测定结构性染色体
变异,如果细胞内发生多倍体复制现象,进行记录也是很重要的.
141
2. 实验数据
2.1.结果的处理
测定的单位是细胞,因而应该评估发生结构性染色体变异的细胞的比
率.不同类型的结构性染色体变异应同时列出数目,实验频率,对照
培养品.
裂缝应单独记录,一般不包括在总的变异频率中.还应记录所有阳性
和阴性对照中的培养物的细胞毒素量.
应提供单个培养物的实验数据.此外,所有实验数据应以表格的形式
总结.
没有必要对一个清晰的阳性反应进行证明.不确定的结果将在以后的
实验中通过精确的改善实验条件而被证实.阴性结果证明的必要性已
经在1.4.3.3中讨论过了.扩大确定条件的分类而对研究参数的纠正应
该在随后的实验中考虑.应该纠正的研究参数包括浓度,时间间隔,
新陈代谢活化条件.
2.2. 结果评价与分析
这里有许多确定的阳性结果的标准,向相关的浓度增加或带有染色体
变异的细胞数目的复制性增加.应首先考虑生化关系.统计学方法被
用来评估测定结果(3)(B).但统计学的意义不应该作为判断阳性
结果的唯一因素.
142
多倍体细胞数目的增加可以表明测定物质有抑制有丝分裂和引发级
数式染色体变异的潜能.细胞内染色体复制的细胞数目的增加,可以
证明实验物质有抑制细胞循环进行的潜能(17)(18).
在这一个系统中,结果不符合上述的标准测定物质被认为是非诱导有
机体突变的物质.
虽然大多数的实验将会给出清楚的阳性的或阴性的结果, 但在极少
的情况下数据将不能对所测定物质的活性做出明确的判断. 无论测
定重复进行了多少次,结果仍保持意义不明确的或可疑的.
染色体变异测定中阳性的结果指出测定物质导致人工培育的哺乳动
物的体细胞内染色体结构变异. 阴性的结果指出,在测定情况之下,
测定物质不导致人工培育的哺乳动物的体细胞内的染色体变异.
3. 实验结果报告
测定结果报告
测定结果报告必需包括下列各项信息:
溶剂/ 媒介物:
- 选择媒介物的理有;
- 测定物质在溶剂或媒介物中的可溶性和稳定性, 如果已知;
细胞:
- 细胞的类型和来源;
143
- 被用细胞的染色体类型特征和合适性;
- 没有支原体,如果适用;
- 细胞的周期长短的信息:
- 被采血者的性别, 全血或分开的淋巴细胞,使用的有丝分裂
原
- 各种方法的数量, 如果使用;
- 细胞培养基的保养方法, 如果使用;
- 染色体类型的数目.
测定条件 :
- 中期发现物质的识别特征,它的密度和细胞接触的忍耐力;
- 选择密度和所涉生物物种的数据,例如:细胞毒性的数据和
可溶性限制, 如果可得的;
- 培养基的结构, 二氧化碳的集中度,如果可得;
- 测定物质的集中度;
- 媒介物和所加的测定物质的量;
- 孵化温度;
- 孵化时间;
- 持续处理;
144
- 在播物种的细胞密度, 如果合适的;
- 变化的活动系统的类型和组成, 包括可接受标准;
- 阳性的和阴性的对照组;
- 准备胶片的方法;
- 变异的标准;
- 数字分析;
- 毒性测量的方法;
- 判断研究是阳性的或阴性的标准;
结果;
– 毒性的标志,例如交流汇合的程度,细胞周期的数据,细胞计数,有丝
分裂;
– 沉淀的标志;
– 在 pH 和处理介质上的数据, 如果可决定的;
– 变异的定义, 包括缝隙;
– 染色体变异的细胞的数目和染色体变异的类型,这些根据对照组
的物种类的不同分开来给出;
– 倍性的变化,如果可以看到;
– 剂量回应的关系, 在可能的地方;
145
– 如果有,就进行统计分析;
– 并发事件阴性 (溶剂/媒介物) 和阳性对照数据;
– 历史上的阴性 (溶剂/媒介物) 和阳性的对照组数据,藉由范围和方
法和标准偏差.
结果的讨论.
结论.
4. 参考文献
Evans, H.J. (1976). Cytological Methods for Detecting Chemical
Mutagens. In: Chemical
mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender,
A. (ed) Plenum
Press, New York and London, pp. 1-29.
Ishidate, M.Jr. and Sofuni, T. (1985). The in Vitro Chromosomal
Aberration Test Using
Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture. In: Progress in
Mutation Research,
Vol. 5, Ashby, J. et al., (Eds) Elsevier Science Publishers,
Amsterdam-New York-Oxford,
427-432.
Galloway, S.M., Armstrong, M.J., Reuben, C., Colman, S., Brown, B.,
146
Cannon, C., Bloom,
A.D., Nakamura, F., Ahmed, M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G.H.,
Resnick, MA,
Anderson, G. and Zeiger, E. (1978). Chromosome aberration and sister
chromatic exchanges
in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals. Environs.
Molec. Mutagen 10
(suppl.10), 1-175.
Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M.Jr., Brusick, D.,
Ashby, J. and Myhr,
B.C. (1991). Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report
from ICPEMC Task
Group 9. Mutation Res,. 257, 147-204.
Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K., (1992).
Clastogenicity of low pH to
Various Cultured Mammalian Cells. Mutation Res., 268, 297-305.
Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975). Methods for Detecting
Carcinogens and
Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test.
Mutation Res., 31,
347-364.
Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983). Revised Methods for the
147
Salmonella Mutagenicity Test.
Mutation Res., 113, 173-215.
Natarajan, A.T., Tates, A.D., van Buul, P.P.W., Meijers, M. and de Vogel,
N. (1976).
Cytogenetic Effects of Mutagen/Carcinogens after Activation in a
Microsomal System in
Vitro, I. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid
Exchange by
Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO
Cells in the Presence of
Rat-Liver Microsomes. Mutation Res., 37, 83-90.
Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr. (1979). Chromosomal
Aberration Tests on 29
Chemicals Combined with S9 Mix In Vitro. Mutation Res., 66, 277-290.
Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson,
G.G., Mackay, J.M.
and Wolf, R.C. (1992). Report of UK Environmental Mutagen Society
Working Party.
Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays.
Mutagenesis, 7,
175-177.
Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976). A
148
Safe Substitute for
Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems.
In: de Serres, F.J.,
Fouts, J.R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds) In Vitro Metabolic
Activation in Mutagenesis
Testing, Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.
Galloway, S.M., Aardema, M.J., Ishidate, M.Jr., Ivett, J.L., Kirkland, D.J.,
Morita, T.,
Mosesso, P., Sofuni, T. (1994). Report from Working Group on in In
Vitro Tests for
Chromosomal Aberrations. Mutation Res., 312, 241-261.
98
Richardson, C., Williams, D.A., Allen, J.A., Amphlett, G., Chanter, D.O.
and Phillips, B.
(1989). Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. In: Statistical
Evaluation of
Mutagenicity Test Data. Kirkland, D.J., (ed) Cambridge University Press,
Cambridge, pp.
141-154.
Soper, K.A. and Galloway, S.M. (1994). replicate Flasks are not
Necessary for In Vitro
Chromosome Aberration Assays in CHO Cells. Mutation Res., 312,
149
139-149.
Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982). CHO/HGPRT
Mutation Assay:
Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L.,
Schaich, K.M. (eds).
Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, pp. 91-103.
Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983).
Evaluation of an Exposure
System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly
Volatile Mutagens in the
CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5, 795-801.
Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese hamster cells
during alpha-radiation
induced G2 arrest. Mutation Res., 119, 403-413.
Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E. (1983). Aphidicolin - induced
endoreduplication in
Chinese hamster cells. Cancer Res., 43, 1362-1364.
150
B.11诱变(性)-体内哺乳动物骨髓染色体变异测定
1. 方法
这一个方法是经济合作暨发展组织 TG 475的哺乳动物骨髓染色体
变异测定.(1997)复制.
1.1. 引言
体内染色体变异测定的哺乳动物用于发现结构染色体的变异藉着到
动物的骨髓细胞的测定物质感应,通常老鼠 (1)(2)(3).(4) 结构的染色
体变异可能是有二种类型:染色体或染色单体.多倍性的增加可能指
出一物种化学药品有潜在性导致变异. 藉由多数的化学诱导有机体
突变的物质,感应变异是有染色分体类型的,但是染色体类型变异也
会发生.
染色体变化和相关的事件是许多人类的遗传基因的因素和在人体测
定中有实质上的证据证明染色体变化和相关的事件在引起器官和瘤
抑制器基因改变方面是阳性参与的.
老鼠通常被用于这一个测定. 骨髓是这一个测定的目标品, 因为它
是一含血管类物质, 而且它包含大量可被隔离和处理的迅速循环更
新的细胞. 其他的物种和物质不能用于这物种方法.
这一个染色体变异测定尤其是与诱导有机体突变的危险物质有关,因
为它考虑到活体新陈代谢, 药物动力学和 DNA-修理的因素.虽然
这些可能在物种之中改变和在目标物之中.在体外测定中进一步的调
151
查导致有机体突变的物质,在体内测定中也是有用的.如果有证据证
明测定物质 , 或一个体内新陈代谢产物,将不能达到目标,使用这一
个测定不是合适的.
也可看综合引言B部份 .
1.2. 定义
染色单体- 类型异常: 染色体结构的破坏,常被表示成被破坏的结构
染色体和损害染色分体之间的联合.
染色体- 类型变异: 染色体结构的破坏,常被表示成被破坏的结构染
色体损害或在同一个位置的染色分体的破坏和联合,.
核内复制: 有丝分裂的一个步骤,在DNA复制的一个S 时期之后,
不进入有丝分裂而是开始另外的一个 S 时期. 结果是染色体分成
4,8,16,...个染色单体.
缝隙: 比一个染色分体的宽度更小的空间, 和最小量的染色单体.
数目异常::染色体的数目发生改变.
多倍体:除了单倍染色体复制之外的的染色体数目(n) 的重复(例如3
n,4 n).
结构的变异: 可被显微镜观察到的细胞区分的中期阶段的染色体结
构的改变,认为是被删除部分,染色体内或之间的交换.
152
1.3. 测定方法的原理
动物藉着一条合适的途径暴漏在测定物质中,在处理后合适的时侯被
宰杀. 在宰杀之前,动物被平等对待,(例如,用番红花作原料而制
成的植物盐或秋水仙胺). 从骨髓细胞中提取而且沾染以用来准备染
色体,而中期细胞被用于染色体变异的分析.
1.4. 测定方法的描述
1.4.1. 准备
1.4.1.1. 动物物种的选择
虽然任何合适的哺乳动物物种可以被用,但小鼠,大鼠在中国和东欧
被普遍使用,. 年轻的健康的动物在实验室普遍使用. 根据研究的
结果,动物的重量变化应该是最小的并且不超过每性别的 20% 的重
量.
1.4.1.2. 住所和饲养情况
虽然湿气的目标应该是 50-60%,通用的条件参考B部分所示的条件.
1.4.1.3. 动物的准备
健康的年轻的成年的动物可以任意地被指定为对照组和实验组.笼应
该被安排在一定的方法以致于由于笼子安排造成的影响可以被限制.
动物可以被独特地识别. 动物在实验室适应新环境的情况为至少五
天.
153
1.4.1.4. 剂量的准备
固体测定物质应该在合适的溶剂或介质中被溶解或稀释, 如果合适
的,在选配动物之前.
液体测定物质需被直接配制或在稀释之后配. 测定物质需及时准备,
除非数据的稳定性可以显示储存的可行性.
1.4.2. 测定情况
1.4.2.1. 溶剂/媒介物
溶剂/ 媒介物在剂量标准上不应该产生毒性作用, 而且不应该和测定
物质起化学反应. 如果除了使用众所周知的溶剂/ 媒介物,它们应该
由数据支持其兼容性.如果被推荐无论那里都可以用, 应首先考虑这
样的溶剂/ 媒介物.
1.4.2.2. 对照组
同时进行的阳性的和阴性(溶剂/媒介物) 的对照组应该在每次测定应
包括每种性别在内. 除了处理测定物质,对照组的动物应该是以同
测试组的处理方式一样进行处理.
阳性对照组应当产生结构异常,且在体内达到一定的显示水平以期望
能超过背景而被检测得到.阳性的对照组应该选用有清晰的效果,但
又并不立即向读者展现密码切片的信息.以不同的途径管理对照组阳
性的结果并且只进行单一的取样是可接受的 .如果可能,可以考虑
使用与阳性对照相关的化学物质进行分类.阳性对照物质的例子包
154括: 物质 cas号码 EINECS 号码
甲磺酸乙脂 62-50-0 200-536-7
乙基亚硝基脲 759-73-9 212-072-2
丝裂霉素C 50-07-7 200-008-6
环磷酰胺
一水环磷酰胺
50-18-0
6055-19-2
200-015-4
替姆 51-18-3 200-083-5
用溶剂或媒介物单独处理,或采用和测试组处理方式一样处理的阴性
对照组, 应当包含在每次测试过程中,除非动物样品细胞内的染色体
的改变和缺失能够从前期的对照组数据得到. 如果单一抽取样品被
被用做阴性对照,最合适的时间是第一抽取样品时间. 除此之外,
除非有历史的或出版了对照组数据示范在藉着被选择的溶剂/媒介物
显示没有有害的或诱导有机体突变的物质作用,未经处理的对照组也
应该被用.
1.5. 测定步骤
1.5.1. 动物的数量和性别
155
每个测试组和对照组必需至少包括每性别 5只动物. 如果在研究的
同时能够获得同种动物使用同一测试程序测试得到的数据显示两性
间对测试物质的毒性没有显著差异时,使用单一性别的合适的动物进
行测试是有效的.人类对化学药品的接触可能有性别差异,特别是对
某些药品,因此这类药品的测试应选用合适的性别的动物进行测试.
1.5.2. 实验进度表
测定物质可被提供如单一测试. 测定物质也可能是被分为分散的剂
量,也就是两组在同一天几小时内分别被测试,以利于进行大剂量物
质的测试.其他的剂量摄入应该科学合理.
样品应该在同一天分两次先后注入.对啮齿动物测试周期应该是1.5
个正常细胞周期间隔(后者将比正常周期晚12-18小时). 因为动物
对测试物质的吸收和代谢需要一定的时间,又细胞动力学也影响染色
体变异检测的最佳时间,因此推荐在第一次给药后24小时收集测试
信息.如果剂量摄入超过一天,最后的测试应使用在 1.5个细胞周期
长度.
动物宰杀之前,应腹腔注射一份合适剂量的中期抑制剂 (如 秋水酰
胺或秋水酰碱). 动物在其后的一个合适的间隔时间内被抽取样品.
对于小鼠这一个间隔大约是 3-5个小时;对东欧或亚洲产的大颊的鼠
类这一个间隔 大约是4-5个小时. 细胞从骨髓被提取用作染色体变
异分析.
1.5.3. 剂量水平
156
若因无合适的数据可用而进行判定性研究时,研究应在同一实验室进
行,使用相同的种系,品种,性别和处理方式(13). 如果毒性,三
个剂量水平用于第一抽取样品的时间. 这些剂量标准的范围应该含
盖从最大到很小或没毒性. 在较迟的抽样时间只需用最大的剂量.
最高剂量是能产生显著的毒性效应的剂量水平,基于这样的水平可以
产生致命的损害.具有特殊生物活性的物质在低毒性剂量药剂 ( 如
荷尔蒙和分裂素)是例外的,到那剂量- 设定标准应该在一物种个案
基础上被评估. 最高的剂量可能也被定义为一份剂量生产品和骨髓
的毒性的一些指示 (例如比有丝分裂的50% 少).
1.5.4. 极限测定
如果一个测定按照至少 2000个毫克/ 公斤身体重量的剂量标准使用
单一处理, 或作为同一天二次处理 , 没有观察出毒性作用的产生,如
果神经毒性不是预期的基于来自结构相关的物质数据, 那么一项研
究使用三个剂量标准是不必要的. 因为比较长的期间研究, 2000毫
克/公斤/身体重量/日的极限剂量疗效达14 天 , 1000毫克/公斤/身体/
日疗效达到14天以上. 预期人类的接触可能预示较高的剂量标准可
能用于极限测定的需要.
1.5.5. 建议剂量
测定物质通常使用胃管或一合适的插管用强饲法投放, 或藉着腹腔
注入. 接触的其他路径可能是可接受的,只要它们可被证明. 液体
最大量根据测定动物的大小用强饲法投入. 其量不应该超过 2 毫升
157
/100 g 身体重量. 使用更大的量必需有合适的理由.用较高的集中
恶化作用会产生以外的刺激或正常的腐蚀物质;测定体积的变化应该
被减少,通过调整浓度以保证含有所有剂量水平.
1.5.6. 染色体准备
在动物死后立刻提取骨髓, 放入低渗溶液进行固定.然后细胞被扩
延的在载玻片上而且作标记.
1.5.7. 分析
有丝分裂应该在至少 1000个细胞中.如对细胞毒性的衡量是决定每
一动物为所有的被对待的动物 ( 包括阳性的对照组) 和未经处理的
阴性对照组的动物.
每个动物至少100个细胞应该被分析.当变异的高数字被观察到这一
个数字可能被减少. 所有的载玻片, 包括那些阳性的和阴性对照组,
应该独立地在显微镜的分析之前被独立编码. 自载玻片准备以后步
骤时常用损失造成分裂中期的比例破坏.染色体, 细胞刻划应该因此
包含许多的着丝点数目的2n+2倍.
2. 数据
2.1. 结果的处理
单独的动物实验数据以表的形式被呈现. 实验的单位是动物. 对于
每只动物细胞的刻划, 缺失细胞的数目和染色体结构异常的细胞的
百分比应当被评估.染色体结构异常应当在表中列出它们的在测试组
158
和对照组中的数目和频率.缝隙被分别的记录和报告但是是通常不包
括在总变异频率内. 如果没有证据证明在性别之间的反应不同, 来
自两性别的数据可能被合并进行统计分析.
2.2. 实验结果评价与分析
有一些标准判定一个阳性的结果, 如在单一样品时间的一个单一剂
量团体中有变异的细胞的剂量- 相关的增加和染色体变异的细胞比
较的数字或数字的清楚增加结果首先应该被考虑.统计方法可以有助
于对测试结果的评价 (6). 统计的意义不应该被作为判断阳性反应
的唯一决定因素.意义不明确的结果应该被进一步的测定澄清宁可使
用一实验的情况修正值.
多倍体的增加可能预示测定物质有潜在性引诱染色体变异.核内复制
的增加可能指出测定物质有潜在抑制细胞的周期进程(7) (8).
在这一个测定中结果不符合上述标准的测定物质被认为是非诱导有
机体突变的物质.
虽然大多数的实验将会给清楚阳性或阴性结果, 在极少的情况下数
据放置将会预先排除作一个明确的审判有关测定物质的活型.不管实
验进行过多少次结果仍可能保持意义不明确的或可疑的.
阳性的结果从在活体染色体变异测定中指出物质导致被测定的物种
骨髓的染色体变异. 阴性结果指出在测定情况之下,被测定的物种
骨髓中测定物质不导致染色体变异.
159
测定物质或它的新陈代谢产物达成一般的循环或明确地结论的可能
性 (例如 系统的毒性)应该被讨论.
3. 实验报告
测定结果报告
测定结果报告必需包括下列各项信息 :
溶剂/媒介物:
- 媒介物的选择理由
- 测定物质在溶剂/介质中的-溶解性和稳定性, 如果已知;
测试动物:
- 使用的物种/属;
- 动物的数量,年龄和性别;
- 来源, 饲养条件,饮食,及其他;
- 测定开始时每只动物的重量, 包括重量范围,每组的平均值
和标准偏差;
测定条件 :
- 阳性的和阴性 (介质/溶剂) 对照组;
- 规定范围研究的数据,如果被执行;
- 剂量水平选择的原理;
删除的内容: 的
删除的内容: 标准
160
- 测定物质准备的细节;
- 测定物质的处理细节;
- 处理的程序原理;
- 验证测试物质到达基体循环和目标组织的方法, 如果可适
用;
- 从饮食/ 饮用水测定物质浓度 (百万分之一) 到真实的剂量
(毫克/公斤身体重量/日)的转换, 如果可适用;
- 食物和水质的细节;
- 测试和取样的详细时间表;
- 毒性的测量方法;
- 有丝分裂中期主要物质的特性,它的密度和处理时间;
- 切片的准备方法;
- 变异的标准;
- 每一动物被分析的细胞的数目;
- 判断结果是阳性的或阴性的或中性的标准.
结果 :
- 毒性的迹象;
- 有丝分裂指数;
删除的内容: 查证被测定物质
达到了一般标准的方法,
删除的内容: 集中
删除的内容: 配 制
删除的内容: 变异
删除的内容: 量
删除的内容: 详细说明处
理 ,抽取样品的时间表
删除的内容: 细胞
删除的内容: 的密度和对处理
的承受度
删除的内容: 载玻
删除的内容: 片
删除的内容: 的
删除的内容: 象征
161
- 变异的类型和数目,每只动物分别给出数据;
- 每组变异的总数,平均值和标准偏差;
- 每组变异的细胞的总数,平均值和标准偏差;
- 倍性的变化, 如果看到;
- 剂量响应关系;如果可能
- 统计分析结果;
- 同时进行的阴性对照组数据;
- 前期阴性对照数据,范围,平均值和标准偏差;
- 同时进行的阳性对照组数据.
结果讨论.
结论.
4. 参考文献
Adler, I.D. (1984). Cytogenetic Tests in Mammals. In: Mutagenicity
Testing: a Practical Approach. S. Venitt and J.M. Parry (Eds). IRL Press,
Oxford, Washington D.C., pp. 275-306.
Preston, R.J., Dean, B.J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A.F. and
Shelby, M. (1987). Mammalian In Vivo Cytogenetic Assays: Analysis of
Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells. Mutation Res., 189,
157-165.
删除的内容: 数字
删除的内容: 分开来
删除的内容: 个团体
删除的内容: 字的总数和方法
删除的内容: 团体
删除的内容: 字的方法
删除的内容: 回应
删除的内容: 并发事件
删除的内容: 历史的阴性用范
围,方法和标准偏离对照组数
据
删除的内容: 并发事件
删除的内容: 的
删除的内容: 的
162
Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D.G., Bootman, J. and
Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetic Assays. In: D.J. Kirkland (Ed.)
Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS
Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I
revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester,
Melbourne, Sydney, pp. 115-141.
Tice, R.R., Hayashi, M., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blakey, D.H.,
Holden, H.E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., F.B., Pacchierotti, F.,
Preston, R.J., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994).
Report from the Working Group on the in Vivo Mammalian Bone
Marrow Chromosomal Aberration Test. Mutation Res., 312, 305-312.
Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile,
D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J.
and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK
Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In
Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, 313-319.
Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G.,
Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K. (1989).
Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays. In: UKEMS
Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report Part III.
Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. D.J. Kirkland, (Ed.)
163
Cambridge University Press, Cambridge. pp. 184-232.
Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese hamster cells
during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation Res. 119, 403-413.
Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E. (1983). Aphidicolin - induced
endoreduplication in Chinese hamster cells. Cancer Res., 43, 1362-1364.
164
B.12. 诱变(性)-体外哺乳动物红血球测定
1. 方法
这一个方法是经济合作暨发展组织 TG 474 的哺乳动物红血球微核
测定复制(1997).
1.1. 引言
哺乳动物体内微核测定用来发现对测定成分感应的染色体有核红细
胞的有丝分裂的物种如骨髓所抽取样品的红血球和/或外围设备动物
的血球通常是啮齿动物.
微核测定的目的要识别造成细胞生成的损害的物质是哪一部分造成
的.微核的形成包含滞后的染色体碎片或整个的染色体.
当骨髓有核红细胞进入一个多色的红血内发展的时候,主要部份被挤
出; 任何的微核已经被形成可能留在后面以别的方式收集细胞质微
核在这些细胞中被促进因为它们缺乏一个主要的核心.微核的频率增
加的动物多色的红血球感应染色体的损害.
老鼠的骨髓自多色的红血球以后通常被用于这一个测定. 不成熟的
微核的测量 (多色的)周边的血红血球相等地是可接受的在任何的物
种方面在无能要除去微核红血球的脾脏已经被示范, 或已经显示一
个合适的急性因素结构的或数字的染色体变异.微核可能被许多的标
准区别. 包括着丝点或微核中的着丝点DNA 的出现确认或缺少.
微核的频率不成熟的 (多色的) 红血球是那主要的端点.外围设备的
删除的内容: 活的
删除的内容: 的
删除的内容: 的
删除的内容:
删除的内容: 老鼠
165成熟 (正常染色质的) 红血球的数字也包含在成熟的红血球的一个
给定的数字之中的 微核的血可能被用如测定的端点,当动物不断地
被对待达 4个星期之久的时候或更多.
体内微核测定的这一个哺乳动物尤其是与估定有关导致有机体突变
的物质它允许考虑 活体新陈代谢的因素,药物动力学的危险和DNA-
修理处理虽然这些可能在物种之中改变遗传基因的端点. 在活体测
定中进一步的调查是也有用的.在体外系统中一导致有机体突变的物
质被发现.
如果有证据测定物质 ,或一个没有活性的新陈代谢产物,将不达到目
标,使用这一个测定是不合适的.
一般引言在部份 B .
1.2. 定义
着丝点(Kinetochore): 是染色体上的一个区域,是细胞分裂时纺锤体
连接的地方,从而允许姊妹染色单体有序的运动到子细胞中.
微核: 小的核, 分开和附加到细胞的主要核,在有丝分裂末期有染色
单体或整个染色体形成.
正常染色质的红血球: 成熟的红血球缺乏核糖体并且能够通过核糖
体染色和未成熟的正常的红细胞区分开来.
多染性红细胞: 不成熟的红细胞,是红细胞形成中的一种状态,仍然含
有核糖体因此可以和成熟的红细胞区分开来.
删除的内容: 活体
删除的内容: 一个染色体的区
域 (s) 由于纤维是在细胞区
分期间联合, 允许染色体的
有秩序的运动到那细胞的杆.
删除的内容: 的
删除的内容: 染色体碎片或全
部的有丝分裂 (减数分裂)
的末期时候的染色体
删除的内容: 醋栗核蛋白质
删除的内容: 而且可能是不成
熟的, 多色的红血球对醋栗
核蛋白质是选择的.
删除的内容: 多色的红血球
删除的内容: 红血球
删除的内容: 发展的一个中间
的阶段,
删除的内容: 包含醋栗核蛋白
质
删除的内容: 可能
删除的内容: 被区别从成熟的,
正常染色质藉着对醋栗核蛋
白质是选择的污染红血球
166
1.3. 测定方法的原理
动物藉着一条合适的路径接受测定物质. 如果骨髓被用,那动物在测
试合适的时侯被宰杀, 吸取骨髓,和准备制备和染色(1)
(2)(3)(4)(5)(6) . (7) 当peripheral blood被用的时候,血在测试开始后
合适的时侯被收集并且准备被做而且标记(4)(8)(9).(10) 因为用with
peripheral blood研究,在最后一次接触药品和细胞收集中间尽可能短
的时间内收集血液. 分析配制品验证微核的存在.
1.4. 测定方法的描述
1.4.1. 准备
1.4.1.1. 动物物种的选择
如果使用骨髓,推荐使用小鼠或大鼠的, 虽然任何的适当哺乳动物物
种可能被用. 当体外进行血液测试时,推荐使用小鼠. 然而,任何
的合适的哺乳动物的物种可能被用.但是一个物种作为提供一脾脏不
除去微核红血球或一个已经显示合适的急性物种发现引起染色体在
结构或数目上发生变异. 实验室通常使用的年轻健康动物的可以被
使用. 在研究中, 各性别动物的重量变化应该是最小的并且不超过
_20%.
1.4.1.2. 居住和饲养情况
常用条件参考总引言B尽管目标,湿度应该是 50-60% .
1.4.1.3. 动物的准备
删除的内容: 原则
删除的内容: 治疗
删除的内容: 吸取
删除的内容: 制造而且沾染
删除的内容: 外围设备血
删除的内容: 治疗
删除的内容: 和周边的血
删除的内容: 尽可能
删除的内容: 一点的时间应该
逝去在最后接触和细胞收获
之间
删除的内容: 准备出现分析微
核
删除的内容: 被用
删除的内容: 老鼠
删除的内容: 被
删除的内容: 推荐
删除的内容: 血被用作外围设
备
删除的内容: ,老鼠被推荐
删除的内容:
删除的内容: 的
删除的内容: 字的染色体
删除的内容: 普遍
删除的内容: 过
删除的内容: 的
删除的内容: 实验室应该
删除的内容: 一般的情况要分
开, B引言指的是的应用的
删除的内容: 时
删除的内容: 气
167
健康的年轻成年的动物随机地被指定为对照组和测试组. 实验动物
进行了个体的确认. 动物适应实验室的新环境至少为五天. 应该采
取特殊的方法使关进笼内动物产生的影响尽可能被减少.
1.4.1.4. 试剂的准备
固体测定物质应该在合适的溶剂或介质中被溶解或稀释, 如果合适
的,在选配动物之前.
液体测定物质需被直接配制或在稀释之后配. 测定物质需及时准备,
除非数据的稳定性可以显示储存的可行性.
1.4.2. 测试条件
1.4.2.1. 溶剂/介质
溶剂/ 介质在剂量水平下不应该产生毒性作用, 而且不应该是和测定
物质起化学反应. 如果除了众所周知的溶剂/ 介质被用,它们应该由
数据支持它们的兼容性.如果被推荐无论那里都可以,这样的溶剂/ 介
质首先应该被考虑.
1.4.2.2. 对照组条件
同时进行的阳性的和阴性(溶剂/介质) 的对照组应该在每个测定中包
括每种性别. 除了处理测定物质,对照组的动物应该是以同一的方
式处理.
阳性的对照组应该被选用一边有清晰的作用但是并不一定可以立即
向读者展现密码的特征.以一条不同的路径管理对照组阳性的结果并
删除的内容: 任意
删除的内容: 治疗团体
删除的内容: 那些
删除的内容: 独特地被识别
删除的内容: 对
删除的内容: 笼应该被安排特
殊的方法以致于
删除的内容: 可能
删除的内容: 的作用
删除的内容: 剂量
删除的内容: 测定情况
删除的内容: 并发的
删除的内容: 在内
删除的内容: 团体
168
且只进行单一的取样是可接受地 .当可得的时候化学的班级使用相
关阳性的对照组化学药品应被考虑到.包括物质的阳性对照组的例
子: 物质 cas号码 EINECS 号码
甲磺酸乙酯 62-50-0 200-536-7
乙基亚硝基脲 759-73-9 212-072-2
丝裂霉素C 50-07-7 200-008-6
环磷酰胺
一水环磷酰胺
50-18-0
6055-19-2
200-015-4
替姆 51-18-3 200-083-5
溶剂或介质单独处理的阴性的对照组, 应该在每个取样的时候被用
到,除非在组里被相同的方式处理过.从历史的对照组数据动物易变
和频率是可得的. 如果单一抽取样品被申请阴性的对照组,大部分合
适的时间是第一抽取样品时间. 除此之外,除非有历史的或出版了
对照组数据示范在藉着被选择的溶剂/介质感应,没有有害的或诱导
有机体突变的物质作用,未经处理的对照组也应该被用.
如果血被用的外围设备,前治疗样品也可能是可接受如一个并发事件
阴性对照组, 当产生的数据为历史的对照组是在预期的范围中,只有
169
在短周边的血研究中 (例如,1-3 治疗 (s))可用.
1.5. 实验步骤
1.5.1. 动物的数量和性别
每个测试和对照组必需至少包括每性别 5只 动物. 如果研究的时
间是从相同的物种研究得到的数据而且使用相同的标准的测试,在毒
性中和性别上没有实质上的不同,然后在单一性别方面尝试将是允许
的.人类对化学药品接触的可能是有性别差异的.例如一些药物制剂,
就需要选用适当性别的动物进行测试.
1.5.2. 治疗时间表
没有标准的测试程序 (也就是 1,2 或较多的测试在 24个 h 间隔内)
可推荐.只要实在作用为这一项研究已经被示范或为一项阴性的研
究,来自广大的剂量样品摄生是可接受的, 像毒性一样的常被示范,
否则界限剂量已经被使用, 而且配制继续的直到抽取样品. 测定物
质也可能被提供如一份分散的剂量,也就是,二次治疗被只达几个小时
分开, 促进管理大体积材料.
测试可用如下两种方法进行:
(一) 动物与测定物质一次一起对待. 骨髓的样品被拿至少两次,
开始必治疗后 24个小时, 但是使用抽取样品比 早过24个小
时的治疗被证明之后,不扩充超过治疗后 48个小时以在样品
之间的适当间隔.样品周边的血至少被抽两次, 开始在治疗过
删除的内容: 治疗
删除的内容: 团体一定
删除的内容: 在
删除的内容: 那里
删除的内容: 物
删除的内容: 接触路径
删除的内容: 会
删除的内容: 充份
删除的内容: 对
删除的内容: 人类接触
删除的内容: 不同的
删除的内容: 和
删除的内容: 学的代理人
删除的内容: 测定
删除的内容: 应该是在适当性
别的动物上施行
删除的内容: 治疗时间表
删除的内容: 治疗
删除的内容: 以
删除的内容: 测定以下方式被
运行
删除的内容: 拿
170
程中不早于 36个小时,藉由在第一个样品之后的适当间隔,
但是不扩充超过 72个小时. 当一个阳性的回应在一点钟被
辨认出抽取样品时间的时候,附加的抽取样品不被需要.
(二) 如果 2 或更多的日常测试被进行 (例如 二次或较多的测试
在 24个小时间隔内), 样品在 18 和 24小时 之间应该是收
集一次,在那之后最后的治疗为骨髓和一次在 36 和 48 小
时之后为外围设备血的最后测试.(12) 当有关的时候,其他的
抽取样品可被用于附加.
需要的时候可能应用其他有关取样时间.
1.5.3. 剂量水平
如果是因为没有合适的数据而进行判定测定,,应该是在相同的实验
室中,使用相同的种类,种属,性别和测试程序. (13)
如果测毒性,三个剂量水平作为第一抽取样品时间. 这些剂量标准的
范围从最大到很小或甚至没有毒性. 在比较迟的只有抽取样品时间
最高的剂量需要到被用到. 最高的剂量是定义如被产生毒性的告示
剂量以致于比较高度的剂量甚至致命. 具有生物学活性的特殊物质
在低毒或无毒的剂量 ( 如此的如荷尔蒙和细胞分裂素) 可能是这些
剂量中的一些例外.我们应该设定一个标准,而且应该在个案基础上
来评估. 最高剂量也可定义为一份剂量生产品骨头髓的毒性指示
(例如,骨头的骨髓和周围血液中的不成熟的红血球在总红血球之中
比例的减少).
删除的内容: 每日
删除的内容: 的治疗被用
删除的内容: 治疗
删除的内容: 小时
删除的内容: 治疗
删除的内容: 标准
删除的内容: 来
删除的内容: 在主要的研究中
删除的内容: 菌种
删除的内容: 治疗作息制度
删除的内容: 性
删除的内容: 性
171
1.5.4. 极限测定
如果一个测定以至少 2000毫克/ 公斤身体重量的剂量水平作测试,
或是当作在同一天中的两个疗程.没有观察得出的毒性作用的生产品,
而且如果毒性物质不是预期的基于相关数据的物质, 那么,三个剂量
水平的完全测定就是没有必要的了. 因为经过较长时间的研究,那界
限剂量是达到 14 天的治疗2000毫克/公斤/身体重量/ 日子,1000
毫克/公斤/身体重量/ 日子治疗时间要超过14 天. 估计人类要接触
出在极限测定中会使用较高的剂量标准.
1.5.5. 剂量的管理
测定物质通常用填喂法提供使用胃管或一合适的插管套管或腹膜内
的注射.其他的显而易见的途径如果是正确的也是可以接受的.被测
液体一次能注入的最大的体积主要仰赖测定动物的大小.最大体积不
应该超过 2 毫升/100g/身体重量.比这些更大的体积的使用必须被证
明.除了正常状态时,高浓度集中是具有加速破坏性质的刺激性的或
腐蚀性的物质,易变的测定体积应该调整,使其集中以确保在所有的
剂量水平是一个确定的常数.
1.5.6.骨髓 /血的准备
骨髓细胞通常从下列各项屠宰品中的大腿骨或胫骨中获得.一般而
言,从大腿骨或胫骨中得到的细胞,准备而且沾染使用确定的方法.
外围血从在后面的静脉血管或其他的合适的脉管获得.DNA特殊技
术 [比如,吖啶橙(14) 或 Hoechst33258 多 pyronin-Y(15)] 能除
删除的内容: 治疗
删除的内容: 去
删除的内容: 祭品
172
去一些与使用有关的人工品的非DNA 特性污染. 这一优势不预先
排除传统的污染使用 (例如,Giemsa). 一些附加的系统,这些系统已
经被确定为能充分的为实验室工作的微核 [例如 纤维素除去有核的
细胞 (16)] 能也被用.
1.5.7. 分析
不成熟红细胞在总红细胞中所占的比例, 对每只动物来说, 至少应该
数 200个骨髓红细胞和 1000为周边的红细胞(17)来决定. 所有的玻
片(包括有阳性的和阴性的样品)都应该在用显微镜分析之前分别编
码.不成熟的微核红细胞由每个动物至少有2000 不成熟的红细胞来
刻划.将成熟的红细胞视为微核可以获得额外的信息. 当分析玻片的
时候,在总红细胞中, 不成熟的红细胞所占比例不应该比总样品数的
20%少. 当动物在4个或更多的星期中不断地被施以疗法时, 每个动
物至少有2000个成熟的红细胞也可以来刻划微核.如果经过充分证
明和认证.自动化分析的系统(图像分析和细胞中止流程 cytometry)
是可以接受的人工评估的变通办法.
2. 数据
2.1. 结果的处理
每个动物数据都应该以表格的形式呈交. 实验的基本单元是动物.
被刻划的不成熟的红细胞的数目, 不成熟的微核红细胞的数目, 和不
成熟的红细胞在总红细胞中的数目都应该被分别列出, 以有利于每
删除的内容: 正结果
删除的内容: 负结果的所有
删除的内容: 数字
删除的内容: 数字
删除的内容: 数字
173
只动物的分析. 当动物4个星期或更长的时间内被不断地施以疗法
的时候, 如果成熟红细胞的数据被收集了, 它也应该给出.每只动物
的不成熟的红细胞在总红细胞中的比例和微核红细胞的百分比(如果
可用的话)也应该给出. 如果没有不同性别有不同反应的迹象,来自
两性别的数据可以合起来进行统计分析.
2.2. 实验结果评价与分析
有几个评定阳性结果方法, 比如有一个与用药相关的微核细胞的数
目的增加或在单一抽样时, 在一个单一用药组中, 微核细胞的显著增
加. 结果的生物学相关性应该首先被考虑.在评估测定结果时统计
的方法可以被辅助使用(18).(19) 统计的重要性不应该是阳性响应的
唯一决定因素. 意义不明确的结果应该在对实验环境改进后进一步
的测定中澄清.
结果不符合上述的标准的测定物质被认为是在这一个测定没有致突
变作用.
虽然最大多数的实验将清楚给出肯定或否定的结果, 在少数情况下
数据将会过程标题有关测定物质的活动明确判断. 不管实验重复多
少次, 结果可能保持意义不明确的或可疑.
由微核测定的阳性结果可以推出, 物质引起有核红血球的微核染色
体的损害或有丝分裂的损害是一种负面的作用.否定的结果表明,在
这种测定条件之下,那测定物质不生产不成熟的红细胞的微核.
删除的内容: 评估及解释
删除的内容: 数字
删除的内容: 中的丝裂霉素C
删除的内容: 集
174
测定物质或它的新陈代谢产物达成一般的循环或明确地目标薄的纱
织品(例如,系统的毒性)的可能性也应该讨论.
3. 实验结果报告
测定结果报告
测定结果报告应该包括下列各项实验数据 :
溶剂/ 媒介物:
- 选择这种媒介物的理由,
- 在溶剂/ 媒介物中测定物质的溶解性和稳定性(若已知);
测定动物:
- 种类/ 种属
- 动物样品的数量,年龄和性别;
- 来源,居住情况,饮食,及其他.;
在测定的开始
- 动物样品的个别重量, 包括身体重量范围,
- 每个组的平均值和标准偏离;
测定情况 :
- 阳性和阴性 (媒介物/溶剂)对照组实验数据;
- 来自范围测定的实验数据;
删除的内容: 可溶性
删除的内容: 应变菌种
删除的内容: 搜索
175
- 选择剂量的基本原理;
- 准备测定物质的细节;
- 测定物质的管理细节;
- 管理方法的基本原理;
- 如果可行的话,查证测定物质达到一般循环或目标组织的方
法;
- 将饮食/饮用水的测定物质浓缩到实际剂量 (PPM) 的变异
(毫克/千克物体重/天),如果可适用;
- 食物和水质量的细节;
- 处理和抽取样品时间的详细说明;
- 切片准备的方法;
- 毒性测量的方法;
- 对微核不成熟的红血球的评估标准;
- 每一只被分析动物样品的细胞的数目;
- 就研究而言,如阳性,阴性或意义不明确的判别标准.
结果 :
毒性的征兆;
... 在总红血球之中不成熟的红血球的比例;
删除的内容: 载玻
删除的内容: ....
176
- 对于每只动物而言微核不成熟的红血球的数目,
- 每组微核不成熟的红血球的平均值+标准偏差;
- 剂量- 反应关系;
- 统计分析,和方法应用;
- 前期和同时进行的阴性对照组实验数据;
- 同时进行的阳性对照组实验数据.
结果讨论.
结论.
4. 参考文献
Heddle, J.A. (1973). A Rapid In Vivo Test for Chromosomal Damage,
Mutation Res., 18, 187-190.
Schmid, W. (1975). The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, 9-15.
Heddle, J.A., Salamone, M.F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K.,
MacGregor, J.G. and Newell, G.W. (1983). The Induction of Micronuclei
as a Measure of Genotoxicity. Mutation Res. 123: 61-118.
Mavournin, K.H., Blakey, D.H., Cimino, M.C., Salamone, M.F. and
Heddle, J.A. (1990). The In Vivo Micronucleus Assay in Mammalian
Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of the U.S. Environmental
Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 239, 29-80.
删除的内容: 个团体
删除的内容: 偏离
删除的内容: 回应
删除的内容: 以往
删除的内容: 并发
删除的内容: 并发
删除的内容: 的
177
MacGregor, J.T., Schlegel, R. Choy, W.N., and Wehr, C.M. (1983).
Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid Screen for
Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice. in:
"Developments in Science and Practice of Toxicology", Ed. A.W. Hayes,
R.C. Schnell and T.S. Miya, Elsevier, Amsterdam, 555-558.
MacGregor, J.T., Heddle, J.A. Hite, M., Margolin, G.H., Ramel, C.,
Salamone, M.F., Tice, R.R., and Wild, D. (1987) Guidelines for the
Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow
Erytrocytes. Mutation Res. 189: 103-112.
MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Henika, P.R., and Shelby, M.E. (1990). The
in vivo Erythrocyte Micronucleus Test: Measurement at Steady State
Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies.
Fund. Appl. Toxicol. 14: 513-522.
Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr.
(1990). The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood
Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides. Mutation Res., 245,
245-249.
The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992).
Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by
Acridine Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th
Collaborative Study by CSGMT/JEMMS. MMS. Mutation Res., 278,
178
83-98.
The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test
(CSGMT/JEMMS. MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of
the Environmental Mutagen Society of Japan)(1995). Protocol
recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus
test. Mutagenesis, 10, 153-159.
Hayashi, M., Tice, R.R., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blackey, D.H.,
Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr.F.B., Pacchierotti, F., Romagna, F.,
Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994). In Vivo Rodent
Erythrocyte Micronucleus Assay. Mutation Res., 312, 293-304.
Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995). An optimal, generalized sampling
time of 30 _ 6 h after double dosing in the mouse peripheral blood
micronucleus test. Mutagenesis, 10, 313-319.
Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile,
D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J.
and Rochold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK
Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo
Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, 313-319.
Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983). An Application of
Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test. Mutation
Res., 120, 241-247.
179
MacGregor, J.T., Wehr, C.M. and Langlois, R.G. (1983). A Simple
Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes
Using Hoechst 33258 and Pyronin Y. Mutation Res., 120, 269-275.
Romagna, F. and Staniforth, C.D. (1989). The automated bone marrow
micronucleus test. Mutation Res., 213, 91-104.
Gollapudi, B. and McFadden, L.G. (1995). Sample size for the estimation
of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone
marrow micronucleus test. Mutation Res., 347,97-99.
Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and
Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetics Assay. In: D.J. Kirkland (Ed.)
Basic Mutagenicity tests. UKEMS Recommended Procedures. UKEMS
Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part I,
revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester,
Melbourne, Sydney, pp. 115-141.
Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G.,
Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K. (1989).
Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays. In: D.J. Kirkland (Ed.)
Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS
Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part III.
Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester,
Melbourne, Sydney, pp. 184-232.
180
B.13 / 14. 诱变(性):利用细菌进行的回复突变测定
1. 测定方法
这一测量方法是OECD TG 471(经济合作与发展组织热重量分析法)
的重复,细菌的反向突变测定 (1997).
1.1. 引言
细菌的反向突变测定利用需求氨基酸的沙门氏typhimurium菌属和埃
希氏大肠杆菌来检测点突变, 其包括少数DNA碱基的置换,增加或缺
失 (1)(2)(3).细菌反向突变测定的原则是它检测突变,这些回复突变
出现在测试菌株中并且修复细菌合成一种基本氨基酸的能力.回复突
变菌株通过它在缺乏氨基酸的培养基中的生长而得到检测,而它的父
系对这种氨基酸是必需的.
点突变是许多人类遗传性疾病的成因并且有关于在致癌基因和肉细
胞的肿瘤抑制基因中的点突变与人类和动物样品样品的肿瘤形成有
关实质性的证据.细菌反向突变测定是快速, 廉宜和相对地容易的方
法.大部分测试菌株有使许多特征,折兑它们检测突变变的更敏感,
这些突变包括在回复位点DNA序列的响应,增加细胞对大分子的透
性,消除DNA修复系统的正常功能而增加错误倾向的DNA修复过程.
测试菌株的特征能对遗传毒性的试剂引起的突变类型能提供一些有
用的信息..为大范围结构种类而设的一个非常大的结果实验数据库
可用于细菌反向突变测定并且已确立的方法学已经为测定不同的物
删除的内容: the
删除的内容: 的氨基酸性的必
须的应变来发现
删除的内容: 替换附加或划除
一到几个DNA 基对
删除的内容: 它
删除的内容: 发现能恢复在测
定应变中呈现的突变和复位
细菌的功能能力以便综合一
必要的氨基酸的突变
删除的内容: 基因型细菌通过
在无被父系测定应变要求的
氨基酸环境下生长的能力被
发现
删除的内容: 的
删除的内容: 迅速
删除的内容: 实施
删除的内容: 定应变
删除的内容: 它们对包括一些
在回复位上,增长细胞浸透性
到大分子和除去DNA修复系
统或者有错误倾向的DNA修
复系统增加情况下响应DNA
序列的突变的发现更灵敏
删除的内容: 测定应变的特征
能提供一些关于被神经毒性
药剂衰减的突变类型的有用
信息
181
理化学药品包括挥发性的化合物而被发展.
见描述引言部份B.
1.2. 定义
回复突变测试是利用在沙门氏typhimurium或埃希氏大肠杆菌中测试
氨基酸(分别是组氨酸和色氨酸)需求的菌株通过突变变成不在需求
外源的氨基酸
碱基对替换突变是能导致DNA碱基改变的突变..在一个恢复测定中
这一变化可能在最初的突变位置发生, 或者在细菌基因组的第二位
置.
移码突变是能够引起DNA中一对或者更多的基对增加或缺失,从而
改变了RNA的读码结构的突变.
1.3. 初始条件
细菌反向突变测定利用原核细胞,其在很多方面不同于哺乳动物细胞
如摄取,新陈代谢,染色体结构和DNA修复过程中.在体外 引导下
的测定一般需要利用新陈代谢活化作用的外胚胎资源. 在体外(微
晶)下的新陈代谢活性系统不能够完全地模拟哺乳动物体内的系统.
因此测定不能提供关于测试物质对哺乳动物突变和潜在致癌的直接
信息.
细菌反向突变测定被广泛应用于遗传毒性活性,特别是点突变诱导的
删除的内容: 的反向变化测定
发现在氨基酸性的必须的应
变中的突变(组氨酸或色氨
酸,分别地) 生产一独立与外
部提供氨基酸的应变.
删除的内容: 基本
删除的内容: 诱导
删除的内容: 有机体突变物质
是引起在 DNA 方面的基本
改变的药剂
删除的内容: 的诱导
删除的内容: 有机体突变物质
是
删除的内容: 附加或划除的药
剂,如此变更 RNA 的读数结
构.
删除的内容: 在
删除的内容: 的因素
删除的内容: 活化
删除的内容: 模仿
删除的内容: 在
删除的内容: 活体
删除的内容: 条件下的
删除的内容: 哺乳动物
删除的内容: 物质性的诱导
删除的内容: 有机体突变的和
致癌的潜力
182
活性的广泛测试.足够多的实验数据显示很多化学物质在测试中显示
阳性,在其它测试中也显示诱变活性.有一些具有诱变活性的化学物
质在本测试中没有被检测出来,这些缺陷可以归咎于终点测试的特
性,新陈代谢活化作用的不同,或不同的生物药效.另一方面,提高
细菌反向突变测定的敏感因素能导致诱导有机体突变物质活动的过
度评估.
细菌反向突变测定不适用在化学药品某一级的评估,例如高度杀菌化
合物 (例如,某抗生素) 和那些被认为(或已知的)明确地妨碍哺乳
动物样品的细胞复制系统 (例如,一些局部异构酶抑制剂和一些核苷
类似物).在此情况下,哺乳动物样品的突变测定可能是更合理.
虽然在此测定中很阳性的许多化合物是哺乳动物样品的致癌物质,相
互关系不是绝对的.它依赖于化学药品级并且有不被此测定发现致癌
物质因为它们行动超过其他的非基因毒性的机制或在细菌的细胞中
绝少的机制.
1.4. 测定方法原则
细菌细胞的悬浮液接触于测试物质存在或缺少外生新陈代谢活化系
统中.在平板测试方法中,这些悬浮液同琼脂混合和立即被涂布在最
小的培养基之上.在预孵化方法中,处理好的混合物被孵化然后和琼
脂混合再涂布到最小的培养基上.对此两项技术而言,经二到三天的
孵化后,回复体群体被计算并与溶剂对照涂层上的自然产生的回复体
群体的数目相比较.
删除的内容: 作为一个为神经
毒性作用尤其为点突变诱导
作用的初始的掩体被普遍采
用.一个广泛的实验数据库展
示了在这个测定中很阳性的
并说明在其他的测定中诱导
有机体突变活动的许多化学
药品.有在测定中未被发现的
诱导有机体突变药剂的例子;
这些缺点的原因能归到
删除的内容: 观测
删除的内容: 的不同中
删除的内容: 不可能
删除的内容: 用
删除的内容: 神经毒
删除的内容: 存在的
删除的内容: 的测定
删除的内容: 镀层结合法中
删除的内容: 叠
删除的内容: 镀
删除的内容: 并且
删除的内容: 在电镀在
删除的内容: 前的同叠琼脂混
合
删除的内容: 在
删除的内容: 在有溶解控制力
的镀层
183
实施细菌反向突变测定的一些实验步骤已经被描述.在其中被普遍采
用是涂层结合法 (1)(2)(3)(4),预孵化法 (2)(3)(5)(6)(7)(8) ,流动法
(9)(10)和悬浮液法(11).气体或水汽测定的修正已经被描述为(12).
在方法中被描述的实验步骤主要属于涂层结合法和预孵化法.二者之
一对有或没有新陈代谢活化作用的引导实验均是可接受的.一些物质
可能被发现在预孵化法中使用更有效.这些物质属于包括短链脂肪族
亚硝胺,二价金属,乙醛,偶氮染料和二氮化化合物,pyrollizidine
生物碱,烯丙基化合物和硝基化合物(3)的化学级药品.一般能辨认
出诱导有机体突变的物质某一级不总是在用涂层结合法或预孵化法
的标准实验步骤中被发现.这应该被视为"特殊事例" 和一般强烈地
推荐可选择的实验步骤应该用于它们的研究.
下列各项 "特殊事例" 可以被识别 (连同可以用于探测的实验步骤的
例子一起): 含氮染料和二氮化合物的混合物(3)(5)(6)(13), 瓦斯和挥
发性化学物质 (12)(14)(15)(16) 和葡萄糖甙(17)(18). A来自标准的实
验步骤偏离需要科学的校正.
1.5. 测定方法的描述
1.5.1. 准备
1.5.1.1. 细菌
细菌的最初的培养直到指数晚期或平台生长时早期(大约每毫升 109
个细胞). 平台期晚期的培养物不应该被使用.在实验中被用的培养包
删除的内容: 镀层
删除的内容: 变动
删除的内容: 镀层
删除的内容: 镀层
删除的内容: 特别的情形
删除的内容: 特别的情形
删除的内容: 晚的
删除的内容: 早的静止
删除的内容: 在晚期静相中
删除的内容: 的
184
含一个高浓度活的细菌是必要的. 浓度测定可以从生长曲线上的以
往的实验数据或在每个测定中经过一个涂层培养活细胞数目的测定
实验.
被推荐的培育温度是 37 °C.
至少五种细菌的菌种应该被用. 这些应该包括四个菌种
S.typhimurium(TA 1535;TA 1537 或 TA97a 或 TA97;TA98;和 TA100)
是在不同实验室之间显示可靠和 可再生性的反应. 这四种
S.typhimurium 菌种有GC碱基对在主要的回复位置.一般情况下可能
不测定特定的氧化剂诱导有机体突变的物质.交联的试剂和水合物.
这些试剂可能被在主要回复位置有AT碱基对的大肠杆菌 WP2 菌种
或 S. typhimurium TA102(19)测定到因此被推荐的菌种的组合是:
– S. typhimurium TA1535,和
– S. typhimurium TA1537 或 TA97 或 TA97a,和
– S. typhimurium TA98,和
– S. typhimurium TA100,和
– E.大肠杆菌 WP2 uvrA,或 E.大肠杆菌 WP2 uvrA(pKM101),或 S.
typhimurium TA102.
为了要测定到交联的的诱导有机体突变的物质它最好包括 TA102
或E.coli 的DAN修补菌种. [ 例如. E.大肠杆菌 WP2 或 E.大肠杆菌
WP2(pKM101)]
删除的内容: 的
删除的内容: 测定能养
删除的内容: 电镀
删除的内容: 的能
删除的内容: 的
删除的内容: s在
删除的内容:
删除的内容: 基础
删除的内容: 基础
删除的内容: E.
185
应使用已成型的原料繁殖培养,标记物确认和储藏步骤. 氨基酸生
长需要在冰冻的繁殖培养皿中进行. (组氨酸对S. typhimurium 菌种
和,色氨酸对 E. 大肠杆菌菌种). 其他的显型应该同样地被检查,即:
是否在合适位置出现 R- 因子等离子体[如菌种 TA 中的 氨比西林
对抗在菌种TA98,TA100 和 TA97a 或 TA97 , WP2 uvrA 和 WP2
uvrA(pKM101),和 氨比西林 +四分染色体在对抗菌种 TA102]; 特征
突变的存在 (如rfa在S. typhimurium 中的突变在 S 中的变化.通过紫
色水晶的感光度和 uvrA在 E.大肠杆菌中的突变uvrB在S.
typhimurium中的突变,通过紫外光检验) (2)(3).菌种应该产生计算在实
验室的历史控制数据中的频率范围内的自然的回复突变等位基因群
体板块并在参考文献报道过的范围内.
1.5.1.2. 介质
使用一个合适的小琼脂 ( 例如包含最小的Vogel-Bonner媒介物 E 和
葡萄糖),和一个覆盖琼脂,包括组氨酸和维生素 H 或色氨酸用于少
数细胞分离,在(1)(2)(9)中使用过.
1.5.1.3. 新陈代谢活化
无论是否在一个合适的新陈代谢系统中,细菌都应该接触测定物质.
最普遍的系统是补体因子补充的从啮齿动物样品的肝脏中提取的酶
激发试剂(例如Aroclor 1254(1)(2)或本巴比妥和萘黄酮(18)(20)(21)处
理的线粒体片断.线粒体片断经常使用的浓度范围在S9-混合物,体
积比从5%到30%,新陈代谢活化系统的选择和条件可能依赖于被测
删除的内容: 媒质
186
化学物质的等级,在有些情况下,它可能对多于一种浓度的线粒体片
断适用.对azo- 染料和二氮化合物的-混合物使用一个还原新陈代谢
活化系统可能更适当 (6)(13).
1.5.1.4. 测定物质/准备
固体测定物质应该溶解或悬浮在合适的溶剂或媒介物中并且如果合
适的话就在处理前稀释,液体测定物质应该直接加到测定系统中并且
/或在处理前稀释.新鲜准备的应该使用,除非稳定数值证明储藏的
可接受性.
溶剂/媒介物不应该与测定物质化学反应,并且应该和细菌和S9活动
生存共处.如果不是用的众所周知的溶剂/媒质,它们的内含物应该
被它们的共有的预测实验数据所支持.可能的话建议首选水溶剂/媒
质.当测定对水不稳定的物质时候,使用的有机溶剂应该无水.
1.5.2. 测定情况
1.5.2.1. 测定菌种 (见1.5.1.1)
1.5.2.2. 暴露浓度
决定最高的使用的测定物质含量时,需要考虑到的标准条件之一是在
最后处理混合物时细胞的毒性和溶解度.
在初步的实验中决定的毒性和溶解度可能是有用的.细胞毒性可能通
过回复菌群数目的衰减被测定到.对菌苔生长背景的清除或缩小或所
处理的培养物的存活程度.一种物质细胞毒性可能随着新陈代谢系统
删除的内容: 延缓
删除的内容: 不符
187
的变化而变化.在实际测定条件下,很明显不溶物应该在最后的混合
物中作为沉淀.
我们推荐测定可溶的无细胞毒性的物质的最大浓度为五毫克每板或
五微升每板.对于溶解度小于五毫克每板或五微升每板的无细胞毒性
物质在最后处理混合物时应有一到多个被测浓缩物不溶.有细胞毒性
的待测物质的溶解度若已低于五毫克每板或五微升每板则应测到某
一细胞毒性浓度.记录时不应受沉淀物的影响.
在最初的实验中,至少要有五种不同的可分析的待测物质的浓缩物,
在测定点之间用半对数.当研究调查一个浓度- 反应曲线时使用较小
的间隔较为合适.在上述测定中,当评估确实含有能引导基因突变的
杂质时,应考虑五毫克每盘或五微升每盘的浓缩物.
1.5.2.3. 阴性和阳性的对照组
协同的特定菌种阳性的和阴性的对照组无论参不参与新陈代谢,都应
在每次测定中有所涉及.在测定中应选择有阳性反应的阳极对照组的
浓缩物.
对于涉及到新陈代谢系统的测定,应在所用细菌的菌种的类型的基础
上选择阴极对照组的参考物质.
下列各项物质为在涉及新陈代谢的测定中恰当的阳极对照组的例子.
CAS编号 EINECS编号 名称
删除的内容: 盘
删除的内容: 盘
删除的内容: 盘
删除的内容: 盘
删除的内容: 盘
删除的内容: 盘
删除的内容: 浓缩-
188
781-43-1 212-308-4 9,10-二甲基蒽
57-97-6 200-359-5 7,12-二甲基苯[α]蒽
50-32-8 200-028-5 苯并[α]芘
613-13-8 210-330-9 2-胺蒽
50-18-0 200-015-4 环瞵酰胺
6055-19-2 水合环瞵酰胺
下面的实验数据是对于减少新陈代谢活动的方法的一个恰当的阳极
对照组的例子:
573-58-0 209-358-4 刚果红
2-氨基蒽不能作为指示S9-mix效果的核心指示剂,如果使用它,应用
诱导有机体基因突变的物质标记每一组S9-mix,该物质需要通过微粒
体的酶诱发其新陈代谢作用.例如苯并[a]嵌二萘,二甲基苯并蒽.
下列各项物质是特殊菌种特殊的无外生的新陈代谢活化系统中阳性
对照组的例子.
26628-22-8 247-852-1 叠氮化钠 Ta 1513 and TA
100
删除的内容: 衰减
删除的内容: 动效
189
607-57-8 210-138-5 2-硝基芴 TA98
90-45-9 201-995-6 9-氨基氮蒽 TA 1537 ,TA97
and TA97a
80-15-9 201-254-7 Icumene 过氧化
氢物
TA 102
50-07-7 200-008-6 丝裂霉素 C WP2 uvrA and
TA102
70-25-7 200-730-1 N-乙基—乃春
-N-亚硝基胍
WP2,WP2uvrA
and WP2uvrA
(PKM101)
56-57-5 200-281-1 4-硝基萘-1-氧化
物
WP2,WP2uvrA
and
WP2uvrA(PKM1
01
17070-45-0 241-129-4 ICR 191 TA 1537 ,TA97
and TA97a
3688-53-7 呋喃基糠酰胺 含质粒菌株
可以使用其他的适当阳性参考物质,可能时应该考虑相关等级的阳性
190
化学物质.
应该对仅由溶剂或媒介物单独组成的没有测定物质的阴性对照组也
用同样的方法处理.另外,未处理的对照组也应该使用,除非由以往
的对照组实验数据证明选择的溶剂没有有害的或能引起突变的作用.
1.5.3. 实验步骤
对于板结合方法 (1)(2)(3)(4) ,没有新陈代谢活化作用,通常把0.05 毫
升或 0.1 毫升测定溶液,0.1新鲜的细菌的培养液(大约包含 108能成
活的细胞)和 0.5 毫升的无菌缓冲液和 2.0 毫升的琼脂混合. 对测定
新陈代谢活化作用,通常把 0.5 毫升的新陈代谢作用混合物包含足
够的线粒体部分(新陈代谢混合物的体积比范围从 5 到 30% v/v)
和叠琼脂 (2.0 毫升) 混合,并加入细菌和测定物质/测定溶液. 每管
的内容物是混合的并倾倒在最小的琼脂板的表面.琼脂在培育之前凝
固.
对于预培养方法 (2)(3)(5)(6) ,测定物质/测定溶液应该和测定菌种
(大约包含 108个能成活的细胞) 和无菌的缓冲液或0.5 毫升的新陈
代谢活化系统一起在35~37摄氏度在与琼脂混合之前和倒在最小琼脂
表面之前预培养. 通常把0.05 或 0.1 毫升测定物质/ 测定溶液 ,0.1
毫升细菌和 0.5 毫升的 S9-mix或无菌缓冲液和 2.0 毫升的琼脂混
合. 试管通常在预培养期间用一个振摇机通气.
对一个突变恰当的评估,每剂量应使用三层镀层.当科学证明其合理
时,允许使用复制的板.一个板偶然的活力消退并不代表测定无效.
删除的内容: 盘
删除的内容: 叠
删除的内容: 盘
删除的内容: 叠
删除的内容: 叠
删除的内容: 叠
删除的内容: 叠
删除的内容: 盘
删除的内容: 盘
删除的内容: 电力
191
气体或挥发性的物质应该用特定的方法测定,例如在封闭的容器中
(12)(14)(15)(16).
1.5.4. 培育
在给定的测定中所有的板应该在 37 °C 培育 48-72 小时. 在培育
时期后,计算每板回复突变的菌群的数目.
2. 实验数据
2.1. 结果的处理
实验数据中应该列出每板回复菌群的数目.在阳性和阴性(溶剂对照
组和未处理对照组)对照组板上回复菌群的数目都应该给出.每个板
的数目平均回复菌群数目/板和标准偏差应该在被测物质,阳性和阴
性(未处理的和/或溶剂)对照组列出.
不要求证实一个确切的阳性反应.不明确的结果应该是用一个修改过
的更好的实验条件进一步测定以弄清楚.阴性结果需要在事实依据的
基础上确定,在这些事实中,不需要考虑阴性结果的证实,只需提供
理由.修改研究参数已扩大评估条件的范围,应该考虑以下的实验.
可能修改的研究参数包括浓度差,处理方法(板合并或液体预培养)
和新陈代谢活化条件.
2.2. 实验结果评价与分析
决定一个阳性结果有几个标准,例如与浓度有关的超过测定范围的增
删除的内容: 盘
删除的内容: 盘
删除的内容: 盘
删除的内容: 盘
删除的内容: 盘
删除的内容: 盘
删除的内容: 盘
删除的内容: 评估和解释
192加和/或一个在一个或更多个浓度能再生产的增加.这些浓度是在每
板回复菌群的数量在至少一个有或没有新陈代谢活化系统的菌种.应
首先考虑结果的生物关系.统计方法应该作为辅助评估测定结果的工
具(24).然而,统计的意义不应该是唯一决定阳性反应因素.
一个测定物质,它的结果若不符合上述标准,应认为它在这个测定中
时不引起突变的.
虽然大多数的实验将会清楚地给出阳性或阴性结果,在稀少的情况下
实验数据放置将会排除作有关测定物质活性的一个明确的判断. 结
果可能保持不明确性或可疑性,不管重复多少次测定.
细菌的反向突变测定的阳性结果说明物质通过替代或移码方式来诱
导点突变在沙门氏菌typhimurium 及大肠杆菌. 阴性结果显示那在测
定之下情况,测定物质在被测定的种方面不是诱导有机体突变的物质.
3. 实验结果报告
测定结果报告
测定结果报告必须包括下列信息 :
溶剂/媒介物:
- 选择溶剂/媒介物的理由
- 测定物质在溶剂/媒介物中的溶解度和稳定性
- 菌种
删除的内容: 盘
删除的内容: 回应
删除的内容: 颠倒异变
删除的内容: 以基本取代或框
架替换的方式异变
删除的内容: .一边是
删除的内容: 在任一的染色体
组中指出恶劣的替换或移码
突变的变化
删除的内容: 指示
193
- 使用的菌种;
- 每份培养液中的细胞数目
- 菌种特性.
测定条件::
- 每板测定物的量 (毫克/板或微升/板)和剂量选择的理论依据
以及每个浓度的板数
- 使用的介质
- 新陈代谢活化系统的类型和组分包括可接受标准
- 处理实验步骤
结果 :
- 毒性迹象
- 沉降迹象
- 每板容量
- 每板回复菌群的平均数目及标准偏差
- (在可能的地方)剂量-回应关系
- 统计学分析(如果有)
- 同时进行的阳性(溶剂/媒质)和阳性对照组实验数据,并附
上范围,平均值和标准偏差-以往的同时进行的阳性(溶剂/
删除的内容: 盘
删除的内容: 有
删除的内容: 盘
删除的内容: 盘
删除的内容: 盘
删除的内容: 标志
删除的内容: 沉淀标
删除的内容: 志
删除的内容: 盘
删除的内容: 盘
删除的内容: 并发
删除的内容: 并发
194
媒质)和阳性对照组实验数据,并附上范围,平均值和标准
偏差
结果的讨论.
结论.
4. 参考文献
Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki E. (1975). Methods for Detecting
Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome
Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, 347-364.
Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983). Revised Methods for the
Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, 173-215.
Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., Matsushima,
T., Melcion, C., Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, E. (1994).
Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays.
Mutation Res., 312, 217-233.
Kier, L.D., Brusick D.J., Auletta, A.E., Von Halle, E.S., Brown, M.M.,
Simmon, V.F., Dunkel, V., McCann, J., Mortelmans, K., Prival, M., Rao,
T.K. and Ray V. (1986). The Salmonella typhimurium/Mammalian
Microsomal Assay: A Report of the U.S. Environmental Protection
Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 168, 69-240.
Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y.Y., Matsushima, T., Nagao, M.,
195
Sugimura, T. and Hashimoto, Y. (1975). Mutagenicity of Carcinogen Azo
Dyes and their Derivatives, Cancer Letters, 1, 91-96.
Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, A. and
Sawamura, M. (1980). Factors Modulating Mutagenicity Microbial Tests.
In: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens. Ed. Norpoth K.H.
and Garner, R.C., Springer, Berlin-Heidelberg-New York. pp. 273-285.
Gatehouse, D.G., Rowland, I.R., Wilcox, P., Callender, R.D. and Foster, R.
(1980). Bacterial Mutation Assays. In: Basic Mutagenicity Tests:
UKEMS Part 1 Revised. Ed. D.J. Kirkland, Cambridge University Press,
pp. 13-61.
Aeschacher, H.U., Wolleb, U. and Porchet, L. (1987). Liquid
Preincubation Mutagenicity Test for Foods. J. Food Safety, 8, 167-177.
Green, M.H.L., Muriel, W.J. and Bridges, B.A. (1976). Use of a
simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens. Mutation Res.,
38, 33-42.
Hubbard, S.A., Green, M.H.L., Gatehouse, D. and J.W. Bridges (1984).
The Fluctuation Test in Bacteria. In: Handbook of Mutagenicity Test
Procedures. 2nd Edition. Ed. Kilbey, B.J., Legator, M., Nichols, W. and
Ramel, C., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 141-161.
Thompson, E.D. and Melampy, P.J. (1981). An Examination of the
Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with Strains of
196
Salmonella typhimurium. Environmental Mutagenesis, 3, 453-465.
Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and T. Matsushima (1994). Improved
Method for Mutagenicity Testing of Gaseous Compounds by Using a Gas
Sampling Bag. Mutation Res., 307, 335-344.
Prival, M.J., Bell, S.J., Mitchell, V.D., Reipert, M.D. and Vaughn, V.L.
(1984). Mutagenicity of Benzidine and Benzidine-Congener Dyes and
Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay. Mutation Res.,
136, 33-47.
Zeiger, E., Anderson, B.E., Haworth, S., Lawlor, T. and Mortelmans, K.
(1992). Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311
Chemicals. Environ. Mol. Mutagen., 19, 2-141.
Simmon, V., Kauhanen, K. and Tardiff, R.G. (1977). Mutagenic Activity
of Chemicals Identified in Drinking Water. In Progress in Genetic
Toxicology, D. Scott, B. Bridges and F. Sobels (Eds.) Elsevier,
Amsterdam, pp. 249-258.
Hughes, T.J., Simmons, D.M., Monteith, I.G. and Claxton, L.D. (1987).
Vaporization Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile
Organic Chemicals in the Ames/Salmonella Assay. Environmental
Mutagenesis, 9, 421-441.
Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M., and Sugimura,
T. (1979). Mutagenicity of the Naturally Occurring Carcinogen Cycasin
197
and Synthetic Methylazoxy Methane Conjugates in Salmonella
typhimurium. Cancer Res., 39, 3780-3782.
Tamura, G., Gold, C., Ferro-Luzzi, A. and Ames, B.N. (1980). Fecalase: A
Model for Activation of Dietary Glycosides to Mutagens by Intestinal
Flora. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4961-4965.
Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D.J. and Gatehouse, D.G. (1990).
Comparison of Salmonella typhimurium TA 102 with Escherichia coli
WP2 Tester strains. Mutagenesis, 5, 285-291.
Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976). A Safe
Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer or Metabolic
Activation Systems. In: "In Vitro metabolic Activation in Mutagenesis
Testing" Eds. F.J. de Serres et al. Elsevier, North Holland, pp. 85-88.
Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson,
G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992). Alternatives to Aroclor
1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7,
175-177.
Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B.N. (1981). Compatibility of
Organic Solvents with the Salmonella/Microsome Test. Mutation Res., 88
343-350.
Claxton, L.D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nestmann, E. and
Zeiger, E. (1987). Guide for the Salmonella typhimurium/Mammalian
198
Microsome Tests for Bacterial Mutagenicity. Mutation Res. 189, 83-91.
Mahon, G.A.T., Green, M.H.L., Middleton, B., Mitchell, I., Robinson,
W.D. and Tweats, D.J. (1989). Analysis of Data from Microbial Colony
Assays. In: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity
Testing. Part II. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Ed.
Kirkland, D.J., Cambridge University Press, pp. 28-65.
199
B.15.诱变性测定和致癌基因变异监测-啤酒酵母基因
1.测定方法
1.1.引言
见总引言的B部分
1.2.定义
见总引言的B部分
1.3.参考物质
无
1.4.测定方法原则
许多单倍体和多倍体的酵母可以用来测量有或没有新陈代谢活动时
由化学试剂诱导的基因突变产物.
单倍体系科的反向突变系统,譬如测定从红色的腺嘌呤突变异种到双
倍的白色腺嘌呤突变异种已经使用.选择性系统,譬如抵抗刀豆氨酸
和放线菌酮的诱导突变也已开始使用.
被广泛证实的反向突变体系是单倍体系科XV185-14C的使用,它携
带黄土色无意义的基因材料 ade 2-1,arg 4-17,lys 1-1和trp 5-48,这些
可被诱导土黄色抑制突变的取代基因撤消.XV185-14C还携带his1-7
制造者,它可由二次变异回复,hom 3-10制造者由突变碎片回复.
删除的内容: 变异
删除的内容: 反异
删除的内容: 变
200在S.cerenisiae 双倍体品系中仅被广泛使用的品系是ilv1-92纯合体
D7.
1.5.质量标准
无
1.6.测定方法的描述
准备
在测定之前选用一种合适的溶剂把测定化学药品溶解.若是非水溶性
的有机化合物,应使用溶解度不超过2%(V/V)有机溶剂,如乙醇,
丙酮或DMSO将其溶解.溶剂的最终浓度不能显著的影响细胞的生
活体和生长特性.
新陈代谢活动
将细胞在存在和不存在外加物质交替系统的条件下接触给化学药品.
最普遍使用的体系是从用酶诱导基因预处理过的啮齿类动物样品的
肝脏中提取的线粒体馏分.其他品系的使用,组织结构,线粒体馏分
或实验步骤也可能适合用作物质交替.
测定条件
测定品系
单倍体XV185-14C 多倍体品系D7是基因突变研究中用的最多的.其
它品系也可能合适.
删除的内容: 酵素
201媒介
合适的培养基液环境被用来测定残存和变异的数量.
阳性阴性对照组测定的使用
应该同时做阳性的,未处理的,溶解的对照组测定.合适的阳性对照
组化学药品应用于每个品系的突变终点.
接触浓度
至少应用五种合适的浓度间隔的测定物质.对于毒性物质,最高浓度
不应使存活率低于5~10%.相对水溶性物质应用合适的溶剂配成饱和
溶液.对于水溶性的非毒性物质,浓度的上限应由实验来确定.
培育条件
培养皿应置于28到30℃的环境中在黑暗中培育四到七天.
自然突变频率
培养液应在可接受的阳性常范围内用于自然突变频率.
重复实验的数目
为分析由基因突变产生的原养型和细胞的生活体,每种浓度至少要用
三个相同的培养皿.若是使用像hom3-10的突变速度低的制造者,
必须增加培养皿的数目以提供有意义的统计实验数据.
步骤
S.cerenisiae品系的处理通常在液体测定中用间歇期或增殖期的细胞.
删除的内容: 异变
202
最初的测定应用增殖期细胞:在振荡下将1-5x107细胞/毫升在28~37
℃接触给测定化学药品长达18小时;适量的物质交替系统在处理中
适时加入.在处理末期,将细胞离心,洗涤,种植在合适的培养环境
中,培养皿根据存活的和变异的细胞作记号.
如果第一个实验是阴性的,那么第二个实验应该用间歇期的细胞做.
如果第一个实验是阳性的,应用适合的独立的实验来证实.
2. 实验数据
实验数据应写成表格的形式,说明细菌的数目,突变的数目,存活的
数目和突变频率.所有结果应在独立的实验中证实.实验数据应用合
适的统计方法进行评估.
3.实验结果报告
3.1.测定结果报告
测定结果报告应尽可能包含以下信息:
- 所用的生物品系;
- 测定条件,间歇期细胞或增殖期细胞,环境的组成,培养温
度,持续时间,物质交替系统;
- 处理条件,接触水平,步骤和处理时间,处理温度,阳性阴
性对照组测定;
- 细菌的总数目,突变数目,存活数目,突变频率,剂量/响应
203
关系,实验数据的统计评估.
- 结果讨论
- 结果的解释与说明
3.2.实验数据和评估
见B部分的总引言
4. 参考文献
204
B.16啤酒酵母作用下的染色体重组
1.测定方法
1.1.引言
见总引言的B部分
1.2.定义
见总引言的B部分
1.3.参考物质
无
1.4.测定方法原则
在基因之间(或更为普遍地在一个基因及其着丝点之间)和基因内部
的有丝分裂遗传因子重组可被探知.前者被称为有丝交叉互换,产生
倒易移位,而后者被称为基因转换.基因交叉互换通常由隐性纯合体
种群或由杂合体品系产生的种群来测定,而基因转换则由原养型回复
突变者测定.探知有丝分裂基因转换最常用的品系是D4(异等位基因
at ade2and trp5)D7(异等位基因at trp 5)BZ34(异等位基因at arg 4)和
JD1(异等位基因at his 4and trp5).有丝分裂交叉互换产生红色和粉红
纯合体种群可用D5或D7(也测定有丝分裂基因转换和在ilv1-92的反
突变).
205
1.5.质量标准
无
1.6.测定方法描述
准备
测定化学药品和参照物的溶解必须在测定之前准备好,用一合适的溶
剂.对于非水溶性的有机物用溶解度不超过2%(V/V)的溶剂如乙
醇,丙酮或DMSO溶解.溶剂的最终浓度不能显著影响细胞的生活
和生长特性.
新陈代谢活动
将细胞在存在和不存在外加新陈代谢系统的条件下接触给化学药品.
最普遍使用的体系是从用酶诱导基因预处理过的啮齿类动物样品的
肝脏中提取的线粒体馏分.其他品系的使用,组织结构,线粒体馏分
或实验步骤也可能适合用作物质交替.
测定条件
测定生物品系
用的频率最高的品系是双倍体D4,D5,D7和JD1.其它品系的使用也可
能合适.
介质
用合适的培养介质来测定存活率和有丝分裂的频率.
删除的内容: 体
删除的内容: 物质交替
删除的内容: 酵素
删除的内容: 基液环境
删除的内容: 基液环境
删除的内容: 用
206
阳性阴性对照组测定的使用
应该同时做阳性的,未处理的,溶解的对照组测定.合适的阳性对照
组化学药品应用于每个品系的异变终点.
接触浓度
至少应用五种间隔浓度的测定物质.其中需要考虑的因素是毒性和溶
解度.最低浓度必须对细胞的生存能力不产生影响.对于毒性化学药
品,最高测定浓度不能将生存率降低到5~10%以下.相对非水溶性化
学药品应用合理的步骤达到溶解极限.对于水溶性的非毒性物质,其
浓度上限应由实验测定.
细胞应在间歇期或增殖期接触给测定化学药品长达18小时.然而,
被长期处理的培养基应在显微镜下检查是否有孢子形成,若有表明测
定无效.
培养条件
应将培养皿置于28~30℃的黑暗环境中达四到七小时.用来分析由有
丝分裂基因互换所产生的红色和粉红色的培养皿应置于约4℃的冰箱
中两天后,做记号,使合适的色素细菌生长.
自然有丝分裂频率
使用潜在的培养确定自然有丝分裂频率在可接受的正常范围内.
重复测定的数目
为分析有丝分裂产生的原养型及其生存力,至少需要三个同样的培养
删除的内容: 基液
删除的内容: 胚芽
删除的内容: 长
删除的内容: 液
删除的内容: 应
删除的内容: 阳性
删除的内容: 用于自然有丝分
裂频率
207
皿.若分析由有丝分裂交叉互换产生的隐性纯合体,培养皿数目必须
增加以提供足够多的种群数目.
步骤
S.cerenisiae品系的处理通常在液体测定中用间歇期或增殖期的细胞.
最初的测定应用增殖期细胞:在振荡下将1-5x107细胞/毫升在28~37
℃接触给测定化学药品长达18小时;适量的物质交替系统在处理中
适时加入.
在处理末期,将细胞离心,洗涤,培养在合适的环境中,培养皿根据
存活的和变异的细胞作记号.
如果第一个实验是阴性的,那么第二个实验应该用间歇期的细胞做.
如果第一个实验是阳性的,应用适合的独立的实验来证实.
2.实验数据
实验数据应该写成表格的形式,表明细菌的总数目,基因重组的数目,
存活的数目以及重组的频率.
结果应由独立测定证实.
实验数据应用合适的统计方法评估.
删除的内容: 种植
删除的内容: 培养
208
3.实验结果报告
3.1.测定结果报告
测定结果报告应尽可能包含以下信息:
- 所用的生物品系;
- 测定条件,间歇期细胞或增殖期细胞,环境的组成,培养温
度,持续时间,物质交替系统;
- 处理条件,接触水平,步骤和处理时间,处理温度,阳性阴
性对照组测定;
- 细菌的总数目,突变数目,存活数目,突变频率,剂量/响应
关系,实验数据的统计评估.
- 结果讨论
- 结果的解释与说明
3.2.实验数据和评估
见总引言的B部分
4.参考文献
见总引言的B部分
209
B.17.基因突变—IN 体外 哺乳动物细胞的基因突变测定
1.测定方法
此方法是和OECD TG476,哺乳动物细胞基因突变测定(1997)同样
的测定.
1.1.引言
体外哺乳动物基因突变测定可被用来探知由化学物质诱导的基因突
变.合适的细胞群包括L5178Y老鼠淋巴瘤细胞,CHO,CHO-AS52
和中国大鼠细胞的V79阵列,以及TK6人类淋巴胚细胞.在这些细
胞阵列中,最常用的是TK,HPRT,和XPRT.TK,HPRT和XPRT探知不
同幅度的基因事件.TK和XPRT可以探知常染色体的基因事件,但
不能探知X染色体,而HPRT可以.
在哺乳动物基因突变测定中,可用建立细胞阵列或细胞品系的培养环
境.细胞根据在培养液中的生长能力和自然有丝分裂频率的稳定性来
选择.
测定基本都需要外加物质交替环境.这物质交替环境不能完全模仿哺
乳动物样品的生长条件.应注意控制条件避免导致结果不能反映特属
于某器官的突变.不能反映内部突变的阳性结果可能是由于PH值的
改变或毒性太高.
这个测定被用来测定可能的哺乳动物基因突变和诱癌因素.许多在此
测定中呈阳性结果的化合物是生癌物质.然而,这个测定和致癌之间
删除的内容: 阵列
210
无绝对的关联.这种关联决定于药品种类.越来越多的证据表明还有
不少诱癌因素这个测定不能探知,它们似乎是通过其它细菌细胞中没
有的机制起作用.
见B部分的总引言.
1.2.定义
正向突变:从亲代类型突变导致催化合成基因对应的蛋白质的酶的功
能丧失或改变.
碱基替代突变:物质使DNA的一对或几对碱基发生突变.
移码突变:物质使DNA分子中的一个或成对的碱基发生增添或缺失.
表现型表达时间:未改变的基因被新改变的基因替代的时间.
突变频率:观察到的变异的细胞数除以总的细胞数.
相对总增长:随着时间的过去,细胞数目相对于控制细胞数的增长.
计算相对于阴性测定的间歇期增殖数目乘以相对于阴性测定的繁殖
效率.
相对间歇期增长量:表达期过后相对于阴性测定的细胞增长数目.
生活体:表达期后在选择条件下的培养皿中,被处理细胞的繁殖率
存活率:在处理结束时被处理细胞的繁殖率;存活率通常以与控制细
胞数相比的形式表示.
删除的内容: 未来
删除的内容: 酵素在
删除的内容: 译码功能变更或
一时
删除的内容: 成对取代
删除的内容: 染色体
删除的内容: 单倍体或多倍体
的
删除的内容: 成
删除的内容: 染色体
删除的内容: 用尽
删除的内容: 能生长发育
211
1.3.测定方法原理
细胞中胸苷激酶(TK)缺陷,由于突变新种TK+/....>TK-/-抵抗TFT的
毒性效应的.TK细胞对TFT敏感,从而抑制了细胞的新陈代谢,并
阻止了进一步的细胞分裂.因此,突变细胞在TFT存在下可以增生,
而正常的含TK的细胞却不能.类似地,在HPRT或XPRT中有缺陷
的细胞是通过对TG和AG的抵抗而被选择的.在哺乳动物基因突变
测定中,若被测物是与选择性试剂有关的主要基础类似物或一化合
物,则应该仔细判断测定物的性质.例如,对突变细胞和非突变细胞,
任何被怀疑对测定物毒性的选择性试剂都应仔细研究.因此,当测定
化学药品与选择性试剂结构相关时,选择性体系或试剂的使用必须被
证实可行.
将处于间隔期或单分子培养基的细胞在有和没有物质交替的环境中
加入测定物,一段合适时间后再做次培养以确定毒性,并在变异选择
之时使形状得以表达.毒性通常用测定相对繁殖效率(存活率)或处
理期以后的相对总增长(存活率)来确定.处理液使在生长环境中经
过充足的时间获得的,从而使诱导新种的性状得到最佳的表达.测定
突变频率是将已知数目的细胞置于包含选择性试剂的环境中探知突
变细胞,再将已知数量的细胞置于不含选择性试剂的环境中测定繁殖
效率(存活率).经过一段合适的培养时间,点数细菌数目.突变频
率从选择性环境中的突变突变细菌数目和非选择性环境中的突变数
目推得.
删除的内容: 原则
删除的内容: 在
删除的内容: 中是有
删除的内容: 的
删除的内容: 异变
删除的内容: 变异
删除的内容: 阳性
删除的内容: 异变
删除的内容: 异变
删除的内容: 性
删除的内容:
删除的内容: 有
212
1.4. 测定方法描述
1.4.1. 准备
1.4.1.1细胞
此测定中使用了大量的细胞类型,包括L5178Y,CHO,CHO-AS52,V79
或TK6 细胞.此测定所用的细胞类型必须对化学诱变剂有显著的敏
感性,繁殖率高,还要有稳定的自然突变频率.细胞必须检查是否被污
染,若被污染则不能使用.
测定设计时要预先确定测定限和准确度.细胞数,基液和测定物浓度
应反映这些参数.处理后仍存活的最小细胞数目及测定每阶段所用的
最小细胞数取决于自然突变频率.经验规律是用自然突变频率反函数
十倍的细胞数.尽管如此,建议使用最少106个细胞.足够的细胞体
系的历史资料可用来指示可靠的测定操作.
1.4.1.2.介质和培养条件
应选用合适的介质以及培育条件(培养容器,温度,CO2浓度和温度)
培养应根据测定中选择性体系和细胞类型来选择.培养条件的选择尤
其重要,要使之确保表达期细胞的最佳生长以及变异和非变异细胞的
增殖能力.
1.4.1.3.培养的准备
细胞是从繁殖培养液中增殖的,于37℃在培养液中种植和培育.在
此测定之前,必须除去先前存在的突变细胞.
删除的内容: 培养液的环境条
件
删除的内容: 使用
删除的内容: 培养液环境
删除的内容: 液
删除的内容: 液
删除的内容: 液
删除的内容: 环境
213
1.4.1.4.新陈代谢活动
细胞应当存在于有或没有合适的新陈代谢活性的系统中.
最普遍使用的系统是从用酶诱导基因预处理过的啮齿类动物样品的
肝脏中提取的线粒体馏分.
在最终的测定环境中,馏分通常以浓度(V/V)为1~10%的溶液使用.
物质交换体系条件的选择取决于被测定化学药品的等级.在某些情况
下,可用不止一种浓度的馏分.
基因工程细胞阵列的建构,表达特种催化酶等许多发展可能提供内部
活化的可能性.所使用细胞阵列的选择必须有科学的依据.
1.4.1.5.测定物质/准备
固态测定物应用合适的溶剂溶解或悬浮在合适的媒介中,并在处理细
胞之前进行稀释.液态测定物可直接加入测定体系中,或在处理前稀
释.应使用新鲜制备的测定物,除非可靠的实验数据证明贮存物的可
行性.
1.4.2.测定条件
1.4.2.1.溶剂/介质
溶剂或媒介不可以与测定物质发生化学反应,而且可与生存的细胞及
S9活动相容,若所用溶剂不是常用溶剂,应用实验数据证明其组成
的可行性.如果有可能,应优先考虑含水溶剂,当测定物遇水不能稳
定存在时,有机溶剂应除水.可加入分子筛除水.
删除的内容: 将
删除的内容: 在存在和不存在
外加物质交替系统的条件下
接触给化学药品
删除的内容: 体系
删除的内容: 酵素
删除的内容: 酵素
删除的内容: 证明
删除的内容:
214
1.4.2.2.接触浓度
决定最高浓度时考虑的因素有,测定体系中的溶解度,PH的改变.
应该在主测定中用一指示细胞完整和生长的指示剂在有和无新陈代
谢活动时测定相对繁殖率(存活率)或相对总增长,从而得出毒性.
在初步测定中测定毒性和溶解度是有用的.
至少要用四种可分析的浓度.当有细胞毒性时,这些浓度分布需从最
大到几乎无毒性.这通常意味着浓度水平应被仅仅介于2和10的因
素分隔.若最大浓度建立在细胞毒性的基础上,则它应该导致约
10~20%的的相对存活率(相对繁殖率)或相对总增长.对于相对无
毒的物质,最大测定浓度应该为5mg/ml,5ul/ml或0.01M.
相对不溶物的测定量应达到或超过其溶解极限.不溶物的证据应在细
胞接触的最终处理环境中决定.在处理初始和结束时评估溶解度是有
益的,因为由于细胞,S9,乳浆等的存在,在测定中接触的过程中,
测定物的溶解度会发生变化.不溶物用肉眼观察.沉淀物不可以干扰
现象记录.
1.4.2.3.对照组测定
每个测定都必须包含阳性阴性对照组测定,包含有和没有新陈代谢活
动的测定.当新陈代谢活动被使用时,阳性对照组测定需要有一活化
作用来给出突变响应.
阳性对照组测定物质示例有:
删除的内容:
删除的内容: 读
删除的内容: 性
删除的内容: 独眼探知
删除的内容: 刻痕
删除的内容: 物质交替体系
215
新陈代
谢活动
情况
座位 物质 CAS NO. EINECS
NO.
HPRT 甲磺酸乙脂
乙基甲硝基脲
62-50-0
759-73-9
2000-536-7
212-072-2
TK(大小
菌群)
甲磺酸乙脂 66-73-3 200-625-0
外生新
陈代谢
作用的
缺乏
XPRT 甲磺酸乙脂
乙基甲硝基脲
62-50-0
759-73-9
200-536-7
212-072-2
HPRT 3-Methcholanthrene
N-亚硝基二甲胺
7,12-Dimethylbenza
nthracene
56-49-5
62-75-9
57-97-6
200-276-4
200-549-8
200-359-5
存在外
生新陈
代谢作
用
TK(大小
菌群)
环磷酰胺
一水环磷酰胺
Benzo[a]pyrene
3-甲基胆蒽
50-18-0
6055-19-2
50-32-8
56-49-5
200-015-4
200-028-5
200-276-5
216
XPRT N-亚硝基二甲胺
( S-9 高标准 )
Benzo[a]pyrene
62-75-9
50-32-8
200-549-8
200-028-5
其他合适的正参考物质参考物质也可被使用,比如,若一实验室有基
于5-溴-2'- deoxyuridine[CAS n,59-14-3,EINECS n.200-415-9],这
一参考物质也是可用的..在使用正参考物质的化学同系物时,其作
用应首先被确认.
负参考物质,包括溶剂,在处理媒质中单独使用的载色剂,以及以相
同方法处理的组分都应包括在内.另外,无处理参考物质也应包括在
内,除非有历史实验数据证明所选用的溶剂无毒并不会引起基因突
变.
1.4.3.步骤
1.4.3.1.测定物处理
无论是否具有新陈代谢作用的增殖细胞都应接触预测定物质中.接触
时间应适当(有效时间一般为三至六小时).接触时间应长达一个或
几个细胞周期.
单处理载体或其副本在每个浓度测定中都应被使用.单处理载体在使
用适应适当被浓缩以保证有足够适量载体以供分析.(例如,至少8
个单位的分析浓度).副本的负调控载体(溶剂)也应被应用.
删除的内容: 参考物质
删除的内容: 监控
217
气态或易挥发的物质应用适当方法分析,比如在密封容器中(21)(22).
1.4.3.2.残存物质生存能力和突变频率的测量
在接触时间结束时,细胞被洗涤和栽培后测定残留物,并进一步用来
表征发生突变的有共同表现型的生物群.可通过决定相关细胞系培养
的功效(残留物)或有关培养机制的总增重来测量细胞毒素.而这一
过程,一般在处理后开始进行.
为了让新增的突变个体得到最佳的共同表现型的生物群的表征,每个
座位都应有最小时间的限定( HPRT和XPRT至少6～8天,TK
至少两天).细胞分别在加了有选择性和无选择性药剂的媒介中生长,
以确定突变个体的个数和细胞体系培养的功效.在表征结束时可开始
生存能力的测量(用于计算突变个体的数目).其测量是通过在无选
择媒质中栽培进行的.
若测定物在L5178YTK+/-测定中为正反应,菌群应在正负参考物质情
况下控制在至少一个测定载体大小(最高正反应浓度).如果测定物
质在L5178YTK+/-测定中为负反应,菌群大小受正负参考物质影响.
在研究使用L5178YTK+/-时,菌群大小也受反应影响.
2.实验数据
2.1.实验结果处理
实验数据应包括细胞毒性,生存能力测定,菌群数目,突变个体的数
目,以供处理和调控载体.在L5178YTK+/-测定中为正反应的情况下,
218
菌群按其大小的判别标准标记.标记时应使菌群在至少单位浓度的测
定物质(最高正反应浓度)和正负参考物质下进行.
大小菌群突变个体的分子及细胞遗传性质都应被仔细研究(23)(2
4).在L5178YTK+/-测定中,菌群按常速生长(大)及慢速生长(小)
的判别标准标记(25).受最广泛遗传损坏的突变细胞时间延长至
两倍,因此形成小菌群.其损坏程度在丧失全部遗传因子和产生明显
的染色体组基因突变之间.小菌群的诱导效应是与诱导全部染色体发
生变异的化合物相联系的(26).未发生严重变异的细胞像其亲代
细胞一样在老鼠体内生长,并形成大的菌群.应给出残留量(相关细
胞群培养功效)或相关的总生长情况.突变频率表示为突变细胞在存
活的细胞总数中的比率.单个细胞的数据也应当被提供.另外,所有
实验数据都应按表格形式总结.无需确定明显的阳性反应,不确定的
实验结果需改变测定条件后进一步明确.阴性结果需按情况讨论,在
那样的情况下无需对阴性反应结果进行证实,但其理由应被证实.在
实验结果不明确或出现负反应时,若要修改测定参数,则需通过做跟
踪实验来确定.包括浓度间隔和新陈代谢活动情况在内的研究参数可
被修改.
2.2.实验结果评价与分析
测定突变个体有许多标准,比如相关浓度的增长,突变个体数目的可
繁殖增长.应首先确定结果之间的生物学关系.统计学方法可作为统
计测定结果的辅助,但统计不仅仅在阳性反应方面有意义.
删除的内容: 应按单位擦六细
胞中发生突变的细胞数目表
达.
删除的内容: 单独载体的实验
数据应被证实,
删除的内容: 政反馈
删除的内容: 负
删除的内容: 负
删除的内容: 评估和测定
删除的内容: 正反馈事实
219
不符合上述标准的测定物质则被认为不能引起基因突变.
虽然大多数研究可给出明确的阳性,阴性反应结果,但在极少数情况
下,实验数据无法给出测定物活性的明确评价.无论重复多少次测定,
仍会有些结果是不明确或存在疑问的.
体内 哺乳动物细胞基因突变测定的正结果表明测定物质引起被培养
动物细胞的基因突变.可重现的正浓度反应非常有意义.测定条件下,
阴性反应表明被测定物质不引起被培养的动物细胞的基因突变.
3.实验结果报告
测定结果
测定结果应包括以下信息:
溶剂/介质
- 选择溶剂/介质的理由;
- 测定物质在溶剂/赋形剂中的溶解度和稳定性,如果知道的
话.
细胞
- 细胞的种类和来源;
- 细胞载体的数目;
- 细胞通过的数目,如果适合;
删除的内容: 正,负反应
删除的内容: 活体
删除的内容: 负结果
删除的内容: 赋形剂
删除的内容: 赋形剂
220
- 维持载体的方法,如果适合;
- 不存在支原体.
测试条件
- 选择浓度和载体数目的理论基础,应包括在可获得情况下的
生物毒性实验数据和浓度限制;
- 媒质的构成,二氧化碳的浓度;
- 测定物质的浓度;
- 赋形剂和所加测定物质的体积;
- 培养温度;
- 培养时间;
- 处理持续时间;
- 处理时细胞密度;
- 新城代谢活动系统的种类和组成,包括规律的可接受性;
- 正负参考物质;
- 表达时间(包括播种细胞数目),次培养菌和培养时间表,如
果合适的话.
- 选择的药剂;
- 判断正,负反应的标准;
删除的内容: 测定情况
221
- 计算可存活的基因突变细胞的方法;
- 判断菌群大小和种类的比标准,(包括定义菌群"大"和"小"
的标准,如果合适).
结果
- 毒性迹象;
- 沉淀物迹象
- 在接触于测定物质过程中的PH值和摩尔渗透压浓度,如果可
以侧得;
- 至少在正,负参考物质下示踪菌群的大小;
- 在L5178YTK+/-系统中,实验室选择小突变菌群的adequacy,
如果合适的话;
- 在可能条件下反应—反馈关系;
- 在可能条件下的统计学分析;
- 正,负(溶剂,赋形剂)协同参考物质的实验数据;
- 正,负(溶剂,赋形剂)参考物质的历史实验数据及其范围;
方法和标准偏差
- 突变个体数目
结果讨论
结论
222
4.参考文献
Moore, M.M., DeMarini, D.M., DeSerres, F.J. and Tindall, K.R. (Eds.)
(1987). Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring
Harbor Laboratory, New York.
Chu, E.H.Y. and Malling, H.V. (1968). Mammalian Cell Genetics. II.
Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster
Cells In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 61, 1306-1312.
Liber, H.L. and Thilly, W.G. (1982). Mutation Assay at the Thymidine
Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts. Mutation Res., 94,
467-485.
Moore, M.M., Harington-Brock, K., Doerr, C.L. and Dearfield, K.L.
(1989). Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK
and CHO HGPRT Loci. Mutagenesis, 4, 394-403.
Aaron, C.S. and Stankowski, Jr.L.F. (1989). Comparison of the
AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug
Candidates. Mutation Res., 223, 121-128.
Aaron, C.S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H.R., Moore, M., Nishi, Y., Stankowski,
Jr.L.F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994). Mammalian Cell Gene
Mutation Assays Working Group Report. Report of the International
Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures.
223
Mutation Res., 312, 235-239.
Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M., Brusick, D.,
Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991). Genotoxicity Under Extreme Culture
Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257,
147-204.
Clive, D., McCuen, R., Spector, J.F.S., Piper, C. and Mavournin, K.H.
(1983). Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in Culture. A Report of
the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation
Res., 115, 225-251.
Li, A.P., Gupta, R.S., Heflich, R.H. and Wasson, J.S. (1988). A Review
and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine
Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of
Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental
Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 196, 17-36.
Li, A.P., Carver, J.H., Choy, W.N., Hsie, A.W., Gupta, R.S., Loveday,
K.S., O'Neill, J.P., Riddle, J.C., Stankowski, L.F. Jr. and Yang, L.L.
(1987). A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary
Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene
Mutation Assay. Mutation Res., 189, 135-141.
Liber, H.L., Yandell, D.W and Little, J.B. (1989). A Comparison of
Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid
224
Cells: Quantitative Differences are Due to an Additional Class of
Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutation Res., 216, 9-17.
Stankowski, L.F. Jr., Tindall, K.R. and Hsie, A.W. (1986). Quantitative
and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate -and ICR 191-
Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate -and ICR
191-Induced Mutation in AS52 Cells. Mutation Res., 160, 133-147.
Turner, N.T., Batson, A.G. and Clive, D. (1984). Procedures for the
L5178Y/TK+/- - TK+/-Mouse Lymphoma Cell Mutagenicity Assay. In:
Kilbey, B.J. et al (eds.) Handbook of Mutagenicity Test Procedures,
Elsevier Science Publishers, New York, pp. 239-268.
Arlett, C.F., Smith, D.M., Clarke, G.M., Green, M.H.L., Cole, J.,
McGregor, D.B. and Asquith, J.C. (1989). Mammalian Cell Gene
Mutation Assays Based upon Colony Formation. In: Statistical Evaluation
of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J., Ed., Cambridge University
Press, pp. 66-101.
Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, N. and
Mazzaccaro, A. (1977). Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in
V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated
Dimethylnitrosamine. Mutation Res., 46, 365-373.
Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975). Methods for Detecting
Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome
225
Mutagenicity Test. Mutation Res., 31,347-364.
Clive, D., Johnson, K.O., Spector, J.F.S., Batson, A.G. and Brown
M.M.M. (1979). Validation and Characterization of the L5178Y/TK+/-
Mouse Lymphoma Mutagen Assay System. Mutat. Res., 59, 61-108.
Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983). Revised Methods for the
Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, 173-215.
Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson,
G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992). Alternatives to Aroclor
1254-Induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7,
175-177.
Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976). A Safe
Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic
Activation Systems. In: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis
Testing, de Serres, F.J., Fouts, J.R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds),
Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.
Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982). CHO/HGPRT
Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R.R.,
Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds). Genotoxic Effects of Airborne Agents.
New York, Plenum, pp. 91-103.
Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983). Evaluation
of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for
226
Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay.
Environmental Mutagenesis, 5, 795-801.
Applegate, M.L., Moore, M.M., Broder, C.B., Burrell, A. and Hozier, J.C.
(1990). Molecular Dissection of Mutations at the Heterozygous
Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma Cells. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 87, 51-55.
Moore, M.M., Clive, D., Hozier, J.C., Howard, B.E., Batson, A.G., Turner,
N.T. and Sawyer, J. (1985). Analysis of Trifluorothymidine-Resistant
(TFTr) Mutants of L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Cells. Mutation
Res., 151, 161-174.
Yandell, D.W., Dryja, T.P. and Little, J.B. (1990). Molecular Genetic
Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in
Human Cells. Mutation Res., 229, 89-102.
Moore, M.M. and Doerr, C.L. (1990). Comparison of Chromosome
Aberration Frequency and Small-Colony TK-Deficient Mutant Frequency
in L5178Y/TK+/- -3.7.2C Mouse Lymphoma Cells. Mutagenesis, 5,
609-614.
227
B.18. DNA的损坏和修复-DNA S期外合成 -体外哺乳动物
细胞
1.方法
1.1.前言
见B部分引言.
1.2.定义
见B部分引言.
1.3.参考物质
无.
1.4.测定方法的原则
非常规DNA合成(UDS)测定衡量了在切除和迁移一段含有被物理
或化学因素破坏部分的DNA后的修复和合成.
这个测定的基础是将氚标记的胸腺嘧啶核苷 (3H-TdR)引入不处于细
胞周期的S状态的DNA中,3H-TdR的吸收可以由对被处理细胞的放射
自显影技术或液体闪烁计量来决定.
培养的生物细胞,除非是用幼鼠的肝细胞, 将在存在或不存在外生的
新陈代谢的情况下处理. UDS也可以在体内系统下测定.
删除的内容: 不定期
删除的内容: 法
删除的内容: 预定性
删除的内容:
228
1.5 质量标准
无.
1.6 实验方法描述
准备工作
化学试剂和对照或参考物质应准备在培养质中或者溶解或悬浮于合
适的媒介物质中,然后将培养物质中进一步稀释待用.关键是媒质不
能影响细胞的生存.
老鼠的肝细胞, 人类淋巴细胞,或建立的细胞链的原始载体(如人类
倍数染色体的纤维组织母细胞)在实验中也可被应用.
细胞应在存在或不存在合适的新陈代谢系统的情况下接触在测定化
合物中.
测试条件
培养数目
每个测定点需至少两个细胞载体以满足自显影照相技术的需要,至少
六个(若经科学证明,也可更少)载体以满足LSC UDS的测定.
阳性和阴性参考物质的作用
每个测定都应包括在有和没有新陈代谢活动条件下的阳性和阴性(无
处理和/或赋形剂)对照.
例如包括7,12-dimethylbenzathracene (7,12-DMBA)或
删除的内容: 控制
删除的内容: 再
删除的内容: 测定情况
删除的内容: 载体
删除的内容: 正负
删除的内容: 正负
删除的内容: 协同参考物质
229
2-acetylaminofluorene(2-AFF).老鼠肝脏组织正参考物质的测定.在固
定细胞链的情况下4-硝基喹啉—N-氧化物(4-NQO)是在没有新陈代
谢活动情况下在放射自显影技术和LSC测定找能够体现阳性参考物
质过程的实例.而N-二甲基亚硝胺是一例在有新陈代谢活动情况下阳
性参考物质化合物.
接触浓度
为定义反馈,必须在足够大的范围内配制多种浓度的测定物质.最高
浓度应能诱导细胞致毒作用.相应的,不溶于水的化合物应测定至其
最高溶解度.能与水混溶的无毒化合物,其最高测定浓度应按实际情
况确定.
细胞
为维持生长,必须有适合的生长媒质,二氧化碳的浓度,温度和湿度.
建立的细胞链应周期性的检查支原体污染.
新陈代谢活动
在原始的肝细胞载体中,没有新陈代谢活动系统.无论适合的新陈代
谢活动系统是否出现,建立的细胞链及淋巴细胞都会与测定物质相接
触.
步骤
培养基的准备
建立的细胞链是在储备的培养基中产生的(例如,通过胰蛋白酶或通
删除的内容: 照相
删除的内容: 正
删除的内容: 正
删除的内容:
删除的内容: 载体
删除的内容: 载体
删除的内容: 载体
230
过切除的方法).一般是将细胞种植在有培养基的溶剂中,在适合的
密度和37摄氏度下慢慢形成.
老鼠肝细胞短期载体的建立方法是:将新产生突变的肝细胞在适合培
养基中将其自身附着在生长表面上.
人类的淋巴细胞载体需通过应用合适的技术建立.
培养基和测定物质的处理
老鼠原始的肝细胞
新鲜的个体老鼠的肝细胞在含有3HTdR的媒质中用测定物质处理.处
理时间应适当.在处理结束时,细胞上的媒质应彻底排干,再将细胞
漂洗,固定,干燥.载玻片应完全进入放射自显影感光剂中(可用交
替溶出底片),再将其暴光,显影,着色,计数.
建立的细胞链和淋巴细胞
放射自显影技术:细胞载体接触在测定物质中的持续时间由3HTdR的
处理时间决定.其次数受物质性质,新陈代谢系统活性和细胞种类影
响.为测定UDS的最大值,3HTdR应和测定物质同时加入,或在接触
与测定物质后几分钟内加入.其具体步骤受测定物质和3HTdR之间相
互作用的影响.为识别UDS和DNA的半保留复制,应将后者抑制,
抑制可通过不完全精氨酸介质,低血清量或羟基尿素在介质载体中完
成.
用LSC测定UDS:优先处理测定物质进入细胞的S-phase需按上述方法
删除的内容: 载体
删除的内容: 媒质
删除的内容: 载体
231
封闭;再用放射自显影法,显影时,细胞应按上述方法接触于测定的
化合物中.在潜伏期结束时,DNA应从细胞和DNA总数中浓缩,3HTdR
的范围由混合物决定.
需要注意的是,若人类的淋巴细胞应用在上述技术中时,在无刺激载
体中,DNA 的半保留复制无需被抑制.
分析
放射自显影法测定
在载体中测定细胞中UDS含量时,S-phase细胞核可无需计数.没单
位浓度应至少计数50个细胞.在计数前应将载玻片编号.一些分布较
广的单独的随机区域需在每个载玻片上计数,在细胞浆上的3HTdR混
合总数是通过在淋巴细胞上三细胞核大小的区域内计数得到的.
LSC的测定
在LSC,UDS测定中,参考物质时应保证每单位浓度中有足够数量的
载体.
所有的结果都应被独立的实验所证实.
2.实验数据
实验数据应以表格形式出现.
2.1.放射自显影法测定
3H-TdR团在细胞质中的扩展和细胞核中所找到的晶粒数目都应单独
232
记录.
平均值,中值和众值可能用来描述细胞质中的3H-TdR的结合范围的分
布和每个细胞核中晶粒的数目.
2.2. LSC的测定
为测定LSC,3HTdR混合物在实验结果报告中应写为dmp/ug DNA形
式.Dpm/ug DNA发平均标准偏差用来描述混合物的分布.
实验数据要用适合的统计学方法评估.
3. 实验结果报告
3.1.测定结果报告
如果可能的话,实验结果报告应包括以下内容:
- 测定时所使用细胞的密度,通道数目及细胞载体数目
- 保持细胞载体的方法,包括媒质温度以及二氧化碳的浓度
- 测定物质,载色剂,浓度以及分析时选择浓度的理论基础
- 新陈代谢系统的详细说明
- 测定时间表
- 正负参考物质
- 所使用的放射自显影技术
删除的内容: 间
233
- 阻塞S-phase 进入细胞的步骤
- 在测定LSC中DNA总含量时,测定和提取DNA的步骤
- 剂量/反应关系,如果可能的话
- 统计学评价
- 结果讨论
- 结果解释
3.2.评价的测定
见B部分引言
4.参考文献
见B部分引言
删除的内容: 反映
删除的内容: 反馈
删除的内容: 的
234
B.19. 体外姊妹染色单体的交换测定
1.方法
1.1 引言
见一般引言B部分
1.2 定义
见一般引言B部分
1.3.参考文献
无
1.4.测定法原理
姐妹染色体交换(SCE)测定法是一种短时测定法.它用于测定在一
对被复制的姐妹染色体中的倒易DNA.SCE代表在表观匀称地区
DNA复制产品的互换.虽然对于分子主要成分一无所知,交换过程
可能包含了DNA的裂解和重组.SCE测定需要示差标记姐妹染色体,
这可通过两个细胞周期间将溴化脱氧尿苷(BrdU)并入染色体DNA
而做到.
如果适当,有无哺乳动物外源代谢活化体系,母体外哺乳动物细胞都
接触于测定化学试剂下.且在含BrdU介质中培养两圈复制品.在处
理纺锤体抑制剂(如秋水仙素)使细胞在有丝分裂(c-中期)中期富
235
集,细胞被收集且染色体准备工作完成.
1.5.质量标准
无
1.6.测定方法描述
1.6.1 准备
- 初级培养基(人类淋巴细胞)或已固定的细胞线(如中国大
鼠卵巢细胞)可被用于测定.还应检验细胞线有无细菌淋巴
污染.
- 应使用合适的培养基方式和培养条件(如温度,培养容器,
CO2浓度和湿度).
- 在优先处理细胞后,测定物质应在培养基中准备,或溶解或
悬浮在合适的显色剂中.培养基体系中最后显色剂浓度不能
受到显著影响,细胞活体或生长速率和SCE影响频率应通过
溶剂控制来监测.
- 有无外源性哺乳动物新陈代谢活化体系,细胞应接触于测定
剂中.选择性的,在细胞本身新陈代谢活动类型使用的地方,
活动速率和天性应适合于被测定的化学等级.
1.6.2 测定条件
培养基数目
236
至少双份培养基应被应用于每个实验点.
阳性和阴性对照
用直接作用化合物和新陈代谢活化化合物的阳性对照,应该包含在每
个实验;介质对照也应该被使用.
下面是用作阳性对照的物质例子:
-直接作用化合物
-乙基甲烷磺酸盐
-间接作用化合物
-环磷酸酰胺
当适宜条件时,附加同样化学等级作为下级测定的正控制也可被包
括.
接触浓度
至少使用三种适量浓度测定试剂.最高浓度会导致显著有害影响,但
是依然可以发生足够的细胞复制.相对的,不溶于水的物质应用合适
的步骤测出溶解度极限.对于全溶于水的无害物质,以上测定物质浓
度应根据只要成分的不同情况来决定.
1.6.3.步骤
培养基准备
固定的细胞株从贮备的培养基中繁殖(如胰蛋白酶或用甩脱),在培
删除的内容: 正负控制
删除的内容: 使用
删除的内容: 正控制
删除的内容: 显色剂控制
删除的内容: 也应
删除的内容: 正控制
删除的内容: 的
删除的内容: 分体
删除的内容: 空白浓缩
删除的内容: 线
237
养基中用合适的密度种植,控温37℃培育.对于单分子培养基,每
一个培养基容器中的细胞数应调整到使培养既不多与收获时合流的
50%.选择地,细胞应被用于悬浮培养基.人类淋巴培养基使用合适
的技术从用肝素处理过的血浆中提取,并在37℃培育.
处理
呈指数增长的细胞应在测定物质中接触合适的时间,大多数情况下,
一至两个小时是有效的,但在某些情况下处理,时间应延长至两个完
全周期.没有足够的 instrinsic 新陈代谢活性的细胞应在有和没有
合适的新陈代谢体系的情况下分别接触在测定物质中.接触时期结
束,应洗净细胞上的培养基和测定物质以利于BrdU副本的出现.本
实验可选择的步骤为:将细胞同时接触在BrdU和测定化合物中达两
个细胞周期,人类淋巴细胞载体在半同时情况下处理.
细胞在反映第二阶段被测定,以保证细胞周期中细胞在最急性阶段与
化合物接触.所有加了BrdU的载体需要在黑暗中或白炽灯的微光下
处理.其目的是保证收获细胞中BrdU包含DNA光分解减至最小.
细胞收获
收获前1-4小时细胞用纺锤体抑制剂(秋水仙素)处理,为准备染色
体,单个细胞都应单独处理和收获.
染色体的准备和着色
染色体由标准细胞遗传技术准备,显示SCE时载玻片的着色可用几
删除的内容: 载体
238
种方法来处理,例如荧光加上吉姆萨氏技术.
分析
细胞数目的分析应基于SCE的自然频率参考物质.通常分析SCE时,
至少分析25个单位的良好展开的处于细胞分裂中期的细胞,载玻片
在分析前应被编号.分析人类淋巴细胞时,指分析包括46个着丝点
处于细胞分裂中期的细胞.建立细胞键时,只研究包含模式数码中的
±两个着丝点的分类中期.因该说明标签的着丝点转换是否被计为一
个SCE,并用独立的实验对结果进行确认.
2. 数据
数据应以表格形式出现.所有测试和对照的培养物都应单独列出其各
个分裂中期的SCEs数目和各个分裂中期的每个染色体的SCEs数目.
应用适当的统计方法对数据进行评估.
3.实验结果报告
3.1. 测定结果报告
如果可能,测定结果报告应包括以下信息.
- 使用的细胞,维持细胞载体的方法.
- 测定条件,媒质组成,CO2浓度,测定物质浓度.
使用的媒介,培育温度,处理时间,使用的纺锤体抑制剂及其浓度
删除的内容: 处理
删除的内容: 控制
删除的内容: 数码
删除的内容: 数码
删除的内容: 情况
删除的内容: 载色剂
239
和处理持续时间,所使用的哺乳动物活动系统的种类,阳性和阴性
对照物质.
- 每个实验的细胞株数
- 切片准备的技术细节
- 分析的处于细胞分裂中期的细胞数(单个细胞都给出独立实验数
据)
- 单个细胞和单个染色体上SCE的平均数(单个载体都给出独立实
验数据)
- 评估SCE的标准
- 选择的理论基础
- 剂量-反应之间的关系,如果适用
- 统计的评价
- 结果讨论
- 对结果的解释
3.2.评估的解释
见B部分导言
4. 参考文献
见B部分导言
删除的内容: 正负
删除的内容: 参考
删除的内容: 单个
删除的内容: 点
删除的内容: 载体
删除的内容: 载波
删除的内容: 载体
删除的内容: 反映
删除的内容: 与反馈
240
B.20. 果蝇的伴性隐性致死测定
1. 方法
1.1. 引言
请参看引言B部分.
1.2. 定义
请参看引言B部分.
1.3. 参照物
无
1.4. 检测方法原则
性别相关隐性致死因子(SLRL)检测使用果蝇在它的生殖链中检测突
变的发生,包括点突变和小的缺失.本方法是一种正向突变分析方法,
能够在X染色体上以800基因座的分辨能力分辨突变的发生,也即
所有X染色体基因座的80%.X染色体约占一套染色体基因组的1/5.
果蝇X染色体的突变在携带突变基因的雄性个体中通过表现型表达
出来.当纯合体的突变为致命突变时,突变的存在可通过杂合雌性个
体正常生产的两类雄性子代中一类的缺失加以推断.SLRL检测通过
经特殊标记和支配的染色体来取得上述优点.
删除的内容: 性别
删除的内容: 命
删除的内容: 方法在该
删除的内容: 昆虫
241
1.5. 定量
无
1.6. 检测方法概述
准备工作
储备
使用定义明确的野生雄性和Muller-5雌性果蝇.其它合适标记过的具
有倒转X染色体的雌性个体也可以使用.
检测物
检测物应溶解在水中,不溶于水的物质可先溶解或悬浮于合适的媒介
中(如:乙醇和土温60或80的混合溶剂中),再在操作前用水或盐
水稀释.DMSO不能用作溶剂.
动物数量
检测方案应预先明确其灵敏度和强度.在合适的控制条件下观察到的
自发突变频率将于很大程度上影响必须分析的处理过的染色体的数
量.
药物配给方案
给药途径可以为经口,注射或是将动物接触在气体和蒸气中.喂服的
检测物应溶解在糖水中,必要时可溶解在0.7%的食盐水中并注射到
胸腔或腹腔中.
删除的内容: 家畜
删除的内容: 适当
删除的内容:
删除的内容: 用作
242
阳性和阴性对照的使用
阴性和阳性对照应包含在内.如果有现成的合适的实验数据,也可不
进行对照实验.
剂量水平
应使用三种剂量水平.初步评估阶段应使用一种剂量水平,该水平为
动物所能承受浓度的上限或者是使动物产生中毒迹象的浓度.对于无
毒性物质,应使用可能的最高浓度剂量水平.
实验步骤
用经检测物处理过的野生雄性个体(出生3~5天)单独与过量的来自
于Muller-5血统或其它适当标志(多种转化X基因)的未交配的雌
性个体交配.每2~3天更换新的未交配过的雌性个体从而覆盖整个生
殖细胞循环期.由于在处理时对成熟精子,中晚期精子细胞,早期精
子细胞,精原细胞和育精囊的作用,这些雌性的后代带有相应的致死
作用的因子.
这些雌性个体的后代将由以上杂交得到的纯合F1代雌性个体与同代
的雄性个体单独交配(即:每个雌性个体对应一个雄性个体).在F2
代中,记录缺失野生雄性个体的培养基.如果F1的后代带有亲代的
X基因的致命因子(如,带有处理基因的雄性无存活),那么那些有
同一基因型的雌性的雌性后代应被测试以确认这种致命性是否再下
一代中遗传.
删除的内容: 直接和间接控制
条件
删除的内容: 直接和间接控制
条件
删除的内容: 采取控制措施
删除的内容: 给药标准
删除的内容: 给药标准
删除的内容: 给药标准
删除的内容: 标准
删除的内容: 作为
删除的内容: 给药标准
删除的内容: 超额
删除的内容: 子
删除的内容: 致命
删除的内容: 标记
243
2.实验数据资料
实验数据应制成表格并显示以下信息:被检测X染色体的数目,不
育雄性个体的数目以及每种浓度下,每个交配阶段和每个处理过的雄
性个体产生的致死染色体的数目.在报告中还应该包含有不同大小基
因簇的数目.以上实验结果应在一个单独实验中证实确定.评估性别
相关隐性致命检测应使用合适的统计方法.
在评估性别相关隐性致命因子检测时,应使用合适的统计方法.从一
个雄性个体中获得的隐性致命基因簇应使用合适的统计方式考虑和
评估.
3.报告
3.1. 检测报告
检测报告应尽可能包含以下信息:
- 品质:所用果蝇的品种或品质,年龄,处理的雄性个体的数量,
不育雄性个体的数量,制的的F2代培养基的数量,没有子代
的F2代培养基的数量,生殖细胞发育每个阶段携带致命因子
的染色体的数量.
- 测试群体大小的确定标准;
- 检测条件.包括采样与处理方案的详细描述,给药标准,毒
性实验数据,合适的阳性和阴性(溶剂)对照;
删除的内容: 处理
删除的内容: 直接和间接
删除的内容: 控制条件
244
- 记载致命突变的标准;
- 给药与产生的效应的关联(若可能的话);
- 实验数据评估;
- 结果讨论;
- 结果说明;
3.2. 评价与说明
请参看引言B部分.
4. 参考文献
请参看引言B部分.
245
B.21. 体外哺乳动物样品的细胞变异测定
1. 方法
1.1. 引言
请参看引言B部分.
1.2. 定义
请参看引言B部分.
1.3. 参照物
无
1.4. 检测方法原则
哺乳动物细胞培养机制可用于检测和体内恶性转换相联系的体外化
学物质诱导产生的表现型的改变.被广泛使用的细胞包括
C3H10T1/2,3T3,SHE,Fischer田鼠细胞等.本方法依赖于细胞形
态学.也存在其它不被广泛应用的检测体系,用来检测用致癌化合物
处理过的细胞的其他一些生理上和形态上的改变.检测目标与癌症没
有机械的联系.一些检测体系可以检测产生肿瘤的原动力.细胞毒性
可通过衡量检测物克隆形成的能力或物种的生长速度来确定.
删除的内容:
删除的内容: 培养基成长速度
的
删除的内容: 影响
246
1.5. 定量
无
1.6. 实验方法描述
准备工作
细胞
多样的细胞系或初级细胞的使用取决于正在进行的转换测试方法.研
究者必须确保用已知的致癌物质处理过的被检测细胞会表现出合适
的表现型的改变以及在研究者的实验室中这种研究的合法性和可靠
性.
培养基
培养基和实验条件应与所用的分析方法相适应.
检测物
在用于处理细胞之前,检测物应先准备在培养基中或溶解抑或悬浮在
合适的媒介中.培养体系中媒介的最终浓度不应影响细胞的活性,生
成速度和变异发生率.
新陈代谢作用
在存在和缺少新陈代谢系统这两种条件下,分别用检测物处理细胞.
阴性和阳性的对照
删除的内容: 使用
删除的内容: 链
删除的内容: 还是
删除的内容: 所使用的转基因
检测
删除的内容: 生
删除的内容: 媒介
删除的内容: 环境
删除的内容: 生活体
删除的内容: 激活
删除的内容: 激活机制
删除的内容: 直接
删除的内容: 间接
删除的内容: 条件控制
247
每个实验都应包含有使用具有活性的化合物和需激活的化合物的阳
性对照条件;阴性对照也应被使用.
以下是可以用作阳性对照的化合物的例子:
- 直接具有活性的化合物;
- 甲磺酸乙脂
- β-丙内酯
- 需激活的化合物:
- 2-acetylaminofluorene
- 4-dimethylaminoazobenzene
- 7,12-dimethylbenzanthracene
可能的话,还应包含补充的测试的化合物的同一化学种类的阳性对
照.
检测浓度
应使用几种不同的检测物浓度.这些浓度应能产生与浓度相应的中毒
迹象,最高浓度对应于小的存活率,最低浓度的存活率与控制体制大
体相等.检测时较难溶于水的物质应采用合适的步骤,使其达到溶解
度的极限.对易溶于水且无毒的物质,检测浓度上限应视情况确定.
实验步骤
细胞应适当处理一段的时间,其长短取决于所用的检测机制.如果给
删除的内容: 直接
删除的内容: 直接控制
删除的内容: 间接
删除的内容: 控制
删除的内容: 直接控制
删除的内容: 直接控制
删除的内容: 药物配给
删除的内容: 恰当
248
药时间延长,可能会重新确定给药剂量,同时更改媒介(必要的话,
更换新鲜的具代谢激活作用的物质).没有足够的内部代谢激活作用
的细胞应在存在和缺少代谢激活机制两种条件下分别用被测物处理.
给药结束后,从细胞体上清洗掉被测物并将其放在适宜于表现型出现
和监测的基因变异发生的培养条件中.所有的实验结果应在一个单独
的实验中加以验证.
2.实验数据资料
实验数据资料应以表格形式呈现,也可根据所用的分析方法采用多种
形式,比如平板测数,正极板或转换细胞的数量.可能的话,存活量
应表示为控制水平的百分数,而转化率则表示为每一定量的存活物中
转化体的数量.应用适当的统计方法评估数据.
3.报告
3.1. 检测报告
检测报告应尽可能包含以下信息:
- 使用的细胞类型,细胞培养基的数量,细胞培养基培养方法;
- 检测条件:检测物的浓度,所用的媒介,培养时间,药物处理
频率和持续时间,处理过程中细胞的比重,所用外源物质交换类
型,阳性和阴性控制条件,监测表现型的详述,所用的选择淘汰
机制,剂量选择的理论基础;
删除的内容: 转基因
249- 统计存活和突变细胞数目的方法;
- 统计评价;
- 结果讨论;
- 结果说明.
3.2. 评价与说明
请参看引言B部分.
4. 参考文献
请参看引言B部分.
250
B.22. 啮齿动物致死因子测定
1. 方法
1.1. 引言
请参看引言B部分.
1.2. 定义
请参看引言B部分.
1.3. 参照物
1.4. 实验方法原则
显性致命作用会导致胚胎死亡或死胎.通过由于接触于被测物中而诱
导的致命因子的产生,表明检测物对检测物种的生殖组织产生了作
用.人们普遍认为显性致命因子是由于染色体的损伤所导致的.药物
处理过的雌性物种产生死胎可能是中毒的原因.
动物一般先接触在被测物的环境中,再和未交配过的雌性交配.利用
连续交配的时间间隙,在不同胚种阶段可被分别检测出.被处理群体
中的每个雌性个体内死亡的移植组织,相对于控制群体中死亡的数量
多的事实,可说明移植后的缺失.移植前的缺失可通过以下途径评估:
根据躯体内黄体的数目,或通过比较被处理和被控制群体中每个雌性
个体的移植组织的总数.总的显性致命效应等于移植前和移植后缺失
删除的内容: 显性基因
251
的总和.总的显性致命效应的计算是基于处理群体与控制群体中每个
雌性个体体内存活的移植组织的比较.在某一时间间隔内移植组织数
量的减少可能是细胞死亡的原因(即:精母细胞和/或精原细胞).
1.5. 质量评价标准
无
1.6. 检测方法描述
准备工作
检测物应尽可能溶解或悬浮于等渗压的盐水中.不溶于水的化学物质
可先溶解或悬浮于合适的媒介中.使用的媒介物质应既不干扰检测物
质,也不产生毒性效应.应使用新鲜配制的检测物.
检测条件
药物给药方案
检测物一般一次给药.根据毒理学的知识,应该使用多次重复处理方
案.通常用喉管强饲或通过液膜注射的方式给药.其它适当的给药方
案也可使用.
动物样品
田鼠和小鼠可作为实验动物物种.从健壮,性成熟的个体中随机挑选,
并分配至测试与对照群体中.
数量和性别
删除的内容: 处理
删除的内容: 控制
252
考虑到评估生物特征的自身变化,应使用数量足够的雄性个体作为检
测对象.数量的决定应根据预先设定的检测灵敏度和强度.比如在一
个典型实验中,不同剂量的群体中的雄性个体数量,应足够在每个交
配间歇期提供30～50个受孕雌性个体.
阳性和阴性对照
一般情况下,在每次检测中应同时包含阳性和阴性(媒介)对照.当
可接受的阳性对照条件可以从近期在同一实验室中进行的实验中获
得时,这些结果可以代替相应的阳性对照而被使用.应使用合适的低
剂量阳性对照物质(例如:MMS,腹膜内注射,10mg/kg)以证明测定
的灵敏度.
剂量水平
通常使用三种剂量水平.高剂量将会在被处理动物体中产生中毒迹
象,或出现生育能力下降地症状.在某些情况下,使用单一的剂量水
平已经足够了.
极限检测
无毒物质检测时应按5g/kg一次性给药,或以1g/kg/天分多次重复给
药.
实验步骤
可使用几种测试方案.被测物一次性给药被最为广泛地使用,但其它
处理方案也可使用.
删除的内容: 直接和间接控制
条件
删除的内容: 直接和间接
删除的内容: 控制条件
删除的内容: 直接控制
删除的内容: 直接控制条件
删除的内容: 直接控制
删除的内容: 标准
删除的内容: 标准
删除的内容: 标准
删除的内容: 处理
253
雄性个体在被处理后,在合适的时间间隔内,连续地与1个或2个未
被处理过的未交配雌性个体交配.雌性个体应与雄性个体至少相处1
个连续的发情期,或者一直相处到发生交配为止,这可以通过阴道中
出现精液或阴道拴来判断.紧随处理之后的交配次数由处理的方案控
制,交配的次数应确保在处理后各个阶段的胚种细胞均被采样.
使雌性个体在怀孕的后半期死亡,检查子宫内的物质,以判断死亡的
和存活的移植组织的个数.检查卵巢判定黄体的个数.
2. 实验数据资料
实验数据应以表格形式呈现,包含雄性个体,受孕的雌性个体以及未
受孕的雌性个体的数目.每次交配之后应分别记录下结果,结果中应
包含每个雌性个体的相同方面.对每个雌性个体还应记录下它的交配
周期,与其交配的雄性个体的剂量标准,死亡和存活的移植组织的频
率.
总的显性致命效应的计算依据检测群体与控制群体中每个雌性个体
存活的移植组织的比较,将处理群体和控制群体中死亡的移植组织与
存活的移植组织的比率作比较,分析其比较的结果可以指示移植后的
缺失.
如果记录了早期,末期的死亡,表格的设计应明确这一点.如果评估
了移植前的缺失,应记录下来.通过躯体中黄体数目与移植组织个数
的差异,或者是较控制条件下的交配,每个子宫中移植组织的平均数
254
目的减少,来计算移植前的缺失.
选择适当的统计方法评估实验数据.
3. 报告
3.1. 检测报告
检测报告应尽可能包含以下信息:
- 所用动物的物种,种属,年龄,对照群体和测试群体中每种
性别动物的数量.
- 检测物,媒介,剂量标准,阳性和阴性对照,毒理实验数据.
- 处理方案
- 交配方案;
- 用来确定交配发生的方法;
- 宰杀的时间;
- 记录显性致命基因的判断标准;
- 剂量和反应的关系(若可能的话);
- 统计评价;
- 结果讨论;
- 结果说明;
删除的内容: 品种
删除的内容: 控制
删除的内容: 处理
删除的内容: 直接
删除的内容: 间接的控制
删除的内容: 关联
255
3.2. 评价与说明
请参看引言B部分.
4. 参考文献
请参看引言B部分.
256
B.23 哺乳动物精囊染色体变异测定
1. 方法
本方法是对OECG TG 483,哺乳动物精原细胞染色体畸变检测(1997)
的重复.
1.1 引言
哺乳动物体内精原细胞染色体畸变检测的目的是为了辨识确认能引
发哺乳动物精原细胞染色体结构畸变的物质(1)(2)(3)(4)(5).结构畸变
有两种类型,包括染色体畸变和染色单体畸变.大多数化学诱变剂诱
发的畸变类型为染色单体型畸变,但染色体畸变也会发生.本方法不
是旨在检测染色体的数目畸变,也不能用于惯常的数目畸变检测.许
多人类遗传病直接或间接地由染色体突变引起.
本方法检测染色体在精原细胞中的活动,从而有望预见引起生殖细胞
可遗传突变的诱导效应.
惯常用啮齿类动物作为检测材料.这种体内细胞基因检测方法是为检
测精原细胞有丝分裂是的染色体畸变,其他细胞不作为本方法的研究
对象.
为检测精原细胞染色单体型畸变,应检查处理过的细胞的第一次有丝
分裂,以免损伤在其后的细胞分裂中遗失.处理过的精原细胞的更多
信息可通过分析第一次减数分裂的浓缩期至中期,当精原细胞变为精
母细胞时的染色体型畸变而获得.
删除的内容: 活性
删除的内容: 活性
257这种体内检测是为了研究体细胞突变在生殖细胞中是否也为活性,另
外,精原细胞检测方法很适宜于评估引起突变危险的可能性,因为它
考虑到了体内新陈代谢,药代动力学和DNA修复过程等多种因素.
利用化学品处理下的光谱灵敏的变化可以表现出睾丸中产生的大量
育精囊.因此,探测的变异随着越来越多的分化的精原细胞的支配表
现出处理的精囊细胞群的总体响应.由于它们在睾丸中的位置,不同
代的精原细胞可能会或可能不会暴露在通常的流量中,这取决于物理
和生理塞尔托利细胞隔离和血液-睾丸隔离.
如果有迹象表明被测物或反应的代谢产物不能到达目标组织,本检测
方法不适用.
请再参看引言B部分.
1.2. 定义
染色单体性畸变:染色体结构损伤的一种,表现为单个染色单体的损
伤或染色单体间的损伤与重组.
染色体型畸变: 染色体结构损伤的一种,表现为同位染色单体的损
伤或损伤与重组.
Gap:一种非染色体损伤.
数目畸变:在所用动物正常染色体数目基础上发生的染色体数目的改
变.
删除的内容: 活性
删除的内容: 活体
删除的内容: 药物
258
多倍性:多重的单倍体染色体的细胞,而不是双倍数目(如3n, 4n等等).
结构畸变:通过显微镜可观测到染色体结果变异.
1.3. 检测方法原理
检测物可通过合适的给药途径处理动物.然后再将其在合适的时间杀
死.在杀死之前,动物要先用中期抑制剂处理(如:秋水仙碱和秋水
仙素).备用染色体可以从生殖细胞中获得并着色,处于分裂中期的
细胞要对其进行染色体畸变分析.
1.4.检测方法概述
1.4.1. 准备工作
1.4.1.1.动物物种选择
一般用中国产雄性大鼠或小鼠,但也可使用其它合适的雄性哺乳动
物.通常使用年轻健壮的成体作为处理对象.笼子的布置安排应尽可
能地减小可能由此产生的影响.
在研究开始时,动物体重变化范围应尽可能小,不超过平均体重的±
20%.
1.4.1.2.居住和饲养条件
可采用引言B部分指的是的通用条件,但湿度要达到50~60%.
1.4.1.3.动物准备
删除的内容: 原则
259
年轻健壮的成体可以作为控制和处理的对象.笼子的布置安排应尽可
能地减小由此产生的影响.在研究开始之前,动物应先适应实验室环
境至少5天以上.
1.4.1.4. 药剂准备
固体检测物应溶解或悬浮于合适的溶剂或媒介中.在喂服之前可稀
释.液体检测物可