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论文分类号:O631 单位代码: 10183
密 级:内部 研究生学号:9908031
吉 林 大 学
硕 士 学 位 论 文
单分子力化学:多糖单链力谱的研究
Single molecule mechanochemistry: force
spectroscopy on polysaccharides
作者姓名: 许巧兵
专 业: 高分子化学与物理
导师姓名: 张希 教授
论文起止年月:1999年9月至2002年6月
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目录
提要 iii
第一章 单分子力谱仪的工作原理及应用 1
§1-1 原子力显微镜(AFM)的原理 2
§1-2 单分子单链拉伸实验的装置原理及操作过程 5
§1-3 多糖单分子力学性质的AFM研究 7
第二章 -, -, -角叉藻糖的一级结构的单链力学研究 16
§2-1 介绍 16
§2-2 仪器及药品 16
§2-3 结果与讨论 18
第三章 角叉藻糖的二级结构的力学研究 25
§3.1 介绍 25
§3.2 材料的选择及溶液的配制 25
§3.3 结果与讨论 26
小结 30
展望 31
参考文献 32
摘要 39
Abstract 41
致谢 iv
作者简历 v
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iii
摘 要
本论文旨在利用基于AFM的单分子力谱方法,研究角叉藻糖的单链力学
性质. -角叉藻糖在力曲线上表现出一明显的平台,这是有1a-4a连接的吡喃
糖环在外力作用下产生椅式-反转椅式的构象转变而产生的.而对 -, -角叉
藻糖由于1a-4a连接的吡喃糖环上氧桥键的存在,抑制了吡喃糖环的构象转变,
导致力曲线上的平台消失了.我们知道在理论上,由于空间阻碍的存在,氧桥
键抑制吡喃糖环的构象转变是不证自明的道理,而此处我们首先用实验的方法
证明了它.另外, -角叉藻糖在碘化钠的作用下可以从无规线团结构转化成螺
旋结构,本实验在单分子的角度给出了此离子诱导形成的螺旋结构的力学信
息,在外力作用下螺旋的打开在力曲线上出现一个高约为300pN的长平台.
关键词: 单分子力谱,单链拉伸,多糖,一级构象转化,离子诱导,螺旋
二级结构.
Keywords: Single-molecule Force Spectroscopy, Single-Chain Elongation,
Polysaccharides, Conformational Transition, Ion-induced, Helix
Structure.
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iv致谢
本论文是在张希教授的直接指导下完成的.从论文的选题,实验的设计到
论文的完成都得到了张老师的悉心指导,老师渊博的学识,活跃的思想,严谨
的治学态度,求实的科研作风和忘我的工作精神都使我深受启发,受益匪浅.
在此谨向我尊敬的导师致以衷心的感谢和敬意!
在论文的完成过程及几年的学习生活中,得到了沈家骢院士许多指导,关
心和帮助,先生敏锐的思想,丰富的经验,锐意求新的科研作风都使我深深受
益.在此向他表示最诚挚的谢意!
在实验,测试和论文的完成过程中还得到了张文科师兄很多帮助.同时我
想感谢李宏斌师兄在实验过程中的有益的讨论, 以及王治强老师,王力彦老
师,邹钐师姐,张丽师姐,孙俊奇,邹勃,付昱,吴涛等师兄和钱雪蕾,崔树
勋,王驰,霍峰蔚,仇登利等同学也在实验过程中给予了许多关心和帮助,在
此向他(她)们表示感谢!另外对开放实验室的各位老师和董彬,陈欢,石峰,
许华平,王明锋,张璐等同学的支持和帮助,也表示深深的谢意.
在此还特别感谢我的妻子翟淑娅在我研究生三年期间生活上的关心和事
业上的支持.
第一章 单分子力谱仪的工作原理及应用
人类依靠感官来认识世界,而仪器的发明和使用使感官得到延伸.普通人
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眼的分辨率约为0.2mm,这使得人们无法对更小的物质进行认知和理解.17
世纪光学显微镜的发明使人类进入了观察微观世界的时代,光学显微镜可在
x,y二维方向上观察物体的形貌.由于受光波波长的限制,光学显微镜的分
辨率一般仅能达到微米级水平.20世纪30年代发明了另一种广泛用于观察物
质微观形貌的显微镜--电子显微镜,逐步把人们带入了认知微观世界的时代.
1982年,Bining和Rohrer [1,2]等成功发明了第三代显微镜--扫描隧道显微
镜(Scanning Tunneling Microscopy, STM).它的出现,使人类第一次能够实
时地观察单个原子在物质表面的排列状态和与表面电子行为有关的物理,化学
性质.其后,原子力显微镜 (AFM),侧向力显微镜 (LFM),磁力显微镜
(MFM),静电力显微镜 (EFM),力调制显微镜(FMM),扫描电容显微镜 (SCM),
扫描电化学显微镜 (SECM),扫描近场光学显微镜 (SNOM)等相继问世,统称
为扫描探针显微镜(Scanning Probe Microscopy, SPM),它们把人们从二维微
观世界带入认知三维微观空间的广阔领域.SPM超越了光和电子波长对显微
镜分辨率的限制,可以在三维立体空间观察物质的形貌,并获得探针和样品相
互作用的信息.其中,分辨率最高的是扫描隧道显微镜,可以对原子成像,而
典型原子力显微镜的侧向分辨率(x,y方向)也可达到2nm,垂直分辨率(z
方向)小于0.1nm.SPM以其操作容易,样品制备简单,工作环境不受限制,
分辨率高等优点,在生命科学,纳米科学,材料科学,表面科学中得到广泛深
入的应用和发展.
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§1-1 原子力显微镜(AFM)的原理
Figure 1-1 The principle of the Atomic Force Microscope
AFM的原理比较简单,它是用一个对微弱力极敏感的微小探针和样品表
面轻轻接触来获得信息[2].如图1-1所示,当针尖与样品接近时,针尖尖端原
子与样品表面原子间存在微弱排斥力,这种力作用使微悬臂发生偏离或振幅改
变.悬臂的这种变化经检测系统检测后转变成电信号,传递给反馈系统和成像
系统,记录扫描过程中探针的一系列变化过程就可以获得样品表面的信息图
像.下面分别介绍检测系统,扫描系统和反馈控制系统.
一,检测系统
AFM图像是通过在样品表面扫描时测量微悬臂受力弯曲或振幅改变的程
度得到的,检测方法包括隧道电流法,电容检测法,光反射法,光干涉法.目
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前,AFM系统中常用的是光反射法检测系统,具有简便灵敏的特点.激光反
射检测系统由探针,激光发生器和光检测器组成.
1,探针
探针是AFM检测系统的关键部分,它是由微悬臂和悬臂末端的针尖组成.
随着加工技术的发展,人们已经能制造出各种形状和特殊要求的探针.悬臂是
由Si或Si3N4经光刻技术加工而成的.悬臂的背面镀有一层金属以达到反射的
要求.Si3N4针尖常为V-型悬臂,如图1-2,针尖为金字塔形,尖端直径约为
20-50nm,弹性系数变化范围在几十N/m到百分之几N/m之间,其共振频率
一般大于10Hz.Si针尖通常用于AFM测量中的Tapping模式,悬臂由单晶硅
制成,弹性系数在20-100N/m,共振频率范围一般在200-400KHz之间.
Figure 1-2 Scanning electron microscopy image of the AFM tip.
2,光检测器
AFM的信号检测是通过光电检测器来完成的.激光由光源发出,照在金
属包覆的悬臂上,经反射后进入光电二极管检测系统.然后,通过电子线路把
照在两个二极管上的光量差转换成电压信号方式来指示光点位置.
二极管位敏检测器一般由ABCD四个独立二极管子部分组成.当探针接触样
品时,反射激光量在四个二极管的分布发生变化,其中(A C-B-D)的变
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化与高度形貌图有关,而(A B-C-D)反映侧向力的变化,与摩擦力图像
直接相关.
二,扫描系统
SPM对样品扫描的精确控制是依靠扫描器来实现的.扫描器中装有压电
转换器.压电装置在x,y,z三个方向上精确控制样品或探针位置.目前构成
扫描器的基质材料主要是由钛锆酸铅[Pb(Ti,Zr)O3] 制成的压电陶瓷材料.压电
陶瓷有压电效应,即在加压时有收缩特性,并且收缩的程度与所加电压成正比
关系.压电陶瓷能将1mV-1000V的电压信号转换成十几分之一纳米到几微米
的位移.
目前,扫描器多呈管状,控制不同方向的压电陶瓷块组装在一起构成一个
在x,y和z方向控制极其精确的扫描器.在一些SPM系统中(如Multimode
SPM),扫描器移动样品而探针相对静止,而在另一些SPM系统中(如
Dimension series SPM),样品静止不动而扫描器移动探针运动.
三,反馈控制系统
SPM反馈控制是由电子线路和计算机系统共同完成的.控制系统主要有
两个功能:1,提供控制压电转换器x-y方向扫描的驱动电压.2,在恒力模式
中维持来自显微镜检测环路输入模拟信号在一恒定数值.计算机通过A/D转
换读取比较环路电压(即设定值与实际测量值之差).根据电压值不同,控制
系统不断地输出相应电压来调节z方向压电传感器的伸缩,以纠正读入A/D
转换器的偏差,从而维持比较环路的输出电压恒定.
电子线路系统起到计算机和扫描系统相连接的作用.电子线路为压电陶瓷
管提供电压,接收<a name=baidusnap0></a><B style=\'color:black;background-color:#ffff66\'>位置传感器</B>件传来的信号,并构成控制针尖和样品之间距离
的反馈系统.SPM有两种基本的反馈模式:1,恒力(或恒电流)模式,即接
通反馈系统.当打开反馈系统时,调节样品位置的压电陶瓷管根据样品和针尖
接触力的大小来上下移动样品以保持针尖与样品之间距离恒定,即恒力.通常
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用此模式可以获得样品高度形貌图.2,恒高度模式,即断开反馈系统.关闭
反馈系统时,样品在z方向不移动,通过样品与针尖在不同位置作用力的不同
来检测样品的起伏变化.此种模式适用于表面十分平整的样品.
§1-2 单分子单链拉伸实验的装置原理及操作过程
本论文实验中,单链拉伸实验所用的仪器是建立在AFM原理基础上的单
分子力谱仪,采用悬臂表面镀金的Si3N4针尖.
Figure 1-3 Schematic of the experimental set-up
如图1-3和1-4所示,聚合物样品通过物理吸附或化学键合及特异性相互
作用等方式固定在基片表面,不同作用方法所使用的基片也不同,可以采用玻
璃片,云母片,石英片,金片及其他表面修饰的基片等.这样,聚合物或生物
大分子可以在基片表面形成一个很薄的吸附层.当压电陶瓷管在z方向运动
时,AFM针尖与样品层相接触.由于针尖与样品之间的相互作用,高分子链
将吸附到针尖上.当样品远离针尖运动时,高分子链受到拉伸,引起微悬臂的
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弯曲,具体的过程如下:
Figure 1-4. Schematic of a single-molecule force spectroscopy experiment.
Ⅰ, 悬臂开始并没有接触到表面,在这时候如果悬臂没有受到长程力的吸引
(或排斥),这种接触力曲线表现为一条直线.
Ⅱ, 当探测针尖接近到样品表面,悬臂偏转增加,如果样品足够坚硬,作用
力将随着压电陶瓷管的向上运动而增加;如果样品是柔软的,而悬臂是相对静
止的,探测针尖可能在接触点处压入样品表面.这样,通过分析力曲线上的接
触部分的倾斜状况就可以得到关于样品表面弹性的初步信息.
Ⅲ ,在接触的过程中,一些分子通过特异性或非特异性作用力将会吸附到针
尖上,当针尖与样品分离时,连到针尖与基片之间的高分子链会被拉伸,而这
种针尖和样品的相互作用会引起悬臂弯曲,导致力曲线上力信号的偏转.
Ⅳ 当高分子链从针尖上脱落时,悬臂复原(不受力的状态),表现在力曲线
上为力值迅速掉落回零点.
Ⅴ 力曲线表现出与初始逼近状态一样的无偏转的直线状态.
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§1-3 多糖单分子力学性质的AFM研究
随着精确到纳米及埃数量级的,敏感至皮牛顿级的微观探测技术的不断发
展和完善,人们可以设计对单分子进行直接测量和研究[3-4,10].人们可以得到
单分子尺度上用一般方法得不到信息,如多糖的一级构象转化[4-9],蛋白质分
子的折叠与解折叠[3,11-15],螺旋超结构的解缠[16-19].利用AFM技术对微小力
的极度敏感性质,我们可以在纳牛甚至在皮牛尺度上得到一些力的信息[27],
如DNA碱基对间作用力[17-26],主客体相互作用[28-32],甚至单个化学键的强度
[33].利用单分子力谱仪我们还可以解决一些高分子链段弹性的问题[34-44].Gaub
等首先将单分子力学方法与AFM成像技术结合[45],研究了单个细胞膜蛋白拉
伸的信息,为单链技术与其它表征技术的结合开拓了新的领域.
一:多糖分子的一级结构构象转变研究
生物多糖分子以其良好的水溶性质和广泛的生物机制研究背景,被越来越
多的研究者所重视.自从Gaub首先利用单分子力谱方法研究高分子单链力学
性质以来,葡聚糖(dextran)的\"肩式\"(或称为\"平台\"式)力曲线形式成为
多糖力曲线典型的代表[4],如图1-5所示,\"平台\"出现在力值为750pN附近.
这类力曲线的发现,引起了研究构象的科学家们对多糖单链研究的强烈兴趣.
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Figure 1-5 Subsequent force measurements of carboxymethylated dextran.
The characteristic -shoulder- observed at a force of approximately 750pN results
from a conformational transition of the polysaccharide chain.
P. Marszalek[5]和李宏斌[6,13]对纤维素(cellulose)和直链淀粉(amylose)等多
糖的单链力学性质进行了深入的研究,发现对于不同连接方式的多糖,其构象
转化会导致不同的力曲线.纤维素和直链淀粉的重复单元均为葡萄糖环
(glucan), 对于纤维素,其连接方式为1,4-β连接,连接重复单元的两个键
都是e 键,即1e-4e连接,此连接方式的葡萄糖环的最稳定构象为椅式构象.
在外力的作用下,葡萄糖环可以发生椅式到船式的构象转化,从图示可以看出,
由1e-4e连接方式的葡萄糖环在拉伸时不发生构象变化,表现在力曲线上为一
单调上升的力曲线,如图1-6 所示,这种多糖的力曲线没有出现葡聚糖力曲
线中的平台.
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Figure 1-6 The typical force-extension curves of CM-cellulose, the 1e-4e linkage of
the glucopyranose contributes no plateau in the force curves.
而对直链淀粉,其重复单元连接方式为1,4-α连接,连接重复单元吡喃糖环
的两个键为e键和a键,即1a-4e连接,此连接方式的葡萄糖环在外力作用
下由椅式转变为船式时会产生力矩,此时有焓变.因此推测力曲线上平台的出
现有可能是由于糖环的椅式-船式构象变化引起的,图1-7a所示.这已被多个
实验证实.如果直链淀粉力曲线上的平台真是由葡萄糖环的椅式-船式构象变
化引起的,那么我们可以预测如果将此糖环破坏掉,将得不到含有平台的力曲
线.由于在直链淀粉重复单元的糖环中的羟基是邻位顺式的,我们可以利用高
碘酸的氧化作用将此连接方式的葡萄糖吡喃环断开.最终的实验结果正如我们
所预测的那样,经高碘酸处理过的直链淀粉在实验中得不到含有平台的力曲
线.另外,理论计算也给了部分证据.如图1-8所示,由理论计算得知,这种
α-1,4位连接的直链淀粉力曲线上的转变对映了葡萄糖吡喃环 的椅式到船
式的构象转变[7].而这个转变能垒大约为4.6 kcal/mol(力曲线上的阴影部分为
我们实验过程中所做的功,通过积分可得出此功的大小),这个实验积分能垒
值与ab initial模拟所得结果基本吻合(2.5-4.8 kcal/mol).
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Figure 1-7 the typical force extension curves obtained from the CM-amylose, the
shoulder in the force curve is ascribed to the chair-boat transition of the
glucopyranose.
Figure 1-8 (a) The diagrams show that the distance between two consecutive
glycosidic oxygens O1-O4 increases during force-driven chair-boat transition; (b)
A force-extension curve for amylose was fitted with the FJC model.
同时,肝素也是一类α-1,4位连接的多糖,其葡萄糖吡喃环的连接方式为1a
-4e连接,这样的连接方式的多糖的力曲线上也存在一个平台,如图1-9所示
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[6],只是平台的高度比直链淀粉力曲线中的平台较高,这是由于其不同的侧基
引起的.
Figure 1-9 The comparison of the force-curve between the CM-amylose and
heparin, a shoulder also apears in the force curve of heparin which ascribes to
the conformational transition of the α-1,4 linkage of the glucopyranose.
对于胶质(pectin)[8],它是一种重复单元由2个都是a键连接的多糖,即1
a-4 a连接如图1-10右图所示.其力曲线上表现出2个台阶,如图1-10左图
所示,产生2个台阶的原因是由于糖环的椅式-船式-反转椅式的两级构象转化
的结果.同样,经高碘酸钠处理后的胶质的单链力谱上的台阶消失,这意味着
2个台阶的力曲线也是由吡喃环的构象变化产生的.
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Figure 1-10 The typical force curve of pectin, the two step shoulders in the force
curve is mainly attributed to the chair-boat-inverted chair transition of the 1a-4a
linked galactose.
二:多糖分子的二级结构的构象变化
对于生命体系中的多糖,很容易形成螺旋的二级结构.类黄原胶分子
(xanthan)是一类天然高分子.天然状态下的类黄原胶分子在溶液中以α-螺
旋结构 形式存在[13,16].图1-11左图为在外力作用下α-螺旋结构的打开过程
的典型力曲线,有一长平台出现,对应着螺旋结构的打开.加热变性后的类黄
原胶分子的α-螺旋结构转变成无规线团结构,因而体现在力曲线上为单调上
升的力曲线.而其变性后分子链段弹性性质表现为与同样是β-连接的甲基纤
维素的分子弹性相似,如图1-11右图所示.
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Figure 1-11 (L) Several force-distance curves of native xanthan directly
monitored one after the other without loss of the molecular contact; (R) Denatured
xanthan and carboxymethyl cellulose exhibit practically identical features.
三,利用多糖的指纹特征对一些力的作用的探测
对于单个共价键强度的准确测量一直都是化学家,物理学家追求的目标.
然而至今还没有有效的准确测量单键的手段.随着纳米技术和仪器的发展,目
前单键强度的测量也得到了实现.Grandbois等[33]报道了两种类型的共价键
Si-C及Au-S的键强,分别为2nN和1.4nN.实验中,他们将直链淀粉做为拉
伸参照,由于直链淀粉在275pN处有特征\"平台\",对应着六元糖环的转变过程.
如果多个链被同时拉伸,则\"平台\"的高度会增加或被多个力信号掩盖.因此,
从直链淀粉的特征力曲线可很容易的辨别出是否为单个链的拉伸,如图1-12
所示.从图1-13 可看出,拉伸断裂的方式只有 四种,为Si-O,Si-C,C-C,
C-N.根据价键理论,再由统计分布(图1-14)得出最可能的断裂方式为Si-C
键的断裂.通过直链淀粉在拉伸时出现的平台为指纹特征,并且用未共价连接
的样品作参照实验,我们可以得出Si-C键的断裂强度.
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Figure 1-12 (A) Stretching of a single polysaccharide chain that is covalently
attached to the AFM tip and the substrate, (B) Schematics of the covalent
attachment of the amylose by carbodiimide chemistry to glass or Au surfaces,
which were both functionalized with amino groups.
Figure 1-13 Force extension curve of the amyloase covalently bound between the
AFM tip and a silicon oxide surface. Below is the control force extension curve of
amylose without covalently bound to the surface.
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Figure 1-14 Probability of bonds rupture.
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第二章 κ-,ι-,λ-角叉糖的一级结构单链力学性质[64]
§2.1 介绍
由于多糖在生物体系中的重要作用,以及多糖单链单分子力曲线中的由构
象转变引起的特殊的力信号,使多糖的单分子构象的研究已经引起研究构象的
化学家以及一些理论化学家的广泛兴趣[4-9].利用单分子力谱仪的力信号的高
度灵敏性和多糖分子的指纹特征来探测共价键的作用力的大小,这是用传统方
法无法得到的.P. Marszalek[5,8]等利用邻位顺式羟基可以被氧化断开的特点,
用高碘酸钠氧化葡萄糖环,单链实验证明经过高碘酸钠糖处理过的直链淀粉中
得不到含有平台的力曲线.说明环的断裂使得环的船式椅式的构象转化消失
了.同时我们想,既然将环破坏了可以使其构象转化消失,那么由于受到空间
阻碍的作用,我们在环上引入一个桥,则船式椅式的构象转化亦能够被抑制.
本实验利用单分子力谱仪在实验上证明了六元环在外力作用下的构象转化可
以被桥键所抑制.
§2.2仪器及药品
1. 实验仪器
实验所用的单分子力谱仪(Single-molecule Force Spectroscopy)是在德国
慕尼黑大学H. E. Gaub教授帮助下建立的专门用于聚合物单链拉伸的自制仪
器.单分子力谱仪与商用的AFM比较有如下优点:首先,单分子力谱仪的分
辨率高,采集数据点可达到4096个点,而普通商用AFM最高只有512个点.
另外,单分子力谱仪可以手控调节测量拉伸的模式和扫描范围,能进行测量研
究中所必需的往复拉伸实验等.
Si3N4针尖分别购自Digital Instruments (DI, Santa Barbara, CA)和PARK
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Scientific Instruments (PARK, Sunnyvale, CA).为避免误差,每次实验均使用新
针尖.针尖弹性系数由测量针尖的热扰动计算可得[46].本实验中选取的针尖
通过针尖弹性系数可将拉伸实验所得的信号经软件处理转化为力-拉伸曲线.
测量的弹性系数在42-65mN m-1范围内.根据文献报道及以往实验结果分析,
在此弹性系数范围内,针尖和悬臂弹性对聚合物链的拉伸弹性没有贡献.
2. 实验基片的制备
基片采用生物实验中的玻璃载片和盖片.使用前,载片以3:7 H2O2/浓H2SO4
煮沸至无气泡,大量超纯水清洗,放入洁净干燥器中干燥.盖片依次用水,乙
醇,氯仿,乙醇,水超声,并以大量纯水清洗,干燥后使用.这样洗的基片实
验证明是很干净的.样品的制备方法有很多种,在此实验中,将聚合物溶液滴
到干净的玻璃片上,约400μL,隔离空气放置4-6小时,移去玻璃片上多余
的溶液,立即进行单链拉伸实验.
3. 实验用样品
κ-,ι-,λ- 型角叉藻糖都是从Sigma购得,能直接溶于水,溶液浓度都
是0.15mg.ml-1.三种角叉藻糖的理想重复单元都是由1,3连接-β-D-半乳糖和
1,4连接-α-D-半乳糖组成,它们的1,3连接-β-D-半乳糖重复单元完全一致,
而对1,4连接-α-D-半乳糖重复单元它们存在很小的差异,对κ-,ι- 型角叉藻
糖有一氧桥键在吡喃糖环上,而对λ- 型角叉藻糖却无此氧桥键的存在,其
1,4连接的α-D-糖环的2个连接键均为a键,即1a-4a连接,而以1,3
连接-β-D-半乳糖却是1e-3e连接.如图2-1所示.
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Figure 2-1 The ideally repeating unit of the primary structure of carrageenan.
§2.3 结果与讨论
图2-2 是从λ-型角叉藻糖中获得的典型力曲线,我们可以看出其中有
平台出现,这些力曲线形状类似于羧甲基化淀粉中获得的力曲线(图1-7).
Figure 2-2 The typical force curves of -carrageenan, in which a marked shoulder
appears which is ascribed to the conformational transition of the 1,4-linked
galactose.
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对λ-型角叉藻糖力曲线中平台的出现,我们推测可能也是由于糖环的一
级构象转变所致,因为在λ-型角叉藻糖的重复单元中前一部分的糖环为1,3
-β连接,连接键为1e-3e,在外力作用下,糖环不产生力矩变化,这部分
糖环不发生构象转变,而另一部分为1,4-α连接,重复单元连接键为1a-4a,
两个a键连接的吡喃糖环在外力作用下会产生椅式-船式-反转椅式的构象转化
(如胶质)[8],因此可以产生平台.由于尿素对氢键有强的破坏作用[36],我们
用8M尿素作变性剂处理λ-型角叉藻糖,单链力学谱依然得到含有平台的力
曲线.这说明平台是由λ-型角叉藻糖本身的一级结构产生的指纹特征.但此
处我们只发现一个平台的力曲线存在,没有发现类似胶质二阶平台的力曲线,
这可能是由于λ-型角叉藻糖是一个共聚物,其力曲线也受前一部分即1,3
-β-半乳糖的影响.P. Marszalek等也发现了同样的情况[48],验证了我们关
于λ-型角叉藻糖拉伸时会产生平台的推测是正确的.平台的产生是λ-型角
叉藻糖力曲线的一个指纹特征.
在实验过程中,我们还得到这样的力曲线,如图2-3所示.在同一个力曲
线中有三个力信号,而且每个力信号都有一平台,这些力信号的很好的归一化
(如图2-4所示)说明每个力信号的产生都是一个单链拉伸的过程.这种多信
号力曲线的出现是由于针尖同时吸附了多个链段,这些链段逐个被拉伸, 因
此每个信号代表着一个链段的拉伸特征.这种力曲线的得到,从另一方面证明
了平台确实是λ-型角叉藻糖力曲线的特征形态.不同实验条件下得到的不同
拉伸长度的力曲线进行归一化处理具体作法如下:首先记录测量得到所有力曲
线在同一力值—500pN下的拉伸长度值,利用实验测量中的软件程序,把每条
力—拉伸长度曲线函数除以这个拉伸长度值,再重新把这些力—归一化曲线重
叠放在一起,得到图2-4.
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Figure 2-3 The force curve with three force signals, which is attributed to the
multiple strands stretching of the polymer chain one by one.
Figure 2-4 The well normalization of the three peaks, indicating the single
chain stretching during this process.
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同时我们的往复拉伸实验表明,λ-型角叉藻糖在外力作用下的构象变化
是一个可逆过程.如图2-5所示.这也很符合以往多糖单链研究的结果.
Figure 2-5 The stretching and relaxation of the -carrageenan, which shows that the
conformational transition of the galactose is reversible.
2.3.2 氧桥键抑制了多糖的构象转化
2.3.2. 1 ι, κ-型角叉藻糖的单链力学谱
如图2-6所示为 ι-型角叉藻糖中得到的典型力曲线,我们可以清楚的
发现,这些力曲线只是简单的单调上升曲线,与 λ-型角叉藻糖的力曲线有
很大差异.我们通过比较二者的一级结构发现,它们的重复单元完全一致,仅
仅差在对 ι-型角叉藻糖的1,4-α连接的葡萄糖环上有一个氧桥键,而对
λ-型角叉藻糖没有此氧桥键.在λ-型角叉藻糖中的平台源于1,4-α连
接葡萄糖环的构象转化,而在 ι-型角叉藻糖力曲线中平台消失,也说明葡
萄糖环的构象转化消失.说明在有氧桥的作用下,糖环在外力作用下的构象转
化完全受到抑制.在理论上[49],这是一个显而易见的道理,因为氧桥的空间
阻碍作用使得糖环的构象转化受到抑制.但这个显而易见的道理至今仍未得到
实验的证实.在此,我们用实验的方法证明了氧桥键的存在确实抑制了糖环的
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椅式-船式间的构象变化.
Figure 2-6 The typical force curve obtained from -carrageenan, in which no
marked shoulder could be seen. This indicates no conformational transition occured
in -carrageenan. (Inset: the well normalization of the force curve of -carrageen.)
2.3.2.2 κ-型角叉藻糖的单链力学性质的研究
对κ-型角叉藻糖单链力学性质的研究进一步验证了我们上面的结论,即
确实是氧桥的存在抑制了糖环构象转化.图2-7是κ-型角叉藻糖的典型力曲
线,此力曲线类似于ι-型角叉藻糖,仍没有出现λ-型角叉藻糖力曲线中的
平台.由于κ-型角叉藻糖和 ι-型角叉藻糖的一级结构基本相同,这个实
验数据进一步验证了我们的设想,即氧桥键的存在抑制了糖环的构象变化.
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Figure 2-7 The typical force extension curves of the -carrageenan, which also
demonstrates the conformational transition could be inhibited by the oxygen-bridge
over the galactopyranose.
2.3.3 κ,ι,λ- 型角叉糖以及羧甲基化纤维素的单链力学性质的比较
图2-8为四者归一化后典型力曲线.κ, ι-型角叉藻糖的力曲线基本能
重合,也就是说二者的力学性质基本一致.从它们的一级结构比较可以很容易
理解,因为它们的主链结构基本相同,而对于λ-型角叉藻糖的力曲线在平台
区之上能与κ, ι-型角叉藻糖的力曲线重合,说明对λ-型角叉藻糖在发生
构象转变后主要体现的是主链结构的力学性质.对κ, ι, λ-型角叉藻糖均
为以1,3连接-β-D-半乳糖和1,4连接-α-D-半乳糖为重复单元的大分子,它们
的主链弹性应该都一样,此处实验数据也完全符合这一点.而对于羧甲基化纤
维素,其主链结构为1,4连接-α-D-葡萄糖环,是一个均聚物.比较纤维素与
角叉藻糖的弹性性质,纤维素要更刚性,这可能是与纤维素的均聚结构有关.
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Figure 2-8 The comparison of the typical force extension curves of
CM-cellulose, -, - and -carrageenan.
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第三章 角叉藻糖二级结构的力学性质 [65]
§3.1 介绍
κ-型角叉藻糖极易在外加盐离子的作用下形成凝胶,形成凝胶的机理已
得到广泛的研究[50-58].目前,基本一致的观点是,纯角叉藻糖在溶液中以无规
线团存在的,当在外加盐如碘化钾, 氯化钾等作用下,此无规线团结构会形成
螺旋结构,而这些单个的螺旋结构又可以进一步平行排列,而产生凝胶.但对
于角叉藻糖首先形成的螺旋结构是单链螺旋还是双链螺旋至今仍存在很大的
争议.D. Rees等[50]用圆二色谱, ORD等方法得出的结论是双股螺旋模型,而
D. Slootmaekers[51-53]等通过用激光散射测分子量的实验数据对此结果提出了
质疑,他们认为是单链螺旋的可能性较大.还有人提出了中庸的理论,提出发
卡式模型[54],认为可能由单链自绕形成的双螺旋模型.但至今对此问题的解
释还没达到一致.
本实验试图通过对角叉藻糖在盐的作用下形成的二级结构的力学性质研
究,从单链的角度澄清这个问题.此处我们选择加碘化钠来诱导角叉藻糖形成
螺旋结构,其原因在于角叉藻糖在碘化钠作用下,能稳定在螺旋阶段,而不生
成凝胶[50-58],这有助于我们对单分子链的研究.
§3.2 材料的选择及溶液的配制
角叉藻糖(type-I)由Sigma购得.取适量角叉藻糖溶于70-80°C的热水
中,制得浓度为0.08毫克/毫升的溶液.向新制的角叉藻糖溶液中加入碘化钠
使浓度达到0.1M, 得到变性的角叉藻糖溶液,并放置1-2小时,使变性充分些.
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§3.3 结果与讨论
3.3.1 天然角叉藻糖的力学性质:
在天然角叉藻糖中得到的典型力曲线如图3-1所示.从图中我们看到是一
些陡峭的单调上升的力曲线.这些力曲线能很好的归一化,说明我们得出的力
曲线是单链拉伸的过程.对我们得到的所有力曲线用修饰的自由连接链模型拟
合,如图3-2所示.我们几乎得到同一的力学参数值,如库恩长度Ik约为1.3nm,
而链段弹性系数约为42000pN/nm左右.这些力曲线拟合参数的完全一致性也
证明了我们实验过程中得到的是单链拉伸.再者,这些力曲线能用修饰自由连
接链模型拟合,说明天然溶液中的角叉藻糖单链分子是以无规线团构象存在于
溶液中的[34,40].【经典高分子模型理论中的自由连接链模型只考虑了链结的熵
弹性,在拟和力曲线时,只能在低力曲能较好的拟和,而修改后的自由连接链
模型考虑了链在拉伸时键角发生的变化,也就是说包含了链拉伸时的焓变.实
验中得到的力曲线能被修改后的自由连接链模型很好的拟和,这也说明了高分
子链在溶液中是无规线团构象存在的.(参考刘凤歧,汤心颐\"高分子物理\",
高等教育出版社.)】
Figure 3-1 The typical force extension curves
obtained in the native carrageenan. Inset: the well
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normalization of these force curves indicating a
single chain elongation in the experiment.
Figure 3-2 The force curve well fitted by the modified FJC model.
3.3.2 离子诱导形成的螺旋结构的力学谱
我们研究了用0.1M 碘化钠处理过的角叉藻糖的单链力学谱.从中我们得
到一些有别于图3-1中的力曲线,如图3-3所示.从图中我们可以看到这些力
曲线在300pN时都有一个平台
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Figure 3-3 The force curve with long plateau obtained from the NaI dealt
carrageenan solution.
出现.很多的研究数据已经证明,经过0.1M 碘化钠处理过的角叉藻糖能形成
稳定的螺旋结构而不形成凝胶[50-58]. 此处我们推测所得的有别于天然角叉藻
糖的力曲线(有平台的)可能归因于盐诱导形成的螺旋在外力作用下的打开,
即平台的产生源于螺旋的打开.
前言中提到李宏斌[13,16]等研究天然类黄原胶的单链性质时发现,螺旋在外
力作用下打开形成了长的平台.Gaub[17-19]等人在研究DNA双螺旋打开时,也
发现在力曲线上形成了长的平台.这些结果从侧面证明我们得到的含平台的力
曲线可能就是由碘化钠诱导角叉藻糖形成的螺旋结构的打开过程.
图3-4 (a)和(b)的力曲线更证实了我们上面的推测.
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Figure 3-4 The force extension curves with a plateau double in height,
attributed to the unwiding of the two helix chains in parallel way.
图3-4 (b)是有两个台阶的力曲线,其中低的一阶的高度为300pN, 与图3-3
中的平台高度一致.而高的平台则约为600pN,是矮平台的二倍.这种力曲线
是由什么原因导致的呢 我们认为,在有些情况下,形成螺旋的角叉藻糖分子
以环的形式吸附在基片上,而针尖和样品的作用点是随意的.当针尖拉到环的
中央时,图3-4 中(b)示意图所示,此时环的两侧都可以被拉伸,当然短的一
端先被拉开(图中为右侧),而此时左侧的螺旋链仍处于松弛阶段,针尖不受
左侧螺旋的作用,此时针尖反映的受力情况为右侧螺旋链打开时受到的力,单
链螺旋的打开表现在力曲线上是高度为300pN的平台.当两侧螺旋拉伸到相
同长度时,左侧螺旋也开始打开,此时可看成是两根弹簧并联拉伸,因此针尖
受力为单个弹簧的二倍,即此时得到的平台高度为600pN.如果很巧合地针尖
正好拉到环的正中间,即左右两侧的长度相同,此时,左右两侧的螺旋同时被
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打开,因此只在600pN处产生一个平台.这是图3-4中 (a)所示力曲线产生的
原因.如图3-4中两种力曲线的得到从侧面证实了我们的结论,即角叉藻糖在
碘化钠的作用下能产生螺旋结构.但是从我们的实验观察,在碘化钠处理的角
叉藻糖样品中得到的含平台的力曲线并不是100%,而且还有一些没有平台的
力曲线.这说明角叉藻糖在0.1M 碘化钠处理下无规到螺旋的转变不是彻底
的.李宏斌[13,16]等研究天然类黄原胶时也发现了两倍高度的平台.
3.3.3 螺旋打开的不可逆性
图3-5所示为螺旋打开的往复拉伸实验,平台对应于螺旋的打开,从图中
我们可以发现此螺旋打开是一个不可逆过程,即螺旋打开后不能立刻恢复.说
明力曲线中的平台可能对应着双股或多股螺旋的打开.
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Figure 3-5 The stretching and relaxation experiment shows a hysterisis in the force
curve which indicates that the helix unfolding under the external force is a
irreversible process.
小 结
1. 本论文对一系列角叉藻糖的单链力学谱进行了深入的研究.通过对一系列
角叉藻糖的研究发现,在λ-角叉藻糖的力曲线上出现一个平台,其高度在
300pN左右,这是由1a-4a连接的糖环的构象转化导致的.而在ι, κ-角叉藻
糖的力曲线中,此平台消失了.我们比较这三种角叉藻糖的一级结构发现是由
于ι, κ-角叉藻糖的糖环上的氧桥键的存在抑制了其构象变化.在理论上,
由于空间阻碍的作用,六元环的构象转化在氧桥的存在时可以得到抑制.但至
今仍未用一种实验的方法的到证明.在此,我们利用单分子力谱仪通过监测糖
环转变似的指纹特征,在实验上给出了一个证据.
2. 同时,角叉藻糖在外加盐的诱导下可以形成螺旋的二级结构.本文利用单
分子力谱仪得到了此螺旋结构的力学信息.在0.1M碘化钠的作用下,角叉藻
糖形成螺旋结构,此螺旋结构在外力作用下打开,表现在力曲线上为一长平台,
约为300pN.平台的形状不同于λ-角叉藻糖,因为它们是由不同结构产生的.
展 望
单分子力谱学至今在多糖中的研究有了很大的发展,特别是对多糖一级结
构在外力作用下的构象转变的研究,从理论到实验都已经发展得相当完善了.
但是,对多糖的二级结构,以及利用多糖的特殊的指纹特征去开展一些研究仍
处于发展阶段,特别是对于后者.Gaub等[33]利用多糖的指纹特征去研究了共
价键的强度大小,而且Fernandez等[59]以专门利用肌动蛋白(titin)的锯齿状的
指纹特征,通过修饰一些复杂的蛋白质结构来研究他们的力学性质,所有这些
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都是利用一特定指纹特征峰来辨别单链的过程.所以我们在利用多糖的指纹特
征方面还有很大的发展前景,其是研究一些力的相互作用.
1. 如利用多糖的指纹特征峰去探测自组装(self-assembly)[60],生物缠结
(biofouling)[61,67]推动力,如研究羧甲基化淀粉,λ-角叉藻糖在氨基修饰的
表面上的脱附力.
2. 对胶束体系的再研究[62],例如,pullulan侧连接上胆甾醇后,能形成分子内
单链胶束[63],利用pullulan这种多糖在外力作用下的产生构象变化,并且在力
曲线上有平台为指纹特征峰,我们可以得到胶束拉伸时的一些信息,如胶束的
作用力大小等.以及我们可以深入研究表面活性剂对聚电解质形成主链胶束的
研究,聚电解质仍然可以采用有构象转变的多糖体系.
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Force Spectroscopy, Langmuir 2001, 17, 4799-4808.
(63) Akiyoshi, K.; Deguchi, S.; Moriguchi, N.; Yamaguchi, S.; Sunamoto, J.,
Self-aggregates of hydrophobized polysaccharides in water, formation and
characteristic of nanoparticles, Macromolecules, 1993, 3062-3068.
(64) Xu, Q. B.; Zhang, W.K.; Zhang, X., Oxygen Bridge Inhibits Conformational
Transition of 1,4-Linkeda-D-Galactose Detected by Single-Molecule Atomic Force
Microscopy, Macromolecules 2002, 35, 871-876.
(65) Xu, Q. B.; Zou, S.; Zhang, W. K.; Zhang, X., Single molecule force
spectroscopy on carrageenan by means of AFM, Macromol. Rapid Commun, 2001,
22, 1163-1167.
(66) Zhang, W. K.; Xu, Q. B.; Zou, S.; Li, H. B.; Xu, W. Q.; Zhang, X.,
Single-molecule force spectroscopy on Bombyx mori silk fibroin by atomic force
microscopy, Langmuir, 2000, 16, 4305.
(67) Xu, Q. B., et.al. unpublished results.
单分子力化学:多糖单链力谱的研究
中 文 摘 要
吉林大学化学系 高分子化学与物理专业
吉林大学硕士学位论文 许巧兵
xliv
许巧兵
指导教师: 张希 教授
随着精确到纳米及埃数量级的,敏感至皮牛顿级的微观探测技术的不断发
展和完善,人们可以设计对单分子进行直接的测量和研究.这些实验结果的诞
生,为以往许多经典理论统计及预言问题提供了直接的实验判据.利用AFM
技术对微小力的极度敏感性质,应用单分子力谱方法可以得到许多生物大分子
及合成高分子聚合物的弹性性质的纳米指纹特征及其中的各种相互作用力的
大小和相互作用方式的信息.
近年来,多糖由于它们在生命体系中的作用和食品工业中的价值越来越被
人们所关注.而且多糖分子所特有的糖环的船式椅式的构象转化越来越引起科
学家们的广泛兴趣.
本论文应用单分子力谱仪的方法对角叉藻糖的单链力学性质进行了研究,
提供了多糖单链一级构象转化及离子诱导形成的螺旋二级结构的一些有意义
的信息:
1. -角叉藻糖在力曲线上表现出一明显的平台, 这是有1a-4a连接的
吡喃糖环在外力作用下产生椅式-反转椅式的构象转变而产生的.而对 -
-角叉藻糖由于1a-4a连接的吡喃糖环上氧桥键的存在,抑制了吡喃糖环
的构象转变,在力曲线上的平台消失了.我们知道在理论上,由于空间
阻碍的存在,氧桥键抑制吡喃糖环的构象转变是不证自明的道理,而此
处我们首先用实验的方法证明了它.
2. -角叉藻在碘化钠的作用下可以从无规线团结构转化成螺旋结构,
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xlv
本实验在单分子的角度给出了此离子诱导形成的螺旋结构的力学信息,
在外力作用下螺旋的打开在力曲线上出现一个高约为300pN的长平台.
而且往复拉伸实验表明此螺旋的打开是一个不可逆过程.在一定程度上
预示了离子诱导作用下多股螺旋的产生.
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xlvi
Single molecule mechanochemistry: force
spectroscopy on polysaccharides
Author: XU QIAOBING
Advisor: Prof. Dr. ZHANG Xi
Abstract
The great advancement of nanoscale techniques has made it possible to
manipulate the single molecule experiments and provides detailed insight into
intermolecular and intramolecular forces of individual molecules as well as
molecular mechanisms without any averaging process. With the high lateral
resolution and extreme force sensitivity, atomic force microscopy (AFM) has
become one of the most widely used near-field microscopes. Beyond topographic
imaging, the AFM can measure and map many types of surface forces and lateral
properties. A new technique based on AFM —single-molecule force spectroscopy,
introduced first by H. E. Gaub — has been implemented and used to measure the
elastic properties and the deformation of natural and synthetic polymers.
Carrageenan is a kind of important polysaccharide extracted from different
species of marine red algae. The ability to induce gelation in aqueous solutions is
one of the most useful properties of this kind of polysaccharide material. It has
been widely used in food industry as a kind of nontoxic food gelation.
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Force-induced transitions between the chair and boat conformers of the
glucopyranose ring structure of single polysaccharide molecule have recently
aroused increasing interest.
The marked difference in force-extension curves is observed for carrageenan
(type I) before and after adding NaI buffer using single molecule force
spectroscopy by atomic force microscopy (AFM). Salt induced helix in
carrageenan dealt with 0.1 M NaI has been unfolded under the external force, and
long plateau about 600pN high appears correspondingly in the force-extension
curves.
A marked shoulder observed around 300 pN in the force-extension curves of
-carrageenan is a fingerprint of a chair-to-inverted chair conformational transition
of the 1→4-linked a-D-galactose ring. This shoulder disappears in the
force-extension curve when an oxygen-bridge is introduced over such a galactose
ring in - and -carrageenan. This is due to the spatial barrier of the oxygen-bridge
resulting in the inhibition of the conformational transition of galactose ring, as
predicted by theory. Here we demonstrate it experimentally by monitoring the
fingerprint of this conformational transition in the single molecule by atomic force
spectroscopy.
作 者 简 历
许巧兵,男,1977年12月12日生于江苏省溧水县.1995
年考入吉林大学化学系高分子材料与工程专业,1999年7
月完成本科论文\"蚕丝蛋白的单分子力学研究\"后毕业,
并获得工学学士学位.1999年9月被保送到吉林大学研
究生院攻读高分子化学与物理专业硕士学位.在张希教授
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xlviii
的指导下,从事多糖单链力学性质的研究.
硕士期间发表的论文:
1. Xu, Q. B.; Zhang, W.K.; Zhang, X., \"Oxygen bridge inhibits conformational
transition of 1,4-Linked a-D-Galactose detected by single-molecule atomic force
microscopy\", Macromolecules, 2002, 35, 871-876.
2. Xu, Q. B.; Zou, S.; Zhang, W. K.; Zhang, X., \"Single molecule force
spectroscopy on carrageenan by means of AFM\", Macromol. Rapid Commun.,
2001, 22, 1163-1167.
3. Zhang, W. K.; Xu, Q. B.; Zou, S.; Li, H. B.; Xu, W. Q.; Zhang, X.,
\"Single-molecule force spectroscopy on Bombyx mori silk fibroin by atomic force
microscopy\", Langmuir, 2000, 16, 4305.
4. Xu, Q. B.; Zhang, X., \"Single Molecule Mechanochemistry: force spectroscopy
on polysaccharides\", The Proceeding on Nanoscience and Nanotechnology in
China, pressed by Tsinghua University Press, 2002.
5. Zhang, X.; Xu, Q. B.; Zhang, W. K.; Zou, S.; Cui, S. X.; Wang C., \"Single
Molecule Mechanochemistry\", Sino-German Young Scientist-forum on
Macromolecular Science, Pressed by Chemical Industry Press, 2002.
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吉 林 大 学
硕 士 学 位 论 文
单分子力化学:多糖单链力谱的研究
Single molecule mechanochemistry: force
spectroscopy on polysaccharides
作者姓名: 许巧兵
专 业: 高分子化学与物理
导师姓名: 张希 教授
论文起止年月:1999年9月至2002年6月
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ii
目录
提要 iii
第一章 单分子力谱仪的工作原理及应用 1
§1-1 原子力显微镜(AFM)的原理 2
§1-2 单分子单链拉伸实验的装置原理及操作过程 5
§1-3 多糖单分子力学性质的AFM研究 7
第二章 -, -, -角叉藻糖的一级结构的单链力学研究 16
§2-1 介绍 16
§2-2 仪器及药品 16
§2-3 结果与讨论 18
第三章 角叉藻糖的二级结构的力学研究 25
§3.1 介绍 25
§3.2 材料的选择及溶液的配制 25
§3.3 结果与讨论 26
小结 30
展望 31
参考文献 32
摘要 39
Abstract 41
致谢 iv
作者简历 v
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iii
摘 要
本论文旨在利用基于AFM的单分子力谱方法,研究角叉藻糖的单链力学
性质. -角叉藻糖在力曲线上表现出一明显的平台,这是有1a-4a连接的吡喃
糖环在外力作用下产生椅式-反转椅式的构象转变而产生的.而对 -, -角叉
藻糖由于1a-4a连接的吡喃糖环上氧桥键的存在,抑制了吡喃糖环的构象转变,
导致力曲线上的平台消失了.我们知道在理论上,由于空间阻碍的存在,氧桥
键抑制吡喃糖环的构象转变是不证自明的道理,而此处我们首先用实验的方法
证明了它.另外, -角叉藻糖在碘化钠的作用下可以从无规线团结构转化成螺
旋结构,本实验在单分子的角度给出了此离子诱导形成的螺旋结构的力学信
息,在外力作用下螺旋的打开在力曲线上出现一个高约为300pN的长平台.
关键词: 单分子力谱,单链拉伸,多糖,一级构象转化,离子诱导,螺旋
二级结构.
Keywords: Single-molecule Force Spectroscopy, Single-Chain Elongation,
Polysaccharides, Conformational Transition, Ion-induced, Helix
Structure.
吉林大学硕士学位论文 许巧兵
iv致谢
本论文是在张希教授的直接指导下完成的.从论文的选题,实验的设计到
论文的完成都得到了张老师的悉心指导,老师渊博的学识,活跃的思想,严谨
的治学态度,求实的科研作风和忘我的工作精神都使我深受启发,受益匪浅.
在此谨向我尊敬的导师致以衷心的感谢和敬意!
在论文的完成过程及几年的学习生活中,得到了沈家骢院士许多指导,关
心和帮助,先生敏锐的思想,丰富的经验,锐意求新的科研作风都使我深深受
益.在此向他表示最诚挚的谢意!
在实验,测试和论文的完成过程中还得到了张文科师兄很多帮助.同时我
想感谢李宏斌师兄在实验过程中的有益的讨论, 以及王治强老师,王力彦老
师,邹钐师姐,张丽师姐,孙俊奇,邹勃,付昱,吴涛等师兄和钱雪蕾,崔树
勋,王驰,霍峰蔚,仇登利等同学也在实验过程中给予了许多关心和帮助,在
此向他(她)们表示感谢!另外对开放实验室的各位老师和董彬,陈欢,石峰,
许华平,王明锋,张璐等同学的支持和帮助,也表示深深的谢意.
在此还特别感谢我的妻子翟淑娅在我研究生三年期间生活上的关心和事
业上的支持.
第一章 单分子力谱仪的工作原理及应用
人类依靠感官来认识世界,而仪器的发明和使用使感官得到延伸.普通人
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眼的分辨率约为0.2mm,这使得人们无法对更小的物质进行认知和理解.17
世纪光学显微镜的发明使人类进入了观察微观世界的时代,光学显微镜可在
x,y二维方向上观察物体的形貌.由于受光波波长的限制,光学显微镜的分
辨率一般仅能达到微米级水平.20世纪30年代发明了另一种广泛用于观察物
质微观形貌的显微镜--电子显微镜,逐步把人们带入了认知微观世界的时代.
1982年,Bining和Rohrer [1,2]等成功发明了第三代显微镜--扫描隧道显微
镜(Scanning Tunneling Microscopy, STM).它的出现,使人类第一次能够实
时地观察单个原子在物质表面的排列状态和与表面电子行为有关的物理,化学
性质.其后,原子力显微镜 (AFM),侧向力显微镜 (LFM),磁力显微镜
(MFM),静电力显微镜 (EFM),力调制显微镜(FMM),扫描电容显微镜 (SCM),
扫描电化学显微镜 (SECM),扫描近场光学显微镜 (SNOM)等相继问世,统称
为扫描探针显微镜(Scanning Probe Microscopy, SPM),它们把人们从二维微
观世界带入认知三维微观空间的广阔领域.SPM超越了光和电子波长对显微
镜分辨率的限制,可以在三维立体空间观察物质的形貌,并获得探针和样品相
互作用的信息.其中,分辨率最高的是扫描隧道显微镜,可以对原子成像,而
典型原子力显微镜的侧向分辨率(x,y方向)也可达到2nm,垂直分辨率(z
方向)小于0.1nm.SPM以其操作容易,样品制备简单,工作环境不受限制,
分辨率高等优点,在生命科学,纳米科学,材料科学,表面科学中得到广泛深
入的应用和发展.
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§1-1 原子力显微镜(AFM)的原理
Figure 1-1 The principle of the Atomic Force Microscope
AFM的原理比较简单,它是用一个对微弱力极敏感的微小探针和样品表
面轻轻接触来获得信息[2].如图1-1所示,当针尖与样品接近时,针尖尖端原
子与样品表面原子间存在微弱排斥力,这种力作用使微悬臂发生偏离或振幅改
变.悬臂的这种变化经检测系统检测后转变成电信号,传递给反馈系统和成像
系统,记录扫描过程中探针的一系列变化过程就可以获得样品表面的信息图
像.下面分别介绍检测系统,扫描系统和反馈控制系统.
一,检测系统
AFM图像是通过在样品表面扫描时测量微悬臂受力弯曲或振幅改变的程
度得到的,检测方法包括隧道电流法,电容检测法,光反射法,光干涉法.目
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前,AFM系统中常用的是光反射法检测系统,具有简便灵敏的特点.激光反
射检测系统由探针,激光发生器和光检测器组成.
1,探针
探针是AFM检测系统的关键部分,它是由微悬臂和悬臂末端的针尖组成.
随着加工技术的发展,人们已经能制造出各种形状和特殊要求的探针.悬臂是
由Si或Si3N4经光刻技术加工而成的.悬臂的背面镀有一层金属以达到反射的
要求.Si3N4针尖常为V-型悬臂,如图1-2,针尖为金字塔形,尖端直径约为
20-50nm,弹性系数变化范围在几十N/m到百分之几N/m之间,其共振频率
一般大于10Hz.Si针尖通常用于AFM测量中的Tapping模式,悬臂由单晶硅
制成,弹性系数在20-100N/m,共振频率范围一般在200-400KHz之间.
Figure 1-2 Scanning electron microscopy image of the AFM tip.
2,光检测器
AFM的信号检测是通过光电检测器来完成的.激光由光源发出,照在金
属包覆的悬臂上,经反射后进入光电二极管检测系统.然后,通过电子线路把
照在两个二极管上的光量差转换成电压信号方式来指示光点位置.
二极管位敏检测器一般由ABCD四个独立二极管子部分组成.当探针接触样
品时,反射激光量在四个二极管的分布发生变化,其中(A C-B-D)的变
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化与高度形貌图有关,而(A B-C-D)反映侧向力的变化,与摩擦力图像
直接相关.
二,扫描系统
SPM对样品扫描的精确控制是依靠扫描器来实现的.扫描器中装有压电
转换器.压电装置在x,y,z三个方向上精确控制样品或探针位置.目前构成
扫描器的基质材料主要是由钛锆酸铅[Pb(Ti,Zr)O3] 制成的压电陶瓷材料.压电
陶瓷有压电效应,即在加压时有收缩特性,并且收缩的程度与所加电压成正比
关系.压电陶瓷能将1mV-1000V的电压信号转换成十几分之一纳米到几微米
的位移.
目前,扫描器多呈管状,控制不同方向的压电陶瓷块组装在一起构成一个
在x,y和z方向控制极其精确的扫描器.在一些SPM系统中(如Multimode
SPM),扫描器移动样品而探针相对静止,而在另一些SPM系统中(如
Dimension series SPM),样品静止不动而扫描器移动探针运动.
三,反馈控制系统
SPM反馈控制是由电子线路和计算机系统共同完成的.控制系统主要有
两个功能:1,提供控制压电转换器x-y方向扫描的驱动电压.2,在恒力模式
中维持来自显微镜检测环路输入模拟信号在一恒定数值.计算机通过A/D转
换读取比较环路电压(即设定值与实际测量值之差).根据电压值不同,控制
系统不断地输出相应电压来调节z方向压电传感器的伸缩,以纠正读入A/D
转换器的偏差,从而维持比较环路的输出电压恒定.
电子线路系统起到计算机和扫描系统相连接的作用.电子线路为压电陶瓷
管提供电压,接收<a name=baidusnap0></a><B style=\'color:black;background-color:#ffff66\'>位置传感器</B>件传来的信号,并构成控制针尖和样品之间距离
的反馈系统.SPM有两种基本的反馈模式:1,恒力(或恒电流)模式,即接
通反馈系统.当打开反馈系统时,调节样品位置的压电陶瓷管根据样品和针尖
接触力的大小来上下移动样品以保持针尖与样品之间距离恒定,即恒力.通常
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ix
用此模式可以获得样品高度形貌图.2,恒高度模式,即断开反馈系统.关闭
反馈系统时,样品在z方向不移动,通过样品与针尖在不同位置作用力的不同
来检测样品的起伏变化.此种模式适用于表面十分平整的样品.
§1-2 单分子单链拉伸实验的装置原理及操作过程
本论文实验中,单链拉伸实验所用的仪器是建立在AFM原理基础上的单
分子力谱仪,采用悬臂表面镀金的Si3N4针尖.
Figure 1-3 Schematic of the experimental set-up
如图1-3和1-4所示,聚合物样品通过物理吸附或化学键合及特异性相互
作用等方式固定在基片表面,不同作用方法所使用的基片也不同,可以采用玻
璃片,云母片,石英片,金片及其他表面修饰的基片等.这样,聚合物或生物
大分子可以在基片表面形成一个很薄的吸附层.当压电陶瓷管在z方向运动
时,AFM针尖与样品层相接触.由于针尖与样品之间的相互作用,高分子链
将吸附到针尖上.当样品远离针尖运动时,高分子链受到拉伸,引起微悬臂的
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x
弯曲,具体的过程如下:
Figure 1-4. Schematic of a single-molecule force spectroscopy experiment.
Ⅰ, 悬臂开始并没有接触到表面,在这时候如果悬臂没有受到长程力的吸引
(或排斥),这种接触力曲线表现为一条直线.
Ⅱ, 当探测针尖接近到样品表面,悬臂偏转增加,如果样品足够坚硬,作用
力将随着压电陶瓷管的向上运动而增加;如果样品是柔软的,而悬臂是相对静
止的,探测针尖可能在接触点处压入样品表面.这样,通过分析力曲线上的接
触部分的倾斜状况就可以得到关于样品表面弹性的初步信息.
Ⅲ ,在接触的过程中,一些分子通过特异性或非特异性作用力将会吸附到针
尖上,当针尖与样品分离时,连到针尖与基片之间的高分子链会被拉伸,而这
种针尖和样品的相互作用会引起悬臂弯曲,导致力曲线上力信号的偏转.
Ⅳ 当高分子链从针尖上脱落时,悬臂复原(不受力的状态),表现在力曲线
上为力值迅速掉落回零点.
Ⅴ 力曲线表现出与初始逼近状态一样的无偏转的直线状态.
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§1-3 多糖单分子力学性质的AFM研究
随着精确到纳米及埃数量级的,敏感至皮牛顿级的微观探测技术的不断发
展和完善,人们可以设计对单分子进行直接测量和研究[3-4,10].人们可以得到
单分子尺度上用一般方法得不到信息,如多糖的一级构象转化[4-9],蛋白质分
子的折叠与解折叠[3,11-15],螺旋超结构的解缠[16-19].利用AFM技术对微小力
的极度敏感性质,我们可以在纳牛甚至在皮牛尺度上得到一些力的信息[27],
如DNA碱基对间作用力[17-26],主客体相互作用[28-32],甚至单个化学键的强度
[33].利用单分子力谱仪我们还可以解决一些高分子链段弹性的问题[34-44].Gaub
等首先将单分子力学方法与AFM成像技术结合[45],研究了单个细胞膜蛋白拉
伸的信息,为单链技术与其它表征技术的结合开拓了新的领域.
一:多糖分子的一级结构构象转变研究
生物多糖分子以其良好的水溶性质和广泛的生物机制研究背景,被越来越
多的研究者所重视.自从Gaub首先利用单分子力谱方法研究高分子单链力学
性质以来,葡聚糖(dextran)的\"肩式\"(或称为\"平台\"式)力曲线形式成为
多糖力曲线典型的代表[4],如图1-5所示,\"平台\"出现在力值为750pN附近.
这类力曲线的发现,引起了研究构象的科学家们对多糖单链研究的强烈兴趣.
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Figure 1-5 Subsequent force measurements of carboxymethylated dextran.
The characteristic -shoulder- observed at a force of approximately 750pN results
from a conformational transition of the polysaccharide chain.
P. Marszalek[5]和李宏斌[6,13]对纤维素(cellulose)和直链淀粉(amylose)等多
糖的单链力学性质进行了深入的研究,发现对于不同连接方式的多糖,其构象
转化会导致不同的力曲线.纤维素和直链淀粉的重复单元均为葡萄糖环
(glucan), 对于纤维素,其连接方式为1,4-β连接,连接重复单元的两个键
都是e 键,即1e-4e连接,此连接方式的葡萄糖环的最稳定构象为椅式构象.
在外力的作用下,葡萄糖环可以发生椅式到船式的构象转化,从图示可以看出,
由1e-4e连接方式的葡萄糖环在拉伸时不发生构象变化,表现在力曲线上为一
单调上升的力曲线,如图1-6 所示,这种多糖的力曲线没有出现葡聚糖力曲
线中的平台.
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xiii
Figure 1-6 The typical force-extension curves of CM-cellulose, the 1e-4e linkage of
the glucopyranose contributes no plateau in the force curves.
而对直链淀粉,其重复单元连接方式为1,4-α连接,连接重复单元吡喃糖环
的两个键为e键和a键,即1a-4e连接,此连接方式的葡萄糖环在外力作用
下由椅式转变为船式时会产生力矩,此时有焓变.因此推测力曲线上平台的出
现有可能是由于糖环的椅式-船式构象变化引起的,图1-7a所示.这已被多个
实验证实.如果直链淀粉力曲线上的平台真是由葡萄糖环的椅式-船式构象变
化引起的,那么我们可以预测如果将此糖环破坏掉,将得不到含有平台的力曲
线.由于在直链淀粉重复单元的糖环中的羟基是邻位顺式的,我们可以利用高
碘酸的氧化作用将此连接方式的葡萄糖吡喃环断开.最终的实验结果正如我们
所预测的那样,经高碘酸处理过的直链淀粉在实验中得不到含有平台的力曲
线.另外,理论计算也给了部分证据.如图1-8所示,由理论计算得知,这种
α-1,4位连接的直链淀粉力曲线上的转变对映了葡萄糖吡喃环 的椅式到船
式的构象转变[7].而这个转变能垒大约为4.6 kcal/mol(力曲线上的阴影部分为
我们实验过程中所做的功,通过积分可得出此功的大小),这个实验积分能垒
值与ab initial模拟所得结果基本吻合(2.5-4.8 kcal/mol).
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xiv
Figure 1-7 the typical force extension curves obtained from the CM-amylose, the
shoulder in the force curve is ascribed to the chair-boat transition of the
glucopyranose.
Figure 1-8 (a) The diagrams show that the distance between two consecutive
glycosidic oxygens O1-O4 increases during force-driven chair-boat transition; (b)
A force-extension curve for amylose was fitted with the FJC model.
同时,肝素也是一类α-1,4位连接的多糖,其葡萄糖吡喃环的连接方式为1a
-4e连接,这样的连接方式的多糖的力曲线上也存在一个平台,如图1-9所示
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xv
[6],只是平台的高度比直链淀粉力曲线中的平台较高,这是由于其不同的侧基
引起的.
Figure 1-9 The comparison of the force-curve between the CM-amylose and
heparin, a shoulder also apears in the force curve of heparin which ascribes to
the conformational transition of the α-1,4 linkage of the glucopyranose.
对于胶质(pectin)[8],它是一种重复单元由2个都是a键连接的多糖,即1
a-4 a连接如图1-10右图所示.其力曲线上表现出2个台阶,如图1-10左图
所示,产生2个台阶的原因是由于糖环的椅式-船式-反转椅式的两级构象转化
的结果.同样,经高碘酸钠处理后的胶质的单链力谱上的台阶消失,这意味着
2个台阶的力曲线也是由吡喃环的构象变化产生的.
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Figure 1-10 The typical force curve of pectin, the two step shoulders in the force
curve is mainly attributed to the chair-boat-inverted chair transition of the 1a-4a
linked galactose.
二:多糖分子的二级结构的构象变化
对于生命体系中的多糖,很容易形成螺旋的二级结构.类黄原胶分子
(xanthan)是一类天然高分子.天然状态下的类黄原胶分子在溶液中以α-螺
旋结构 形式存在[13,16].图1-11左图为在外力作用下α-螺旋结构的打开过程
的典型力曲线,有一长平台出现,对应着螺旋结构的打开.加热变性后的类黄
原胶分子的α-螺旋结构转变成无规线团结构,因而体现在力曲线上为单调上
升的力曲线.而其变性后分子链段弹性性质表现为与同样是β-连接的甲基纤
维素的分子弹性相似,如图1-11右图所示.
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xvii
Figure 1-11 (L) Several force-distance curves of native xanthan directly
monitored one after the other without loss of the molecular contact; (R) Denatured
xanthan and carboxymethyl cellulose exhibit practically identical features.
三,利用多糖的指纹特征对一些力的作用的探测
对于单个共价键强度的准确测量一直都是化学家,物理学家追求的目标.
然而至今还没有有效的准确测量单键的手段.随着纳米技术和仪器的发展,目
前单键强度的测量也得到了实现.Grandbois等[33]报道了两种类型的共价键
Si-C及Au-S的键强,分别为2nN和1.4nN.实验中,他们将直链淀粉做为拉
伸参照,由于直链淀粉在275pN处有特征\"平台\",对应着六元糖环的转变过程.
如果多个链被同时拉伸,则\"平台\"的高度会增加或被多个力信号掩盖.因此,
从直链淀粉的特征力曲线可很容易的辨别出是否为单个链的拉伸,如图1-12
所示.从图1-13 可看出,拉伸断裂的方式只有 四种,为Si-O,Si-C,C-C,
C-N.根据价键理论,再由统计分布(图1-14)得出最可能的断裂方式为Si-C
键的断裂.通过直链淀粉在拉伸时出现的平台为指纹特征,并且用未共价连接
的样品作参照实验,我们可以得出Si-C键的断裂强度.
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Figure 1-12 (A) Stretching of a single polysaccharide chain that is covalently
attached to the AFM tip and the substrate, (B) Schematics of the covalent
attachment of the amylose by carbodiimide chemistry to glass or Au surfaces,
which were both functionalized with amino groups.
Figure 1-13 Force extension curve of the amyloase covalently bound between the
AFM tip and a silicon oxide surface. Below is the control force extension curve of
amylose without covalently bound to the surface.
吉林大学硕士学位论文 许巧兵
xix
Figure 1-14 Probability of bonds rupture.
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xx
第二章 κ-,ι-,λ-角叉糖的一级结构单链力学性质[64]
§2.1 介绍
由于多糖在生物体系中的重要作用,以及多糖单链单分子力曲线中的由构
象转变引起的特殊的力信号,使多糖的单分子构象的研究已经引起研究构象的
化学家以及一些理论化学家的广泛兴趣[4-9].利用单分子力谱仪的力信号的高
度灵敏性和多糖分子的指纹特征来探测共价键的作用力的大小,这是用传统方
法无法得到的.P. Marszalek[5,8]等利用邻位顺式羟基可以被氧化断开的特点,
用高碘酸钠氧化葡萄糖环,单链实验证明经过高碘酸钠糖处理过的直链淀粉中
得不到含有平台的力曲线.说明环的断裂使得环的船式椅式的构象转化消失
了.同时我们想,既然将环破坏了可以使其构象转化消失,那么由于受到空间
阻碍的作用,我们在环上引入一个桥,则船式椅式的构象转化亦能够被抑制.
本实验利用单分子力谱仪在实验上证明了六元环在外力作用下的构象转化可
以被桥键所抑制.
§2.2仪器及药品
1. 实验仪器
实验所用的单分子力谱仪(Single-molecule Force Spectroscopy)是在德国
慕尼黑大学H. E. Gaub教授帮助下建立的专门用于聚合物单链拉伸的自制仪
器.单分子力谱仪与商用的AFM比较有如下优点:首先,单分子力谱仪的分
辨率高,采集数据点可达到4096个点,而普通商用AFM最高只有512个点.
另外,单分子力谱仪可以手控调节测量拉伸的模式和扫描范围,能进行测量研
究中所必需的往复拉伸实验等.
Si3N4针尖分别购自Digital Instruments (DI, Santa Barbara, CA)和PARK
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xxi
Scientific Instruments (PARK, Sunnyvale, CA).为避免误差,每次实验均使用新
针尖.针尖弹性系数由测量针尖的热扰动计算可得[46].本实验中选取的针尖
通过针尖弹性系数可将拉伸实验所得的信号经软件处理转化为力-拉伸曲线.
测量的弹性系数在42-65mN m-1范围内.根据文献报道及以往实验结果分析,
在此弹性系数范围内,针尖和悬臂弹性对聚合物链的拉伸弹性没有贡献.
2. 实验基片的制备
基片采用生物实验中的玻璃载片和盖片.使用前,载片以3:7 H2O2/浓H2SO4
煮沸至无气泡,大量超纯水清洗,放入洁净干燥器中干燥.盖片依次用水,乙
醇,氯仿,乙醇,水超声,并以大量纯水清洗,干燥后使用.这样洗的基片实
验证明是很干净的.样品的制备方法有很多种,在此实验中,将聚合物溶液滴
到干净的玻璃片上,约400μL,隔离空气放置4-6小时,移去玻璃片上多余
的溶液,立即进行单链拉伸实验.
3. 实验用样品
κ-,ι-,λ- 型角叉藻糖都是从Sigma购得,能直接溶于水,溶液浓度都
是0.15mg.ml-1.三种角叉藻糖的理想重复单元都是由1,3连接-β-D-半乳糖和
1,4连接-α-D-半乳糖组成,它们的1,3连接-β-D-半乳糖重复单元完全一致,
而对1,4连接-α-D-半乳糖重复单元它们存在很小的差异,对κ-,ι- 型角叉藻
糖有一氧桥键在吡喃糖环上,而对λ- 型角叉藻糖却无此氧桥键的存在,其
1,4连接的α-D-糖环的2个连接键均为a键,即1a-4a连接,而以1,3
连接-β-D-半乳糖却是1e-3e连接.如图2-1所示.
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xxii
Figure 2-1 The ideally repeating unit of the primary structure of carrageenan.
§2.3 结果与讨论
图2-2 是从λ-型角叉藻糖中获得的典型力曲线,我们可以看出其中有
平台出现,这些力曲线形状类似于羧甲基化淀粉中获得的力曲线(图1-7).
Figure 2-2 The typical force curves of -carrageenan, in which a marked shoulder
appears which is ascribed to the conformational transition of the 1,4-linked
galactose.
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xxiii
对λ-型角叉藻糖力曲线中平台的出现,我们推测可能也是由于糖环的一
级构象转变所致,因为在λ-型角叉藻糖的重复单元中前一部分的糖环为1,3
-β连接,连接键为1e-3e,在外力作用下,糖环不产生力矩变化,这部分
糖环不发生构象转变,而另一部分为1,4-α连接,重复单元连接键为1a-4a,
两个a键连接的吡喃糖环在外力作用下会产生椅式-船式-反转椅式的构象转化
(如胶质)[8],因此可以产生平台.由于尿素对氢键有强的破坏作用[36],我们
用8M尿素作变性剂处理λ-型角叉藻糖,单链力学谱依然得到含有平台的力
曲线.这说明平台是由λ-型角叉藻糖本身的一级结构产生的指纹特征.但此
处我们只发现一个平台的力曲线存在,没有发现类似胶质二阶平台的力曲线,
这可能是由于λ-型角叉藻糖是一个共聚物,其力曲线也受前一部分即1,3
-β-半乳糖的影响.P. Marszalek等也发现了同样的情况[48],验证了我们关
于λ-型角叉藻糖拉伸时会产生平台的推测是正确的.平台的产生是λ-型角
叉藻糖力曲线的一个指纹特征.
在实验过程中,我们还得到这样的力曲线,如图2-3所示.在同一个力曲
线中有三个力信号,而且每个力信号都有一平台,这些力信号的很好的归一化
(如图2-4所示)说明每个力信号的产生都是一个单链拉伸的过程.这种多信
号力曲线的出现是由于针尖同时吸附了多个链段,这些链段逐个被拉伸, 因
此每个信号代表着一个链段的拉伸特征.这种力曲线的得到,从另一方面证明
了平台确实是λ-型角叉藻糖力曲线的特征形态.不同实验条件下得到的不同
拉伸长度的力曲线进行归一化处理具体作法如下:首先记录测量得到所有力曲
线在同一力值—500pN下的拉伸长度值,利用实验测量中的软件程序,把每条
力—拉伸长度曲线函数除以这个拉伸长度值,再重新把这些力—归一化曲线重
叠放在一起,得到图2-4.
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xxiv
Figure 2-3 The force curve with three force signals, which is attributed to the
multiple strands stretching of the polymer chain one by one.
Figure 2-4 The well normalization of the three peaks, indicating the single
chain stretching during this process.
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同时我们的往复拉伸实验表明,λ-型角叉藻糖在外力作用下的构象变化
是一个可逆过程.如图2-5所示.这也很符合以往多糖单链研究的结果.
Figure 2-5 The stretching and relaxation of the -carrageenan, which shows that the
conformational transition of the galactose is reversible.
2.3.2 氧桥键抑制了多糖的构象转化
2.3.2. 1 ι, κ-型角叉藻糖的单链力学谱
如图2-6所示为 ι-型角叉藻糖中得到的典型力曲线,我们可以清楚的
发现,这些力曲线只是简单的单调上升曲线,与 λ-型角叉藻糖的力曲线有
很大差异.我们通过比较二者的一级结构发现,它们的重复单元完全一致,仅
仅差在对 ι-型角叉藻糖的1,4-α连接的葡萄糖环上有一个氧桥键,而对
λ-型角叉藻糖没有此氧桥键.在λ-型角叉藻糖中的平台源于1,4-α连
接葡萄糖环的构象转化,而在 ι-型角叉藻糖力曲线中平台消失,也说明葡
萄糖环的构象转化消失.说明在有氧桥的作用下,糖环在外力作用下的构象转
化完全受到抑制.在理论上[49],这是一个显而易见的道理,因为氧桥的空间
阻碍作用使得糖环的构象转化受到抑制.但这个显而易见的道理至今仍未得到
实验的证实.在此,我们用实验的方法证明了氧桥键的存在确实抑制了糖环的
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椅式-船式间的构象变化.
Figure 2-6 The typical force curve obtained from -carrageenan, in which no
marked shoulder could be seen. This indicates no conformational transition occured
in -carrageenan. (Inset: the well normalization of the force curve of -carrageen.)
2.3.2.2 κ-型角叉藻糖的单链力学性质的研究
对κ-型角叉藻糖单链力学性质的研究进一步验证了我们上面的结论,即
确实是氧桥的存在抑制了糖环构象转化.图2-7是κ-型角叉藻糖的典型力曲
线,此力曲线类似于ι-型角叉藻糖,仍没有出现λ-型角叉藻糖力曲线中的
平台.由于κ-型角叉藻糖和 ι-型角叉藻糖的一级结构基本相同,这个实
验数据进一步验证了我们的设想,即氧桥键的存在抑制了糖环的构象变化.
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Figure 2-7 The typical force extension curves of the -carrageenan, which also
demonstrates the conformational transition could be inhibited by the oxygen-bridge
over the galactopyranose.
2.3.3 κ,ι,λ- 型角叉糖以及羧甲基化纤维素的单链力学性质的比较
图2-8为四者归一化后典型力曲线.κ, ι-型角叉藻糖的力曲线基本能
重合,也就是说二者的力学性质基本一致.从它们的一级结构比较可以很容易
理解,因为它们的主链结构基本相同,而对于λ-型角叉藻糖的力曲线在平台
区之上能与κ, ι-型角叉藻糖的力曲线重合,说明对λ-型角叉藻糖在发生
构象转变后主要体现的是主链结构的力学性质.对κ, ι, λ-型角叉藻糖均
为以1,3连接-β-D-半乳糖和1,4连接-α-D-半乳糖为重复单元的大分子,它们
的主链弹性应该都一样,此处实验数据也完全符合这一点.而对于羧甲基化纤
维素,其主链结构为1,4连接-α-D-葡萄糖环,是一个均聚物.比较纤维素与
角叉藻糖的弹性性质,纤维素要更刚性,这可能是与纤维素的均聚结构有关.
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Figure 2-8 The comparison of the typical force extension curves of
CM-cellulose, -, - and -carrageenan.
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第三章 角叉藻糖二级结构的力学性质 [65]
§3.1 介绍
κ-型角叉藻糖极易在外加盐离子的作用下形成凝胶,形成凝胶的机理已
得到广泛的研究[50-58].目前,基本一致的观点是,纯角叉藻糖在溶液中以无规
线团存在的,当在外加盐如碘化钾, 氯化钾等作用下,此无规线团结构会形成
螺旋结构,而这些单个的螺旋结构又可以进一步平行排列,而产生凝胶.但对
于角叉藻糖首先形成的螺旋结构是单链螺旋还是双链螺旋至今仍存在很大的
争议.D. Rees等[50]用圆二色谱, ORD等方法得出的结论是双股螺旋模型,而
D. Slootmaekers[51-53]等通过用激光散射测分子量的实验数据对此结果提出了
质疑,他们认为是单链螺旋的可能性较大.还有人提出了中庸的理论,提出发
卡式模型[54],认为可能由单链自绕形成的双螺旋模型.但至今对此问题的解
释还没达到一致.
本实验试图通过对角叉藻糖在盐的作用下形成的二级结构的力学性质研
究,从单链的角度澄清这个问题.此处我们选择加碘化钠来诱导角叉藻糖形成
螺旋结构,其原因在于角叉藻糖在碘化钠作用下,能稳定在螺旋阶段,而不生
成凝胶[50-58],这有助于我们对单分子链的研究.
§3.2 材料的选择及溶液的配制
角叉藻糖(type-I)由Sigma购得.取适量角叉藻糖溶于70-80°C的热水
中,制得浓度为0.08毫克/毫升的溶液.向新制的角叉藻糖溶液中加入碘化钠
使浓度达到0.1M, 得到变性的角叉藻糖溶液,并放置1-2小时,使变性充分些.
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§3.3 结果与讨论
3.3.1 天然角叉藻糖的力学性质:
在天然角叉藻糖中得到的典型力曲线如图3-1所示.从图中我们看到是一
些陡峭的单调上升的力曲线.这些力曲线能很好的归一化,说明我们得出的力
曲线是单链拉伸的过程.对我们得到的所有力曲线用修饰的自由连接链模型拟
合,如图3-2所示.我们几乎得到同一的力学参数值,如库恩长度Ik约为1.3nm,
而链段弹性系数约为42000pN/nm左右.这些力曲线拟合参数的完全一致性也
证明了我们实验过程中得到的是单链拉伸.再者,这些力曲线能用修饰自由连
接链模型拟合,说明天然溶液中的角叉藻糖单链分子是以无规线团构象存在于
溶液中的[34,40].【经典高分子模型理论中的自由连接链模型只考虑了链结的熵
弹性,在拟和力曲线时,只能在低力曲能较好的拟和,而修改后的自由连接链
模型考虑了链在拉伸时键角发生的变化,也就是说包含了链拉伸时的焓变.实
验中得到的力曲线能被修改后的自由连接链模型很好的拟和,这也说明了高分
子链在溶液中是无规线团构象存在的.(参考刘凤歧,汤心颐\"高分子物理\",
高等教育出版社.)】
Figure 3-1 The typical force extension curves
obtained in the native carrageenan. Inset: the well
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xxxi
normalization of these force curves indicating a
single chain elongation in the experiment.
Figure 3-2 The force curve well fitted by the modified FJC model.
3.3.2 离子诱导形成的螺旋结构的力学谱
我们研究了用0.1M 碘化钠处理过的角叉藻糖的单链力学谱.从中我们得
到一些有别于图3-1中的力曲线,如图3-3所示.从图中我们可以看到这些力
曲线在300pN时都有一个平台
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xxxii
Figure 3-3 The force curve with long plateau obtained from the NaI dealt
carrageenan solution.
出现.很多的研究数据已经证明,经过0.1M 碘化钠处理过的角叉藻糖能形成
稳定的螺旋结构而不形成凝胶[50-58]. 此处我们推测所得的有别于天然角叉藻
糖的力曲线(有平台的)可能归因于盐诱导形成的螺旋在外力作用下的打开,
即平台的产生源于螺旋的打开.
前言中提到李宏斌[13,16]等研究天然类黄原胶的单链性质时发现,螺旋在外
力作用下打开形成了长的平台.Gaub[17-19]等人在研究DNA双螺旋打开时,也
发现在力曲线上形成了长的平台.这些结果从侧面证明我们得到的含平台的力
曲线可能就是由碘化钠诱导角叉藻糖形成的螺旋结构的打开过程.
图3-4 (a)和(b)的力曲线更证实了我们上面的推测.
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xxxiii
Figure 3-4 The force extension curves with a plateau double in height,
attributed to the unwiding of the two helix chains in parallel way.
图3-4 (b)是有两个台阶的力曲线,其中低的一阶的高度为300pN, 与图3-3
中的平台高度一致.而高的平台则约为600pN,是矮平台的二倍.这种力曲线
是由什么原因导致的呢 我们认为,在有些情况下,形成螺旋的角叉藻糖分子
以环的形式吸附在基片上,而针尖和样品的作用点是随意的.当针尖拉到环的
中央时,图3-4 中(b)示意图所示,此时环的两侧都可以被拉伸,当然短的一
端先被拉开(图中为右侧),而此时左侧的螺旋链仍处于松弛阶段,针尖不受
左侧螺旋的作用,此时针尖反映的受力情况为右侧螺旋链打开时受到的力,单
链螺旋的打开表现在力曲线上是高度为300pN的平台.当两侧螺旋拉伸到相
同长度时,左侧螺旋也开始打开,此时可看成是两根弹簧并联拉伸,因此针尖
受力为单个弹簧的二倍,即此时得到的平台高度为600pN.如果很巧合地针尖
正好拉到环的正中间,即左右两侧的长度相同,此时,左右两侧的螺旋同时被
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打开,因此只在600pN处产生一个平台.这是图3-4中 (a)所示力曲线产生的
原因.如图3-4中两种力曲线的得到从侧面证实了我们的结论,即角叉藻糖在
碘化钠的作用下能产生螺旋结构.但是从我们的实验观察,在碘化钠处理的角
叉藻糖样品中得到的含平台的力曲线并不是100%,而且还有一些没有平台的
力曲线.这说明角叉藻糖在0.1M 碘化钠处理下无规到螺旋的转变不是彻底
的.李宏斌[13,16]等研究天然类黄原胶时也发现了两倍高度的平台.
3.3.3 螺旋打开的不可逆性
图3-5所示为螺旋打开的往复拉伸实验,平台对应于螺旋的打开,从图中
我们可以发现此螺旋打开是一个不可逆过程,即螺旋打开后不能立刻恢复.说
明力曲线中的平台可能对应着双股或多股螺旋的打开.
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Figure 3-5 The stretching and relaxation experiment shows a hysterisis in the force
curve which indicates that the helix unfolding under the external force is a
irreversible process.
小 结
1. 本论文对一系列角叉藻糖的单链力学谱进行了深入的研究.通过对一系列
角叉藻糖的研究发现,在λ-角叉藻糖的力曲线上出现一个平台,其高度在
300pN左右,这是由1a-4a连接的糖环的构象转化导致的.而在ι, κ-角叉藻
糖的力曲线中,此平台消失了.我们比较这三种角叉藻糖的一级结构发现是由
于ι, κ-角叉藻糖的糖环上的氧桥键的存在抑制了其构象变化.在理论上,
由于空间阻碍的作用,六元环的构象转化在氧桥的存在时可以得到抑制.但至
今仍未用一种实验的方法的到证明.在此,我们利用单分子力谱仪通过监测糖
环转变似的指纹特征,在实验上给出了一个证据.
2. 同时,角叉藻糖在外加盐的诱导下可以形成螺旋的二级结构.本文利用单
分子力谱仪得到了此螺旋结构的力学信息.在0.1M碘化钠的作用下,角叉藻
糖形成螺旋结构,此螺旋结构在外力作用下打开,表现在力曲线上为一长平台,
约为300pN.平台的形状不同于λ-角叉藻糖,因为它们是由不同结构产生的.
展 望
单分子力谱学至今在多糖中的研究有了很大的发展,特别是对多糖一级结
构在外力作用下的构象转变的研究,从理论到实验都已经发展得相当完善了.
但是,对多糖的二级结构,以及利用多糖的特殊的指纹特征去开展一些研究仍
处于发展阶段,特别是对于后者.Gaub等[33]利用多糖的指纹特征去研究了共
价键的强度大小,而且Fernandez等[59]以专门利用肌动蛋白(titin)的锯齿状的
指纹特征,通过修饰一些复杂的蛋白质结构来研究他们的力学性质,所有这些
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xxxvi
都是利用一特定指纹特征峰来辨别单链的过程.所以我们在利用多糖的指纹特
征方面还有很大的发展前景,其是研究一些力的相互作用.
1. 如利用多糖的指纹特征峰去探测自组装(self-assembly)[60],生物缠结
(biofouling)[61,67]推动力,如研究羧甲基化淀粉,λ-角叉藻糖在氨基修饰的
表面上的脱附力.
2. 对胶束体系的再研究[62],例如,pullulan侧连接上胆甾醇后,能形成分子内
单链胶束[63],利用pullulan这种多糖在外力作用下的产生构象变化,并且在力
曲线上有平台为指纹特征峰,我们可以得到胶束拉伸时的一些信息,如胶束的
作用力大小等.以及我们可以深入研究表面活性剂对聚电解质形成主链胶束的
研究,聚电解质仍然可以采用有构象转变的多糖体系.
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Single-molecule force spectroscopy on Bombyx mori silk fibroin by atomic force
microscopy, Langmuir, 2000, 16, 4305.
(67) Xu, Q. B., et.al. unpublished results.
单分子力化学:多糖单链力谱的研究
中 文 摘 要
吉林大学化学系 高分子化学与物理专业
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许巧兵
指导教师: 张希 教授
随着精确到纳米及埃数量级的,敏感至皮牛顿级的微观探测技术的不断发
展和完善,人们可以设计对单分子进行直接的测量和研究.这些实验结果的诞
生,为以往许多经典理论统计及预言问题提供了直接的实验判据.利用AFM
技术对微小力的极度敏感性质,应用单分子力谱方法可以得到许多生物大分子
及合成高分子聚合物的弹性性质的纳米指纹特征及其中的各种相互作用力的
大小和相互作用方式的信息.
近年来,多糖由于它们在生命体系中的作用和食品工业中的价值越来越被
人们所关注.而且多糖分子所特有的糖环的船式椅式的构象转化越来越引起科
学家们的广泛兴趣.
本论文应用单分子力谱仪的方法对角叉藻糖的单链力学性质进行了研究,
提供了多糖单链一级构象转化及离子诱导形成的螺旋二级结构的一些有意义
的信息:
1. -角叉藻糖在力曲线上表现出一明显的平台, 这是有1a-4a连接的
吡喃糖环在外力作用下产生椅式-反转椅式的构象转变而产生的.而对 -
-角叉藻糖由于1a-4a连接的吡喃糖环上氧桥键的存在,抑制了吡喃糖环
的构象转变,在力曲线上的平台消失了.我们知道在理论上,由于空间
阻碍的存在,氧桥键抑制吡喃糖环的构象转变是不证自明的道理,而此
处我们首先用实验的方法证明了它.
2. -角叉藻在碘化钠的作用下可以从无规线团结构转化成螺旋结构,
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本实验在单分子的角度给出了此离子诱导形成的螺旋结构的力学信息,
在外力作用下螺旋的打开在力曲线上出现一个高约为300pN的长平台.
而且往复拉伸实验表明此螺旋的打开是一个不可逆过程.在一定程度上
预示了离子诱导作用下多股螺旋的产生.
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Single molecule mechanochemistry: force
spectroscopy on polysaccharides
Author: XU QIAOBING
Advisor: Prof. Dr. ZHANG Xi
Abstract
The great advancement of nanoscale techniques has made it possible to
manipulate the single molecule experiments and provides detailed insight into
intermolecular and intramolecular forces of individual molecules as well as
molecular mechanisms without any averaging process. With the high lateral
resolution and extreme force sensitivity, atomic force microscopy (AFM) has
become one of the most widely used near-field microscopes. Beyond topographic
imaging, the AFM can measure and map many types of surface forces and lateral
properties. A new technique based on AFM —single-molecule force spectroscopy,
introduced first by H. E. Gaub — has been implemented and used to measure the
elastic properties and the deformation of natural and synthetic polymers.
Carrageenan is a kind of important polysaccharide extracted from different
species of marine red algae. The ability to induce gelation in aqueous solutions is
one of the most useful properties of this kind of polysaccharide material. It has
been widely used in food industry as a kind of nontoxic food gelation.
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Force-induced transitions between the chair and boat conformers of the
glucopyranose ring structure of single polysaccharide molecule have recently
aroused increasing interest.
The marked difference in force-extension curves is observed for carrageenan
(type I) before and after adding NaI buffer using single molecule force
spectroscopy by atomic force microscopy (AFM). Salt induced helix in
carrageenan dealt with 0.1 M NaI has been unfolded under the external force, and
long plateau about 600pN high appears correspondingly in the force-extension
curves.
A marked shoulder observed around 300 pN in the force-extension curves of
-carrageenan is a fingerprint of a chair-to-inverted chair conformational transition
of the 1→4-linked a-D-galactose ring. This shoulder disappears in the
force-extension curve when an oxygen-bridge is introduced over such a galactose
ring in - and -carrageenan. This is due to the spatial barrier of the oxygen-bridge
resulting in the inhibition of the conformational transition of galactose ring, as
predicted by theory. Here we demonstrate it experimentally by monitoring the
fingerprint of this conformational transition in the single molecule by atomic force
spectroscopy.
作 者 简 历
许巧兵,男,1977年12月12日生于江苏省溧水县.1995
年考入吉林大学化学系高分子材料与工程专业,1999年7
月完成本科论文\"蚕丝蛋白的单分子力学研究\"后毕业,
并获得工学学士学位.1999年9月被保送到吉林大学研
究生院攻读高分子化学与物理专业硕士学位.在张希教授
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的指导下,从事多糖单链力学性质的研究.
硕士期间发表的论文:
1. Xu, Q. B.; Zhang, W.K.; Zhang, X., \"Oxygen bridge inhibits conformational
transition of 1,4-Linked a-D-Galactose detected by single-molecule atomic force
microscopy\", Macromolecules, 2002, 35, 871-876.
2. Xu, Q. B.; Zou, S.; Zhang, W. K.; Zhang, X., \"Single molecule force
spectroscopy on carrageenan by means of AFM\", Macromol. Rapid Commun.,
2001, 22, 1163-1167.
3. Zhang, W. K.; Xu, Q. B.; Zou, S.; Li, H. B.; Xu, W. Q.; Zhang, X.,
\"Single-molecule force spectroscopy on Bombyx mori silk fibroin by atomic force
microscopy\", Langmuir, 2000, 16, 4305.
4. Xu, Q. B.; Zhang, X., \"Single Molecule Mechanochemistry: force spectroscopy
on polysaccharides\", The Proceeding on Nanoscience and Nanotechnology in
China, pressed by Tsinghua University Press, 2002.
5. Zhang, X.; Xu, Q. B.; Zhang, W. K.; Zou, S.; Cui, S. X.; Wang C., \"Single
Molecule Mechanochemistry\", Sino-German Young Scientist-forum on
Macromolecular Science, Pressed by Chemical Industry Press, 2002.
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