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流式细胞术详解
加入时间:2004-12-27 来源: 编辑:科泰生物
一. 流式细胞术概述
流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术, 它集计算机技术,激光技术,流体力学,细胞化学,细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能.它不仅可测量细胞大小,内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原,细胞内DNA,RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集,储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度>95%.在血液学,免疫学,肿瘤学,药物学,分子生物学等学科广泛应用.
国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司).流式细胞仪主要有两型:临床型(又称小型机,台式机)和综合型(又称大型机,分析型).BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B-D 公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur.EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型,除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能, 多用于科学研究.
二.流式细胞仪主要技术指标
1.流式细胞仪的分析速度:
一般流式细胞仪每秒检测1000～ 5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞.
2.流式细胞仪的荧光检测灵敏度:一般能测出单个细胞上5%即可区分.
3.前向角散射(FSC)光检测灵敏度:前向角散射(FSC)反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～0.5μm.
4.流式细胞仪的分辨率:通常用变异系数CV值来表示,,一般流式细胞仪能够达到1000个/秒,分选细胞纯度可达99%以上.
三.流式细胞仪主要构造和工作原理 流动室及液流驱动系统
流式细胞仪主要由以下五部分构成:①流动室及液流驱动系统②激光光源及光束形成系统③光学系统④信号检测与存储,显示,分析系统⑤细胞分选系统.
流动室(Flow Cell或Flow Chamber)是流式细胞仪的核心部件,流动室由石英玻璃制成,单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔,检测区在该孔的中心,细胞在此与激光垂直相交,在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区.流动室里的鞘液流是一种稳定流动,控制鞘液流的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统,压力感受器组成,只要调整好鞘液压力和标本管压力, 鞘液流包绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向,能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相等,从而使激光激发的荧光信息准确无误.见图12.1流动室示意图.流动室孔径有60μm,100μm,150μm ,250μm等多种,供研究者选择.小型仪器一般固定装置了一定孔径的流动室.
图12.1流动室示意图(采自Coulter Training Guide)
四. 流式细胞仪主要构造和工作原理 激光光源及光束形成系统
流式细胞仪可配备一根或多根激光管,常用的激光管是氩离子气体激光管,它的发射光波长488ηm,此外可配备氦氖离子气体激光管(波长633ηm)和/或紫外激光管.
流式细胞仪的主要测定信号荧光是由激发光激发的,荧光信号的强弱与激发光的强度和照射时间相关,激光是一种相干光源,它能提供单波长,高强度,高稳定性的光照,正是能达到这一要求的理想的激发光光源.
在激光光源和流动室之间有两个圆柱形透镜,将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束(22μm×66μm),在这种椭圆形激光光斑内激光能量成正态分布,使通过激光检测区的细胞受照强度一致.
五. 流式细胞仪主要构造和工作原理 光学系统
流式细胞仪的光学系统由若干组透镜,小孔,滤光片组成,大致可分为流动室前和流动室后两组.流动室前的光学系统由透镜和小孔组成,透镜和小孔(一般为2片透镜,1个小孔)的主要作用是将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束,使激光能量成正态分布,使通过激光检测区的细胞受照强度一致,最大限度的减少杂散光的干扰;流动室后的光学系统主要由多组滤光片组成,滤光片的主要作用是将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管.滤光片主要有三类:长通滤片(LP)--只允许特定波长以上的光线通过,短通滤片(SP)-- 只允许特定波长以下的光线通过,带通滤片(BP)-- 只允许特定波长的光线通过,不同组合的滤片可以将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管(PMT),如接收绿色荧光(FITC)的PMT前面配置的滤光片是LP550和BP525, 接收色橙红色荧光(PE)的PMT前面配置的滤光片是LP600和BP575, 接收红色荧光(CY5)的PMT前面配置的滤光片是LP650和BP675.见图12.2光学系统和信号检测系统示意图.
六. 流式细胞仪主要构造和工作原理 信号检测系统
当测定标本在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区时产生散射光和荧光信号,散射光分为前向角散射(Forward Scatter, FS)和侧向角散射或900散射(Side Scatter, SS),散射光是细胞的物理参数与细胞样本的制备(如染色)无关;荧光信号也有两种,一种是细胞自发荧光它一般很微弱,一种是细胞样本经标有特异荧光素的单克隆抗体染色后经激光激发发出的荧光,它是我们要测定的荧光,荧光信号较强,这两种荧光信号的同时存在是我们测定时需要设定阴性对照的理由,以便从测出的荧光信号中减去细胞自发荧光和抗体非特异结合产生的荧光.
前向角散射(FS)反映被测细胞的大小,它由正对着流动室的光电二极管装置接收并转变为电信号;侧向角散射或900散射(SS)反映被测细胞的细胞膜,细胞质,核膜的折射率和细胞内颗粒的性状, 它由一个光电倍增管(PMT) 接收并转变为电信号,这些电信号存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内.
流式细胞仪测定常用的荧光染料有多种,他们分子结构不同,激发光谱和发射光谱也各异,选择荧光染料时必须依据流式细胞仪所配备的激光光源的发射光波长(如氩离子气体激光管,它的发射光波488ηm,氦氖离子气体激光管发射光波长633ηm).488ηm激光光源常用的荧光染料有FITC(异硫氰酸荧光素),PE(藻红蛋白),PI(碘化丙啶),CY5(化青素),preCP(叶绿素蛋白),ECD(藻红蛋白-得克萨斯红)等.他们的激发光和发射光波长分别是:
激发光波长(ηm) 发射光峰值(ηm)
FITC 488 525(绿)
PE 488 575(橙红)
PI 488 630(橙红)
ECD 488 610(红)
CY5 488 675(深红)
PreCP 488 675(深红)
各种荧光信号由各自的光电倍增管(PMT) 接收并转变为电信号后存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内.见图12.2光学系统和信号检测系统示意图.
七. 流式细胞仪主要构造和工作原理 信号存储,显示,分析系统
(一) 信号存储
存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内的数据一般是以List mode(列表排队)方式存入的,采用List mode方式有两大优点:①节约内存和磁盘空间②易于加工处理分析.
(二)信号显示和分析
由于List mode方式数据缺乏直观性,数据的显示和分析一般采用一维直
方图(图12.3),二维点阵图(图12.4,12.5),等高线图(图12.8)和密度图(图12.7).
1.单参数数据显示和分析 细胞的每一个单参数测量数据用直方图来显 示,图中横坐标表示散射光或荧光信号相对强度值,其单位是道数,可以是线性的,也可以是对数的;纵坐标表示细胞数.见图12.3一维直方图,图中横坐标是FITC荧光信号相对强度值(对数),纵坐标表示细胞数;图中已根据阴性对照设定适当的"门"(直线门),仪器的计算机就会给出测定值(包括阳性细胞%和平均荧光强度).
2.双参数数据显示和分析 细胞的双参数测量数据和细胞数量的关系用一维直方图,二维点阵图,等高线图和密度图显示和分析.如图12.4二维点阵图,是正常人外周血白细胞的前向散射光(FS)和侧向散射光(SS)组成的点阵图,横坐标和纵坐标均是线性的,图中淋巴细胞,单核细胞,粒细胞很明显地分为3群,可以很容易地圈"门"( Bitmap,无定型门),分析各亚群细胞的数据;图12.6假三维地形图(X轴: SSC ,Y轴:FSC Z轴:细胞数)更清楚地表明这一点.图12.5二维点阵图是细胞的两种荧光(FITC和RD1)双参数数据显示,横坐标和纵坐标均是对数的,横坐标代表FITC,纵坐标代表PE,图中已设定适当的"门"(十字门),十字门的D1,D2,D3,D4门分别代表PE单阳性细胞,PE和FITC双阳性细胞 ,阴性细胞,FITC单阳性细胞.仪器的计算机就会给出两种荧光测定值(包括阴性细胞%,两种荧光各自的阳性细胞%,两种荧光的双阳性细胞%,各群细胞的平均荧光强度). 图12.7和图12.8分别是测定细胞的两种荧光双参数数据的密度图和等高线图,横坐标和纵坐标分别代表一种荧光参数,同理只要设定十字门就可得到两种荧光的各种测定值,密度图和等高线图较点阵图更直观.
3.三参数数据显示和分析 细胞的三参数测量数据和细胞数量的关系每两个数据组成一对(三参数测量数据和细胞数量每两个数据可组成6对数据)用一维直方图,二维点阵图,等高线图和密度图显示和分析.三个荧光数据关系用分光图(prism)表示,分光图可直接给出8个数据(如用ABC代表3种荧光,可有A+B+C+,A+B+C- ,A+B-C-, A-B+C+, A-B+C-, A-B-C+, A+B-C+ ,A-B-C-).见图12.9 prism,图12.9为人外周血淋巴细胞亚群测定结果的分光图,图中给出CD3,CD4,CD8组合的各种结果,如T辅助细胞(CD3+CD4+CD8-)为42.0%,如T抑制细胞(CD3+CD4+CD8-)为17.4%.
图12.5两种荧光的二维点阵图(采自Coulter Operaters Guide)
图12.7. 双参数数据的密度图(采自Coulter Operaters Guide)
图12.6假三维地形图和二维点阵图(采自Coulter Operaters Guide)
图12.8双参数数据的等高线图(采自Coulter Operaters Guide)
图12.9 分光图(prism)
八. 流式细胞仪主要构造和工作原理 细胞分选系统
如在细胞流动室上装有超声压电晶体,通电后超声压电晶体发生高频震动,可带动细胞流动室高频震动, 使细胞流动室喷咀流出的液流束断成一连串均匀的液滴, 每秒钟形成液滴上万个.每个液滴中包含着一个样品细胞, 液滴中的细胞在形成液滴前已被测量,如符合预定要求则可被充电,在通过偏转板的高压静电场时向左或向右偏转被收集在指定容器中, 不含细胞液滴或细胞不符合预定要求液滴不被充电亦不发生偏转进入中间废液收集器中,从而实现了分选. 分选的详细原理和操作请有兴趣者参考有关文献.
九. 流式细胞术在血液学中的应用 DNA倍体分析及细胞周期分析
在细胞周期内,DNA含量随细胞内时相发生周期性变化,正常情况下,大多数细胞处于休止期(Go), G1期细胞虽有DNA合成,但DNA含量仍为2N,为二倍体细胞,;处于活跃的DNA合成期(S期)的细胞DNA 含量为2N-4N;正经历细胞分裂(G2/M期)的细胞含有最大量的DNA(4N).细胞经固定后用 PI(Propidium Iodine 碘化丙啶)等荧光染料染色即可上机测定.但标本需先经RNA酶处理以排除RNA干扰.FCM可在测量大量细胞(数分钟可测定105个细胞)后给出DNA分布直方图,见图12.10.正常人外周血DNA示意图,图中第一个峰(G1)是DNA含量为2N 的细胞峰, 第二个峰是DNA含量为4N 的细胞峰,两峰之间是DNA 含量为2N-4N的处于活跃的DNA合成期(S期)的细胞.用厂家提供的Multicycle软件,计算机可自动计算出G1%,S+G2M%;如用DNA/RNA双参数分析, 可得到G0:G1%,G0/G1期DNA指数, 如标本中有凋亡细胞,在G1峰前会出现一个亚G1期峰,软件可自动计算出凋亡细胞的%.
图12.10.正常人外周血DNA示意图(采自Coulter Training Guide)
DNA倍体分析的临床有价值的指标是DNA非整倍体和/或超二倍体%和四倍体%增高.这些改变是肿瘤细胞的特异性改变,和实体瘤相比, 急性白血病非整倍体发生率较低,约30～40%.
十. 流式细胞术在血液学中的应用 淋巴细胞亚群测定
淋巴细胞担负着免疫的主要功能.淋巴细胞亚群的测定有助于了解机体免疫状况及一些疾病的监测.临床经常测定的淋巴细胞亚群包括T淋巴细胞 (CD3+), T 辅助细胞 (CD3+CD4+), T 抑制细胞(CD3+CD8+), B 淋巴细胞(CD19+或CD20+),NK 细胞 (CD3-CD56+)等.
常用来测定淋巴细胞亚群的单克隆抗体(Monoclonal Antibody McAb)都是小鼠抗人Ig,有精制抗体,有直标荧光抗体,现在一些国外公司有双色和三色McAb出售,如CD4-FITC/CD8-RD1,CD3-CY5/CD4-FITC/CD8-PE等, 此时应根据这些双色或三色McAb的Ig性质选择相应的阴性对照,如MsIgG1-RD1/MsIgG2-FITC等.上机测定时应先测定阴性对照管,阴性对照的阳性细胞应90%病例 CD10+,而婴儿CD10+病例95%,PNH病人CD55,CD59明显减少,这种减少不仅表现在红细胞上,粒细胞,淋巴细胞也有减少.已发现CD55c可能对GPI减少或缺乏较CD59更敏感.
十五. 流式细胞术在血液学中应用 血小板功能分析和血小板病诊断
(一) 血小板功能分析
血小板膜上有丰富的糖蛋白受体,是血小板发挥其功能的物质基础,静止期和活化期血小板的膜糖蛋白受体的种类,含量,结构和功能显著不同,用不同的抗血小板单克隆抗体可测定和分析血小板功能状态.血小板质膜糖蛋白单克隆抗体CD41(GPIIb/IIIa),CD61(GPIIb/IIIa),CD42b (GPIb),CD41b (GPIIb),血小板颗粒膜糖蛋白CD62p,CD63的测定可供分析血小板功能状态,如CD62p,CD63正常血小板不表达,当血小板活化时表达明显增加,可用来测定活化血小板.
(二)血小板病诊断搅
1.血小板相关抗体测定 血小板相关抗体可因不同机制产生.抗血小板自身抗体(包括原发性,药物诱导产生,合并其它自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮)能引起严重的血小板减少.大多数原发性(免疫性)血小板减少性紫癜病人血小板上和/或血清中有抗自身血小板的血小板相关抗体PAIgG,PAIgA,PAIgM.血小板相关抗体的抗原仍不十分清楚,可能有多种,如GPⅠb,GPⅡb ,GPⅢa,Pa,或 HLA抗原. 抗血小板自身抗体也可能发生于多次输血后或怀孕期间 , 这些自身抗体多为针对HLA-Ⅰ类抗原决定簇的抗体,一般是IgG,它们可迅速破坏和清除随机供血者的血小板. 因此能迅速测定这些抗体存在与否的方法是必需的.许多不同的利用放免,荧光,酶, SPA等的测定血小板抗体的方法已建立,但这些方法都很复杂,费时;同时给出的结果只能以一定量的血小板(105)中有多少抗血小板抗体来表示.近年来发展起来的用FCM测定血小板抗体的方法具有快速,简便的优点,同时可测定血小板上和血清中的抗体;测定中FCM 分析每一个血小板表面有无抗体,能给出血小板群体中有多少血小板表面有抗体(以%表示); 同时能给出血小板相关抗体量与血小板数的直方图, 使我们了解血小板相关抗体在血小板群体中的分布情况.
FCM测定血小板抗体原理:分别用标有荧光的抗人IgG,IgA,IgM或用抗血小板GPⅠb,Ⅱb,Ⅱb/Ⅲa的抗体与分离洗净的病人的血小板和在病人血清中孵育过的正常O 型血小板作用后用FCM测定,前者测定的是病人血小板上的抗体后者测定的是病人血清中的抗体.
2.血小板无力症 血小板无力症时血小板膜GPIIb/IIIa明显减少,用血小板质膜糖蛋白单克隆抗体CD41,CD61和流式细胞仪测定不仅可测出GPIIb/IIIa减少,CD42a,CD42b基本正常或偏高,还可测出GPIIb/IIIa减少程度,分类血小板无力症.
3.巨大血小板综合征(BSS):血小板巨大, CD42a减少,CD42b减少,CD61 增加.
十六. 流式细胞术在血液学中的应用微小残留白血病检测
微小残留白血病(Minimal Residual Leukemia MRL)是指白血病经治疗后获得完全缓解(Complete Remisson CR) 后体内残留少量白血病细胞的状态.微小残留白血病与明显白血病(Overt leukemia)无明确界限, 仅是白血病细胞负荷数量不同,一般成人明显白血病时白血病细胞可达1012,经治疗获CR后≤1010, 因此MRL状态白血病细胞数可能是100-10搅.MRL是白血病复发的根源,因此检测MRL有十分重要的意义: ①指导临床治疗②预测白血病复发③评价自体骨髓移植的净化效果.应用FCM 检测MRL的优点在于可在短时间内分析大量标本,具有快速的特点.
由于白血病细胞缺乏特异性标记,FCM检测MRL的效果尚不理想,敏感性尚不够高,一般仅有1/103-104.目前主要有两类检测方法: ①用 FCM分析CR期骨髓细胞核酸量或染色体,可用于部分AL病人MRL分析,但敏感性仅1-5%.②免疫表型分析,由于尚无白血病特异的标记,只能通过与正常细胞比较某些抗原量的差别及分布部位的不同作为检测依据;如利用TdT和CD10双标记检测MRL,但敏感性亦不高,约0.1-1%.
假阴性结果可能由于: ①标本中的白血病细胞<10-4搅或<10-5;②所取标本不能代表全身骨髓情况; ③病人白血病细胞表型转换.
十七. 流式细胞术在血液学中的应用白细胞吞噬功能测定
粒,单核-巨噬细胞是机体免疫反应和免疫调节细胞中的重要成员.它们不仅具有吞噬功能,吞噬外来的微生物,肿瘤细胞等,同时又分泌多种生物因子参于免疫反应,此外单核-巨噬细胞对抗原物质的摄取,修饰,递呈等作用,是淋巴细胞的免疫功能必不可少的.因此检测白细胞吞噬功能对了解机体免疫状况有重要意义.以下简要介绍FCM 测定白细胞吞噬功能的概况.
应用光学显微镜,荧光显微镜测定白细胞吞噬功能时须分离粒,单核细胞, 并尽可能地保持细胞活性.用FCM检测时不须分离细胞,应用全血即可, 因此可在自然状态下测定 ,结果准确可靠.
目标粒子一般以酵母,细菌等能激发自然吞噬作用或予先以抗体调理化的人造粒子为好;并标以荧光,常用者为FITC(异硫氰酸荧光素)或RA(罗达明).
以肝素或拘橼酸抗凝取外周血(避免用EDTA),200μl全血与目标粒子200μl(目标粒子浓度4×107/ml)置37°C温育,温育结束后立即置冰水中, 以同样标本不在37°C 温育而置于冰水中者作为对照.目标粒子不同温育时间不一,FITC标记的金黄色葡萄球菌25 分钟 ,FITC标记的粒子15分钟即可达到吞噬饱和;此外,粒子与白细胞的比例也很重要,一般为10:1.温育结束后以溶血剂溶去红细胞即可上机检测.
应用FCM全血法测定白细胞吞噬功能,对白细胞的丢失,损伤最小; 此外用本法可测定血清中的调理素(Opsonine)水平及血清中有无吞噬作用抑制因子.如果用FITC标记的 单克隆抗体 CD13,CD14,CD15标记粒,单核细胞,用红荧光标记目标粒子,即可测定吞噬功能与细胞表面标记的关系,对白细胞吞噬功能作进一步的研究.
十八. 流式细胞术在血液学中的应用NK和LAK细胞活性测定
NK细胞存在于外周血大颗粒淋巴细胞中,它对靶细胞的细胞毒活性不依赖于抗体,无MHC限制性,它们的数量及细胞毒活性是机体免疫系统的重要指标.人NK细胞一般表达CD56,CD16,CD57部分表达CD2,CD8,CD11而不表达CD3.
LAK(Lymphokine Activated Killer cells)细胞主要存在于LGL的高密度群体中, LAK前体细胞表达NK细胞标志CD16而不表达T细胞标志如CD3,CD4,CD5等; 它们不需要抗原刺激就能杀伤NK细胞不能杀伤的肿瘤细胞,并且无MHC限制性;从表型上看大多数LAK细胞来自NK细胞,但严格讲LAK细胞对K562细胞的杀伤活性不能称作LAK活性,测定LAK 活性的靶细胞应为NK抵抗的实体瘤细胞,如HL-60细胞,HeLa细胞等.
常用的测定NK和LAK细胞活性的方法较多,如攩51Cr释放法,[3H] TdR 参入法或释放法,LDH释放法,ATP发光法等;应用放射性同位素对人体和环境不利,利用FCM测定NK和LAK细胞活性从1986年就开始摸索,方法已趋于成熟,以下介绍其中一种:
肝素抗凝取外周血后分离PBMC后洗净,调整细胞浓度为106/ml,为效应细胞; 靶细胞分别为K562和HL-60或HeLa细胞,在对数生长期受集细胞,调整浓度为106.用3mMDiO(3,3-Diacradecyloxacarbocyanine Perchlorate)标记靶细胞,效应细胞:靶细胞(E:T)为40:1,20:1,10:1和5:1,孵育后加入PI(10μg/ml)染死细胞,洗净后即可上机检测.DiO发绿荧光,PI发红荧光,利用双参数(FL1vFL2)直方图可清楚地了解靶细胞中的死亡细胞, 计算出靶细胞%溶解率.
十九.流式细胞术在血液学中的 应用造血干/祖细胞测定
造血干/祖细胞移植已广泛应用于血液肿瘤,实体瘤,某些遗传性疾病,免疫缺陷病等,因此检测造血干/祖细胞已成为临床必不可少的手段.应用流式细胞仪多色技术测定外周血造血干/祖细胞,具有快速,准确的优点,不仅能确定造血细胞数量,而且能对造血干祖细胞的质量进行评价,为临床干细胞移植治疗提供重要数据.目前多色组合一般包括CD34,CD38,HLA-DR等McAb.
CD34抗原是一种分子量约11万的糖蛋白,选择性地表达于早期造血干/祖细胞,小血管内皮细胞和胚胎纤维母细胞表面.该抗原在原始造血细胞上表达,以后随细胞分化,成熟逐渐减少直至消失,因此一直作为造血干/祖细胞表面的一种特征性标志而广泛应用于造血干细胞基础研究和临床.CD34+细胞是一群不均一的群体,依其是否表达CD38,HLA-DR,CD33,c-kit等分出的亚群表现出了不同的造血性能.最近随着造血理论的深入研究关于造血干细胞究竟是否都是CD34+细胞出现一些争论,实验研究证明, CD34-造血干细胞较CD34+造血干细胞更具造血潜能,有人经实验研究提出CD34的表达与造血干细胞的细胞动力学相关,细胞激活时CD34+,细胞处于稳定状态时CD34-;也有人提出CD34-造血干细胞较CD34+造血干细胞发育阶段更早.我们认为:成人体内可能仍保留着一小部分原始间充质细胞,他们仍保留着多向分化能力,也能向造血干细胞分化,因此体内有CD34-造血干细胞和CD34+造血干细胞是正常的,CD34-造血干细胞较CD34+造血干细胞发育阶段更早,更具造血潜能;但目前的用CD34+细胞代表造血干细胞的检查方法已足以满足临床需要,因为临床实践已证明这一点.理论研究往往能推动学术发展,开发新技术,我们期待着造血理论的不断发展给临床带来新技术,不断提高临床疗效.
我们用CD34,CD38,HLA-DR三色组合测定了151份外周血经动员后标本,CD34+细胞占单个核细胞(MNC)的(0.954±0.466)%,含量为(3.55±2.41)×109/L;其中CD34+CD38-亚群含量为(0.253±0.24)×109/L,占CD34+细胞的7.13%;CD34+HLA-DR-亚群含量为(0.273±0.310)×109/L,占CD34+细胞的7.61%;随着采集次数的增加,CD34+细胞及其亚群数量逐渐减少(P<0.05);随着供者年龄增加,其外周血CD34+细胞数逐渐减少,在≥40岁供者CD34+细胞百分比和含量比95%.目前细胞分选主要用于研究,临床应用较少.血液学应用最多的是造血干细胞的研究,最近随着造血理论的深入研究关于造血干细胞究竟是否都是CD34+细胞出现一些争论,实验研究证明, CD34-造血干细胞较CD34+造血干细胞更具造血潜能,这些实验研究所用的CD34- 和CD34+细胞就是通过细胞分选获得的.小鼠造血干细胞分选一般按lin-c-Kit+CD34+/ lin-c-Kit+CD34-分选,人造血干细胞分选一般按lin-CD34+/ lin-CD34-分选.
为避免某些遗传性血液病如海洋性贫血,异常血红蛋白病的纯合子出生,产前诊断非常重要,这些疾病的主要靶细胞是红细胞,而孕妇血循环中存在着胎儿有核红细胞,只是数量非常少,利用流式细胞仪可从孕妇血液中分选出胎儿有核红细胞(分选条件:CD45-GPA+)进行基因分析,作出产前诊断.
利用流式细胞仪分选免疫担当细胞进行细胞免疫学研究也是目前的热门课题.总之,流式细胞仪能够分选出你想得到的任何一亚群细胞,只要你想得到的某一亚群细胞有合适的单克隆抗体标记,流式细胞仪的分选功能将得到越来越多的科学研究和临床应用.
二十二. 流式细胞术在血液学中的应用 其他
流式细胞仪可能在两方面对骨髓增生异常综合症(MDS)有用,一是测定CD34阳性细胞数,以监测病情,二是测定核蛋白增殖因子(PCNA),有报告PCNA再在生障碍性贫血,骨髓增生异常综合症,白血病三种疾病中表达有明显差异,可辅助鉴别诊断.
此外流式细胞仪也可检耐药蛋白,如肺耐药相关蛋白(LRP),多药耐药蛋白(MRP), P170等.
流式细胞仪也可检测细胞因子,细胞内细胞因子如白介素系列(IL-1—IL-14),肿瘤坏死因子(TNF),干扰素(IFN)等,只要用适当的打孔剂即可用抗上述细胞因子单克隆抗体标记后用流式细胞仪测定.
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一. 流式细胞术概述
流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术, 它集计算机技术,激光技术,流体力学,细胞化学,细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能.它不仅可测量细胞大小,内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原,细胞内DNA,RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集,储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度>95%.在血液学,免疫学,肿瘤学,药物学,分子生物学等学科广泛应用.
国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司).流式细胞仪主要有两型:临床型(又称小型机,台式机)和综合型(又称大型机,分析型).BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B-D 公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur.EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型,除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能, 多用于科学研究.
二.流式细胞仪主要技术指标
1.流式细胞仪的分析速度:
一般流式细胞仪每秒检测1000～ 5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞.
2.流式细胞仪的荧光检测灵敏度:一般能测出单个细胞上5%即可区分.
3.前向角散射(FSC)光检测灵敏度:前向角散射(FSC)反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～0.5μm.
4.流式细胞仪的分辨率:通常用变异系数CV值来表示,,一般流式细胞仪能够达到1000个/秒,分选细胞纯度可达99%以上.
三.流式细胞仪主要构造和工作原理 流动室及液流驱动系统
流式细胞仪主要由以下五部分构成:①流动室及液流驱动系统②激光光源及光束形成系统③光学系统④信号检测与存储,显示,分析系统⑤细胞分选系统.
流动室(Flow Cell或Flow Chamber)是流式细胞仪的核心部件,流动室由石英玻璃制成,单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔,检测区在该孔的中心,细胞在此与激光垂直相交,在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区.流动室里的鞘液流是一种稳定流动,控制鞘液流的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统,压力感受器组成,只要调整好鞘液压力和标本管压力, 鞘液流包绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向,能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相等,从而使激光激发的荧光信息准确无误.见图12.1流动室示意图.流动室孔径有60μm,100μm,150μm ,250μm等多种,供研究者选择.小型仪器一般固定装置了一定孔径的流动室.
图12.1流动室示意图(采自Coulter Training Guide)
四. 流式细胞仪主要构造和工作原理 激光光源及光束形成系统
流式细胞仪可配备一根或多根激光管,常用的激光管是氩离子气体激光管,它的发射光波长488ηm,此外可配备氦氖离子气体激光管(波长633ηm)和/或紫外激光管.
流式细胞仪的主要测定信号荧光是由激发光激发的,荧光信号的强弱与激发光的强度和照射时间相关,激光是一种相干光源,它能提供单波长,高强度,高稳定性的光照,正是能达到这一要求的理想的激发光光源.
在激光光源和流动室之间有两个圆柱形透镜,将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束(22μm×66μm),在这种椭圆形激光光斑内激光能量成正态分布,使通过激光检测区的细胞受照强度一致.
五. 流式细胞仪主要构造和工作原理 光学系统
流式细胞仪的光学系统由若干组透镜,小孔,滤光片组成,大致可分为流动室前和流动室后两组.流动室前的光学系统由透镜和小孔组成,透镜和小孔(一般为2片透镜,1个小孔)的主要作用是将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束,使激光能量成正态分布,使通过激光检测区的细胞受照强度一致,最大限度的减少杂散光的干扰;流动室后的光学系统主要由多组滤光片组成,滤光片的主要作用是将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管.滤光片主要有三类:长通滤片(LP)--只允许特定波长以上的光线通过,短通滤片(SP)-- 只允许特定波长以下的光线通过,带通滤片(BP)-- 只允许特定波长的光线通过,不同组合的滤片可以将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管(PMT),如接收绿色荧光(FITC)的PMT前面配置的滤光片是LP550和BP525, 接收色橙红色荧光(PE)的PMT前面配置的滤光片是LP600和BP575, 接收红色荧光(CY5)的PMT前面配置的滤光片是LP650和BP675.见图12.2光学系统和信号检测系统示意图.
六. 流式细胞仪主要构造和工作原理 信号检测系统
当测定标本在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区时产生散射光和荧光信号,散射光分为前向角散射(Forward Scatter, FS)和侧向角散射或900散射(Side Scatter, SS),散射光是细胞的物理参数与细胞样本的制备(如染色)无关;荧光信号也有两种,一种是细胞自发荧光它一般很微弱,一种是细胞样本经标有特异荧光素的单克隆抗体染色后经激光激发发出的荧光,它是我们要测定的荧光,荧光信号较强,这两种荧光信号的同时存在是我们测定时需要设定阴性对照的理由,以便从测出的荧光信号中减去细胞自发荧光和抗体非特异结合产生的荧光.
前向角散射(FS)反映被测细胞的大小,它由正对着流动室的光电二极管装置接收并转变为电信号;侧向角散射或900散射(SS)反映被测细胞的细胞膜,细胞质,核膜的折射率和细胞内颗粒的性状, 它由一个光电倍增管(PMT) 接收并转变为电信号,这些电信号存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内.
流式细胞仪测定常用的荧光染料有多种,他们分子结构不同,激发光谱和发射光谱也各异,选择荧光染料时必须依据流式细胞仪所配备的激光光源的发射光波长(如氩离子气体激光管,它的发射光波488ηm,氦氖离子气体激光管发射光波长633ηm).488ηm激光光源常用的荧光染料有FITC(异硫氰酸荧光素),PE(藻红蛋白),PI(碘化丙啶),CY5(化青素),preCP(叶绿素蛋白),ECD(藻红蛋白-得克萨斯红)等.他们的激发光和发射光波长分别是:
激发光波长(ηm) 发射光峰值(ηm)
FITC 488 525(绿)
PE 488 575(橙红)
PI 488 630(橙红)
ECD 488 610(红)
CY5 488 675(深红)
PreCP 488 675(深红)
各种荧光信号由各自的光电倍增管(PMT) 接收并转变为电信号后存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内.见图12.2光学系统和信号检测系统示意图.
七. 流式细胞仪主要构造和工作原理 信号存储,显示,分析系统
(一) 信号存储
存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内的数据一般是以List mode(列表排队)方式存入的,采用List mode方式有两大优点:①节约内存和磁盘空间②易于加工处理分析.
(二)信号显示和分析
由于List mode方式数据缺乏直观性,数据的显示和分析一般采用一维直
方图(图12.3),二维点阵图(图12.4,12.5),等高线图(图12.8)和密度图(图12.7).
1.单参数数据显示和分析 细胞的每一个单参数测量数据用直方图来显 示,图中横坐标表示散射光或荧光信号相对强度值,其单位是道数,可以是线性的,也可以是对数的;纵坐标表示细胞数.见图12.3一维直方图,图中横坐标是FITC荧光信号相对强度值(对数),纵坐标表示细胞数;图中已根据阴性对照设定适当的"门"(直线门),仪器的计算机就会给出测定值(包括阳性细胞%和平均荧光强度).
2.双参数数据显示和分析 细胞的双参数测量数据和细胞数量的关系用一维直方图,二维点阵图,等高线图和密度图显示和分析.如图12.4二维点阵图,是正常人外周血白细胞的前向散射光(FS)和侧向散射光(SS)组成的点阵图,横坐标和纵坐标均是线性的,图中淋巴细胞,单核细胞,粒细胞很明显地分为3群,可以很容易地圈"门"( Bitmap,无定型门),分析各亚群细胞的数据;图12.6假三维地形图(X轴: SSC ,Y轴:FSC Z轴:细胞数)更清楚地表明这一点.图12.5二维点阵图是细胞的两种荧光(FITC和RD1)双参数数据显示,横坐标和纵坐标均是对数的,横坐标代表FITC,纵坐标代表PE,图中已设定适当的"门"(十字门),十字门的D1,D2,D3,D4门分别代表PE单阳性细胞,PE和FITC双阳性细胞 ,阴性细胞,FITC单阳性细胞.仪器的计算机就会给出两种荧光测定值(包括阴性细胞%,两种荧光各自的阳性细胞%,两种荧光的双阳性细胞%,各群细胞的平均荧光强度). 图12.7和图12.8分别是测定细胞的两种荧光双参数数据的密度图和等高线图,横坐标和纵坐标分别代表一种荧光参数,同理只要设定十字门就可得到两种荧光的各种测定值,密度图和等高线图较点阵图更直观.
3.三参数数据显示和分析 细胞的三参数测量数据和细胞数量的关系每两个数据组成一对(三参数测量数据和细胞数量每两个数据可组成6对数据)用一维直方图,二维点阵图,等高线图和密度图显示和分析.三个荧光数据关系用分光图(prism)表示,分光图可直接给出8个数据(如用ABC代表3种荧光,可有A+B+C+,A+B+C- ,A+B-C-, A-B+C+, A-B+C-, A-B-C+, A+B-C+ ,A-B-C-).见图12.9 prism,图12.9为人外周血淋巴细胞亚群测定结果的分光图,图中给出CD3,CD4,CD8组合的各种结果,如T辅助细胞(CD3+CD4+CD8-)为42.0%,如T抑制细胞(CD3+CD4+CD8-)为17.4%.
图12.5两种荧光的二维点阵图(采自Coulter Operaters Guide)
图12.7. 双参数数据的密度图(采自Coulter Operaters Guide)
图12.6假三维地形图和二维点阵图(采自Coulter Operaters Guide)
图12.8双参数数据的等高线图(采自Coulter Operaters Guide)
图12.9 分光图(prism)
八. 流式细胞仪主要构造和工作原理 细胞分选系统
如在细胞流动室上装有超声压电晶体,通电后超声压电晶体发生高频震动,可带动细胞流动室高频震动, 使细胞流动室喷咀流出的液流束断成一连串均匀的液滴, 每秒钟形成液滴上万个.每个液滴中包含着一个样品细胞, 液滴中的细胞在形成液滴前已被测量,如符合预定要求则可被充电,在通过偏转板的高压静电场时向左或向右偏转被收集在指定容器中, 不含细胞液滴或细胞不符合预定要求液滴不被充电亦不发生偏转进入中间废液收集器中,从而实现了分选. 分选的详细原理和操作请有兴趣者参考有关文献.
九. 流式细胞术在血液学中的应用 DNA倍体分析及细胞周期分析
在细胞周期内,DNA含量随细胞内时相发生周期性变化,正常情况下,大多数细胞处于休止期(Go), G1期细胞虽有DNA合成,但DNA含量仍为2N,为二倍体细胞,;处于活跃的DNA合成期(S期)的细胞DNA 含量为2N-4N;正经历细胞分裂(G2/M期)的细胞含有最大量的DNA(4N).细胞经固定后用 PI(Propidium Iodine 碘化丙啶)等荧光染料染色即可上机测定.但标本需先经RNA酶处理以排除RNA干扰.FCM可在测量大量细胞(数分钟可测定105个细胞)后给出DNA分布直方图,见图12.10.正常人外周血DNA示意图,图中第一个峰(G1)是DNA含量为2N 的细胞峰, 第二个峰是DNA含量为4N 的细胞峰,两峰之间是DNA 含量为2N-4N的处于活跃的DNA合成期(S期)的细胞.用厂家提供的Multicycle软件,计算机可自动计算出G1%,S+G2M%;如用DNA/RNA双参数分析, 可得到G0:G1%,G0/G1期DNA指数, 如标本中有凋亡细胞,在G1峰前会出现一个亚G1期峰,软件可自动计算出凋亡细胞的%.
图12.10.正常人外周血DNA示意图(采自Coulter Training Guide)
DNA倍体分析的临床有价值的指标是DNA非整倍体和/或超二倍体%和四倍体%增高.这些改变是肿瘤细胞的特异性改变,和实体瘤相比, 急性白血病非整倍体发生率较低,约30～40%.
十. 流式细胞术在血液学中的应用 淋巴细胞亚群测定
淋巴细胞担负着免疫的主要功能.淋巴细胞亚群的测定有助于了解机体免疫状况及一些疾病的监测.临床经常测定的淋巴细胞亚群包括T淋巴细胞 (CD3+), T 辅助细胞 (CD3+CD4+), T 抑制细胞(CD3+CD8+), B 淋巴细胞(CD19+或CD20+),NK 细胞 (CD3-CD56+)等.
常用来测定淋巴细胞亚群的单克隆抗体(Monoclonal Antibody McAb)都是小鼠抗人Ig,有精制抗体,有直标荧光抗体,现在一些国外公司有双色和三色McAb出售,如CD4-FITC/CD8-RD1,CD3-CY5/CD4-FITC/CD8-PE等, 此时应根据这些双色或三色McAb的Ig性质选择相应的阴性对照,如MsIgG1-RD1/MsIgG2-FITC等.上机测定时应先测定阴性对照管,阴性对照的阳性细胞应90%病例 CD10+,而婴儿CD10+病例95%,PNH病人CD55,CD59明显减少,这种减少不仅表现在红细胞上,粒细胞,淋巴细胞也有减少.已发现CD55c可能对GPI减少或缺乏较CD59更敏感.
十五. 流式细胞术在血液学中应用 血小板功能分析和血小板病诊断
(一) 血小板功能分析
血小板膜上有丰富的糖蛋白受体,是血小板发挥其功能的物质基础,静止期和活化期血小板的膜糖蛋白受体的种类,含量,结构和功能显著不同,用不同的抗血小板单克隆抗体可测定和分析血小板功能状态.血小板质膜糖蛋白单克隆抗体CD41(GPIIb/IIIa),CD61(GPIIb/IIIa),CD42b (GPIb),CD41b (GPIIb),血小板颗粒膜糖蛋白CD62p,CD63的测定可供分析血小板功能状态,如CD62p,CD63正常血小板不表达,当血小板活化时表达明显增加,可用来测定活化血小板.
(二)血小板病诊断搅
1.血小板相关抗体测定 血小板相关抗体可因不同机制产生.抗血小板自身抗体(包括原发性,药物诱导产生,合并其它自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮)能引起严重的血小板减少.大多数原发性(免疫性)血小板减少性紫癜病人血小板上和/或血清中有抗自身血小板的血小板相关抗体PAIgG,PAIgA,PAIgM.血小板相关抗体的抗原仍不十分清楚,可能有多种,如GPⅠb,GPⅡb ,GPⅢa,Pa,或 HLA抗原. 抗血小板自身抗体也可能发生于多次输血后或怀孕期间 , 这些自身抗体多为针对HLA-Ⅰ类抗原决定簇的抗体,一般是IgG,它们可迅速破坏和清除随机供血者的血小板. 因此能迅速测定这些抗体存在与否的方法是必需的.许多不同的利用放免,荧光,酶, SPA等的测定血小板抗体的方法已建立,但这些方法都很复杂,费时;同时给出的结果只能以一定量的血小板(105)中有多少抗血小板抗体来表示.近年来发展起来的用FCM测定血小板抗体的方法具有快速,简便的优点,同时可测定血小板上和血清中的抗体;测定中FCM 分析每一个血小板表面有无抗体,能给出血小板群体中有多少血小板表面有抗体(以%表示); 同时能给出血小板相关抗体量与血小板数的直方图, 使我们了解血小板相关抗体在血小板群体中的分布情况.
FCM测定血小板抗体原理:分别用标有荧光的抗人IgG,IgA,IgM或用抗血小板GPⅠb,Ⅱb,Ⅱb/Ⅲa的抗体与分离洗净的病人的血小板和在病人血清中孵育过的正常O 型血小板作用后用FCM测定,前者测定的是病人血小板上的抗体后者测定的是病人血清中的抗体.
2.血小板无力症 血小板无力症时血小板膜GPIIb/IIIa明显减少,用血小板质膜糖蛋白单克隆抗体CD41,CD61和流式细胞仪测定不仅可测出GPIIb/IIIa减少,CD42a,CD42b基本正常或偏高,还可测出GPIIb/IIIa减少程度,分类血小板无力症.
3.巨大血小板综合征(BSS):血小板巨大, CD42a减少,CD42b减少,CD61 增加.
十六. 流式细胞术在血液学中的应用微小残留白血病检测
微小残留白血病(Minimal Residual Leukemia MRL)是指白血病经治疗后获得完全缓解(Complete Remisson CR) 后体内残留少量白血病细胞的状态.微小残留白血病与明显白血病(Overt leukemia)无明确界限, 仅是白血病细胞负荷数量不同,一般成人明显白血病时白血病细胞可达1012,经治疗获CR后≤1010, 因此MRL状态白血病细胞数可能是100-10搅.MRL是白血病复发的根源,因此检测MRL有十分重要的意义: ①指导临床治疗②预测白血病复发③评价自体骨髓移植的净化效果.应用FCM 检测MRL的优点在于可在短时间内分析大量标本,具有快速的特点.
由于白血病细胞缺乏特异性标记,FCM检测MRL的效果尚不理想,敏感性尚不够高,一般仅有1/103-104.目前主要有两类检测方法: ①用 FCM分析CR期骨髓细胞核酸量或染色体,可用于部分AL病人MRL分析,但敏感性仅1-5%.②免疫表型分析,由于尚无白血病特异的标记,只能通过与正常细胞比较某些抗原量的差别及分布部位的不同作为检测依据;如利用TdT和CD10双标记检测MRL,但敏感性亦不高,约0.1-1%.
假阴性结果可能由于: ①标本中的白血病细胞<10-4搅或<10-5;②所取标本不能代表全身骨髓情况; ③病人白血病细胞表型转换.
十七. 流式细胞术在血液学中的应用白细胞吞噬功能测定
粒,单核-巨噬细胞是机体免疫反应和免疫调节细胞中的重要成员.它们不仅具有吞噬功能,吞噬外来的微生物,肿瘤细胞等,同时又分泌多种生物因子参于免疫反应,此外单核-巨噬细胞对抗原物质的摄取,修饰,递呈等作用,是淋巴细胞的免疫功能必不可少的.因此检测白细胞吞噬功能对了解机体免疫状况有重要意义.以下简要介绍FCM 测定白细胞吞噬功能的概况.
应用光学显微镜,荧光显微镜测定白细胞吞噬功能时须分离粒,单核细胞, 并尽可能地保持细胞活性.用FCM检测时不须分离细胞,应用全血即可, 因此可在自然状态下测定 ,结果准确可靠.
目标粒子一般以酵母,细菌等能激发自然吞噬作用或予先以抗体调理化的人造粒子为好;并标以荧光,常用者为FITC(异硫氰酸荧光素)或RA(罗达明).
以肝素或拘橼酸抗凝取外周血(避免用EDTA),200μl全血与目标粒子200μl(目标粒子浓度4×107/ml)置37°C温育,温育结束后立即置冰水中, 以同样标本不在37°C 温育而置于冰水中者作为对照.目标粒子不同温育时间不一,FITC标记的金黄色葡萄球菌25 分钟 ,FITC标记的粒子15分钟即可达到吞噬饱和;此外,粒子与白细胞的比例也很重要,一般为10:1.温育结束后以溶血剂溶去红细胞即可上机检测.
应用FCM全血法测定白细胞吞噬功能,对白细胞的丢失,损伤最小; 此外用本法可测定血清中的调理素(Opsonine)水平及血清中有无吞噬作用抑制因子.如果用FITC标记的 单克隆抗体 CD13,CD14,CD15标记粒,单核细胞,用红荧光标记目标粒子,即可测定吞噬功能与细胞表面标记的关系,对白细胞吞噬功能作进一步的研究.
十八. 流式细胞术在血液学中的应用NK和LAK细胞活性测定
NK细胞存在于外周血大颗粒淋巴细胞中,它对靶细胞的细胞毒活性不依赖于抗体,无MHC限制性,它们的数量及细胞毒活性是机体免疫系统的重要指标.人NK细胞一般表达CD56,CD16,CD57部分表达CD2,CD8,CD11而不表达CD3.
LAK(Lymphokine Activated Killer cells)细胞主要存在于LGL的高密度群体中, LAK前体细胞表达NK细胞标志CD16而不表达T细胞标志如CD3,CD4,CD5等; 它们不需要抗原刺激就能杀伤NK细胞不能杀伤的肿瘤细胞,并且无MHC限制性;从表型上看大多数LAK细胞来自NK细胞,但严格讲LAK细胞对K562细胞的杀伤活性不能称作LAK活性,测定LAK 活性的靶细胞应为NK抵抗的实体瘤细胞,如HL-60细胞,HeLa细胞等.
常用的测定NK和LAK细胞活性的方法较多,如攩51Cr释放法,[3H] TdR 参入法或释放法,LDH释放法,ATP发光法等;应用放射性同位素对人体和环境不利,利用FCM测定NK和LAK细胞活性从1986年就开始摸索,方法已趋于成熟,以下介绍其中一种:
肝素抗凝取外周血后分离PBMC后洗净,调整细胞浓度为106/ml,为效应细胞; 靶细胞分别为K562和HL-60或HeLa细胞,在对数生长期受集细胞,调整浓度为106.用3mMDiO(3,3-Diacradecyloxacarbocyanine Perchlorate)标记靶细胞,效应细胞:靶细胞(E:T)为40:1,20:1,10:1和5:1,孵育后加入PI(10μg/ml)染死细胞,洗净后即可上机检测.DiO发绿荧光,PI发红荧光,利用双参数(FL1vFL2)直方图可清楚地了解靶细胞中的死亡细胞, 计算出靶细胞%溶解率.
十九.流式细胞术在血液学中的 应用造血干/祖细胞测定
造血干/祖细胞移植已广泛应用于血液肿瘤,实体瘤,某些遗传性疾病,免疫缺陷病等,因此检测造血干/祖细胞已成为临床必不可少的手段.应用流式细胞仪多色技术测定外周血造血干/祖细胞,具有快速,准确的优点,不仅能确定造血细胞数量,而且能对造血干祖细胞的质量进行评价,为临床干细胞移植治疗提供重要数据.目前多色组合一般包括CD34,CD38,HLA-DR等McAb.
CD34抗原是一种分子量约11万的糖蛋白,选择性地表达于早期造血干/祖细胞,小血管内皮细胞和胚胎纤维母细胞表面.该抗原在原始造血细胞上表达,以后随细胞分化,成熟逐渐减少直至消失,因此一直作为造血干/祖细胞表面的一种特征性标志而广泛应用于造血干细胞基础研究和临床.CD34+细胞是一群不均一的群体,依其是否表达CD38,HLA-DR,CD33,c-kit等分出的亚群表现出了不同的造血性能.最近随着造血理论的深入研究关于造血干细胞究竟是否都是CD34+细胞出现一些争论,实验研究证明, CD34-造血干细胞较CD34+造血干细胞更具造血潜能,有人经实验研究提出CD34的表达与造血干细胞的细胞动力学相关,细胞激活时CD34+,细胞处于稳定状态时CD34-;也有人提出CD34-造血干细胞较CD34+造血干细胞发育阶段更早.我们认为:成人体内可能仍保留着一小部分原始间充质细胞,他们仍保留着多向分化能力,也能向造血干细胞分化,因此体内有CD34-造血干细胞和CD34+造血干细胞是正常的,CD34-造血干细胞较CD34+造血干细胞发育阶段更早,更具造血潜能;但目前的用CD34+细胞代表造血干细胞的检查方法已足以满足临床需要,因为临床实践已证明这一点.理论研究往往能推动学术发展,开发新技术,我们期待着造血理论的不断发展给临床带来新技术,不断提高临床疗效.
我们用CD34,CD38,HLA-DR三色组合测定了151份外周血经动员后标本,CD34+细胞占单个核细胞(MNC)的(0.954±0.466)%,含量为(3.55±2.41)×109/L;其中CD34+CD38-亚群含量为(0.253±0.24)×109/L,占CD34+细胞的7.13%;CD34+HLA-DR-亚群含量为(0.273±0.310)×109/L,占CD34+细胞的7.61%;随着采集次数的增加,CD34+细胞及其亚群数量逐渐减少(P<0.05);随着供者年龄增加,其外周血CD34+细胞数逐渐减少,在≥40岁供者CD34+细胞百分比和含量比95%.目前细胞分选主要用于研究,临床应用较少.血液学应用最多的是造血干细胞的研究,最近随着造血理论的深入研究关于造血干细胞究竟是否都是CD34+细胞出现一些争论,实验研究证明, CD34-造血干细胞较CD34+造血干细胞更具造血潜能,这些实验研究所用的CD34- 和CD34+细胞就是通过细胞分选获得的.小鼠造血干细胞分选一般按lin-c-Kit+CD34+/ lin-c-Kit+CD34-分选,人造血干细胞分选一般按lin-CD34+/ lin-CD34-分选.
为避免某些遗传性血液病如海洋性贫血,异常血红蛋白病的纯合子出生,产前诊断非常重要,这些疾病的主要靶细胞是红细胞,而孕妇血循环中存在着胎儿有核红细胞,只是数量非常少,利用流式细胞仪可从孕妇血液中分选出胎儿有核红细胞(分选条件:CD45-GPA+)进行基因分析,作出产前诊断.
利用流式细胞仪分选免疫担当细胞进行细胞免疫学研究也是目前的热门课题.总之,流式细胞仪能够分选出你想得到的任何一亚群细胞,只要你想得到的某一亚群细胞有合适的单克隆抗体标记,流式细胞仪的分选功能将得到越来越多的科学研究和临床应用.
二十二. 流式细胞术在血液学中的应用 其他
流式细胞仪可能在两方面对骨髓增生异常综合症(MDS)有用,一是测定CD34阳性细胞数,以监测病情,二是测定核蛋白增殖因子(PCNA),有报告PCNA再在生障碍性贫血,骨髓增生异常综合症,白血病三种疾病中表达有明显差异,可辅助鉴别诊断.
此外流式细胞仪也可检耐药蛋白,如肺耐药相关蛋白(LRP),多药耐药蛋白(MRP), P170等.
流式细胞仪也可检测细胞因子,细胞内细胞因子如白介素系列(IL-1—IL-14),肿瘤坏死因子(TNF),干扰素(IFN)等,只要用适当的打孔剂即可用抗上述细胞因子单克隆抗体标记后用流式细胞仪测定.
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