文件类型：DOC/Microsoft Word 文件大小：字节
第一章 造血
造血细胞包括:红细胞系统,粒细胞系统,巨核细胞系统的细胞,还包括淋巴细胞系统(浆细胞系统)及单核细胞系统等细胞.造血器官是能够生成并支持造血细胞分化,发育,成熟的组织.造血器官生成各种血细胞的过程称为造血.
在人体发育的胚胎期和出生后,其主要的造血器官是不相同的.
1. 造血器官
(1)胚胎期造血的基本概况
1)中胚叶造血期:
中胚叶造血大约在胚胎发育第2周末开始,其时卵黄囊壁上的胚外中胚层细胞聚集成簇形成血岛.第3周,卵黄囊血岛内层的细胞演变成为原始血细胞,即最早的造血干细胞.此时仅产生形态上类似巨幼样的原始红细胞,不产生粒细胞和巨核细胞.随着胚胎的发育,胚内细胞团出现胚胎干细胞及胚胎内血液循环的建立,胚胎干细胞随血流迁移到最适宜的微环境中增殖,分化,在胚胎第9周时,卵黄囊造血停止.
2)肝造血期:
始于胚胎第6周,停止于胚胎第7个月.胚胎干细胞(造血干细胞)随着血流迁入肝内增殖,胚胎3-6个月,肝是主要的造血场所,主要产生有核红细胞,以合成胎儿血红蛋白F(HbF)为主.胚胎第4个月以后,胎肝才产生粒细胞及少量的巨核细胞,在胚胎第5个月后,胎肝造血逐渐减少,至出生后停止.
胚胎6-7周时, 胸腺产生淋巴细胞及少量的红细胞和粒细胞,在胚胎后期,经血流来自胎肝的造血干细胞在胸腺内经诱导和分化为前T细胞.
脾在胚胎第3个月时首先以产生红细胞为主,以后产生粒细胞,第5个月后,产生淋巴细胞和单核细胞,出生后成为产生淋巴细胞的器官.
淋巴结短暂产生红细胞,胚胎第4个月后至终身只产生淋巴细胞和浆细胞.
3)骨髓造血期:
骨髓在胚胎第3个月时,在长管骨骨髓中已开始造血.胚胎第8个月时,骨髓造血高度发育,产生红细胞,粒细胞,巨核细胞,淋巴细胞和单核细胞.红细胞的血红蛋白除血红蛋白F(HbF)外,已产生了少量的血红蛋白A(HbA)和少量的血红蛋白A2(HbA2).在骨髓造血旺盛时,肝,脾等造血功能逐渐减退.
胚胎期各类血细胞形成的顺序是:红细胞,粒细胞,巨核细胞,淋巴细胞和单核细胞.红细胞的形态由巨型逐渐向正常形态演变.
(2)出生后造血概况
出生后在生理情况下,人体主要的造血器官是骨髓.骨髓是唯一产生粒细胞,红细胞,巨核细胞的造血器官,同时也产生淋巴细胞及单核细胞.此外,胸腺,脾,淋巴结等也参与造血,终身产生淋巴细胞.
骨髓是一种海绵状,胶状或脂肪性组织,封闭在坚硬的骨髓腔内.其由神经,血管,基质细胞,细胞外基质及各类造血实质细胞共同组成,呈现为红色.健康成人骨髓组织重量为1600～3700g,平均2800g ;约占体重的3.4%～5.9%,平均4.6% .
红骨髓:红骨髓主要由结缔组织,血管,神经及造血实质细胞组成,造血功能十分活跃.在红骨髓内有红细胞造血岛,粒细胞造血岛,巨核细胞,单核细胞和淋巴细胞等,它们按一定的区域分布进行造血活动.如果血细胞分布的特定区域发生改变,则可出现病理状况.
5岁以下的儿童,全身骨髓腔内都充满红骨髓;5-7岁以后,骨髓逐渐开始脂肪化,由远心端向近心端扩展.18岁时,红骨髓仅存在于扁骨,短骨及长管骨的近心端,如颅骨,胸骨,脊椎骨,肋骨,髂骨及肱骨和股骨的近心端.
骨髓中的血管系统,血窦是最突出的结构.
黄骨髓:造血细胞被脂肪细胞替代,呈现为黄色,成为脂肪化的无造血功能的骨髓,但仍保留有极少的造血细胞,是潜在性的造血组织.
(3)淋巴器官造血概况
骨髓是B淋巴细胞发育成熟的场所,成熟的B淋巴细胞可随血流迁至周围淋巴器官,因此,骨髓是中枢淋巴器官.
胸腺: 胸腺的主要功能是产生淋巴细胞和分泌胸腺素,是T细胞发育成熟的器官.
脾:脾的胸腺依赖区,主要是T细胞存在.脾小体由大量的B细胞构成.主要产生T,B淋巴细胞.
淋巴结:淋巴小结的生发中心,主要是B细胞定居;付皮质区主要是T细胞聚集.髓索主要含B细胞和浆细胞,以及吞噬细胞,肥大细胞,嗜酸性粒细胞等.出生后淋巴结只产生淋巴细胞和浆细胞.淋巴细胞可以不断地进行再循环,这主要是促进T,B记忆细胞与抗原递呈细胞的接触,更好地进行免疫监控和发挥免疫功能.
(4) 髓外造血
在某些病理情况下,使骨髓的造血组织受到破坏,肝,脾,淋巴结等组织重新恢复其造血功能,以此部分代偿骨髓的造血功能,称为髓外造血.髓外造血有很大的局限性,在外周血中可出现幼稚细胞,如:有核红细胞,晚幼粒细胞,中幼粒细胞甚至早幼粒细胞及原粒细胞.
2.造血微环境
(1)造血微环境概念
造血微环境是由除造血细胞以外的所有参加调控造血的间质成分,包括微血管系统,神经成分,网状细胞,基质细胞(成纤维细胞,内皮细胞,吞噬细胞,脂肪细胞),细胞外基质及其它结缔组织等组成,统称为造血微环境.是造血干细胞赖以生成的场所,造血细胞在微环境各种因素的调控下增殖,分化,发育及成熟.
(2)造血微环境的组成
造血微环境主要有神经,微血管,基质细胞及其分泌的细胞因子和细胞外基质.
1)骨髓神经来自脊神经,其神经束分支呈网状分布于骨髓动脉;神经纤维终止于动脉平滑肌.也有很细的无鞘神经纤维在造血细胞之间终止或分布在骨髓表面或骨内膜.神经调节对造血的作用是:影响血管的扩展或收缩,从而影响血流速度和压力,调节着血细胞的释放等.
2)骨髓-血屏障: 血窦是骨髓内重要的组织结构,它是动脉毛细血管末端分支形成的放射状窦状腔隙,密布于整个骨髓腔内.造血细胞是处于血窦外的窦间区(造血索).骨髓内成熟血细胞要进入外周血循环必须穿过血窦壁,所以,血窦壁组成了骨髓-血屏障.
大部分的血窦壁只有一层内皮细胞或两层胞膜.内皮细胞转运细胞的孔道常达2-3nm,因此,穿越的细胞必须具有变形性.成熟的有核白细胞穿过时核必须重排成线状而进入血窦内;而幼稚红细胞的核坚固不能变形被阻挡在血窦壁外,在正常情况下,红细胞系只有网织红细胞和成熟红细胞才能进入血循环.巨核细胞只有胞浆穿过向血窦内释放血小板.造血旺盛的骨髓血窦丰富,造血功能低下的骨髓血窦减少.
3)基质细胞:骨髓基质细胞主要包括内皮样细胞,纤维母细胞,脂肪细胞,吞噬细胞,骨细胞,基质干细胞等.基质细胞能分泌许多细胞因子及细胞外基质.细胞因子如GM-CSF,干细胞因子(SCF)白血病抑制因子(LIF),细胞黏附分子(CAMs)等,这些细胞因子影响着血细胞的生成和发育.基质细胞表面也有许多细胞因子受体,能接受外源信息影响其细胞因子分泌的程度及种类.
4)细胞外基质:细胞外基质由基质细胞分泌到细胞外的区域,主要由分泌蛋白和多糖组成,包括三类大分子物质:糖蛋白,蛋白多糖和胶原.糖蛋白中主要有纤维连接蛋白,层黏连蛋白和血细胞黏连蛋白.蛋白多糖有硫酸软骨素,硫酸肝素和透明质酸等.胶原中主要是Ⅰ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅵ型胶原.
这些物质都与造血细胞的黏附有关.细胞黏附分子是造血干,祖细胞和骨髓基质细胞之间重要的桥梁,是细胞之间信息传递的分子基础.所以,基质细胞分泌的多种细胞因子及细胞外基质对造血干,祖细胞的增殖,分化和发育起正,负调控作用.
3.造血干(祖)细胞
现已公认,造血干细胞来源于胚胎干细胞.
(1)造血干细胞
造血干细胞的基本特征是
1)自我更新和自我维持:
造血干细胞在骨髓中仅约占有核细胞的0.1%～0.5%.正常情况下其95%以上又处于G0静止期.在分化后自身的数量和特征保持不变,这一特征持续终身.
造血干细胞以不对称性的有丝分裂方式产生两个子细胞;其中一个立即分化为早期祖细胞;但另一个子细胞则保持原有全部特性不变.这样,造血干细胞在骨髓中达到了自我更新而数量又保持不变.
2)多向分化性:
造血干细胞能够分化为髓系和淋巴系祖细胞,祖细胞再定向分化发育为相应的各系原始,幼稚及成熟细胞.故可以称其为全能干细胞.
3)多态性:
即造血干细胞的不均一性.造血干细胞的群体在形态和生物物理特征及表面标志都不同,具有\"异质性\"和\"等级性\".
造血干细胞缺乏形态特征,难以辨认,相似小淋巴细胞,常只能依据其表面标志特征来识别.目前,通常认为造血干细胞绝大多数表达的是:CD34+,Thy-1+(CD90+),低表达和不表达 CD38和HLA-DR,缺乏系特异系列抗原表面标志( Lin-)等,其中最重要的是CD34抗原.CD34抗原在干细胞为强阳性,到晚期祖细胞直到分化为各系原,幼细胞时,CD34抗原消失.
(2)造血祖细胞
造血祖细胞由造血干细胞分化而来,是(早期)已部分或(晚期)全部失去了自我更新能力的过渡性,增殖性细胞群.造血祖细胞全部是以对称性有丝分裂方式进行增殖,一边增殖一边分化,祖细胞阶段也存在着不同的亚群.在骨髓中的单向祖细胞是:淋巴系祖细胞(CFU-L),其可分化为T细胞祖细胞(CFU-TL)和B细胞祖细胞(BL-CFU).髓细胞系的粒,单系祖细胞(GM-CFU),其可分化为粒细胞系祖细胞(CFU-G)和单核细胞系祖细胞(CFU-M).红系中有红细胞早期(或爆式)集落形成单位(BFU-E)和红细胞系祖细胞(CFU-E).巨核细胞系祖细胞(CFU-Meg);嗜酸粒细胞祖细胞(CFU-Eo);嗜碱粒细胞祖细胞(CFU-Bas ).它们只能定向分化为各系原,幼细胞,至到发育成熟为终末细胞.
造血祖细胞表面标志是:早期CD34+逐渐到晚期CD34-,CD38+,CD71- ,Lin+ 等.
目前,常采用流式细胞术运用多参数分析来分选造血干细胞和造血祖细胞.
(3)造血干,祖细胞的临床应用
造血干,祖细胞的临床应用主要是造血干细胞移植.基本原理是以正常造血干细胞替代异常造血干细胞,使患者的造血功能和免疫功能重建.
造血干细胞移植有:骨髓移植,外周血干细胞移植,脐血干细胞移植,胎肝干细胞移植等.近年发展较快的是外周血干细胞移植.CD34+细胞是公认的理想造血干细胞移植物,在基因治疗中造血干细胞也是公认的理想靶细胞.造血干,祖细胞临床用于治疗恶性血液病,实体瘤,某些遗传性疾病,自身免疫性疾病能达到较好的效果.
4.血细胞的增殖和成熟
\"增殖\"是细胞通过有丝分裂进行复制的过程. \"分化\"是细胞在基因的调控下,从一般向特殊演变,在此过程中失去某些潜力但同时又获得新的功能.\"成熟\"是包含在整个发育过程中,其形态特征逐渐明确.\"释放\"是终末细胞通过骨髓-血屏障进入血循环的过程.有丝分裂是血细胞增殖的主要形式.
(1)血细胞的增殖
原,幼细胞的增殖都是对称性的,但巨核细胞则不同,巨核细胞的增殖全部在祖细胞阶段.从原始巨核细胞起,不再进行细胞分裂.细胞中DNA可以连续成倍增殖,细胞核也成倍增加,每增殖一次,核就增大一倍,但细胞浆并不分裂,故细胞体积逐渐增大,属多倍体细胞.
(2)血细胞的发育和成熟
血细胞的发育是连续性的,成熟是指由原始细胞经幼稚细胞到成熟细胞的过程.血细胞分化,发育和成熟的程序是:
造血干细胞经由多能干细胞(包括髓系和淋巴干细胞),各系祖细胞阶段而定向发育为原始细胞;此时其形态特征已可辨认.各系原始细胞进一步发育成熟为具有特定功能的终末细胞.
血细胞的命名 骨髓造血细胞按所属系列分为五大系统,各系依其发育水平分为原始,幼稚及成熟三个阶段;红系和粒系的幼稚阶段又分为早幼,中幼和晚幼三个时期.各系的发育顺序是:
红细胞系:原红细胞,早幼红细胞,中幼红细胞,晚幼红细胞,网织红细胞,成熟红细胞.
粒细胞系:原粒细胞,早幼粒细胞,中幼粒细胞,晚幼粒细胞,杆状核粒细胞,分叶核粒细胞.粒细胞系也包括嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞.
淋巴细胞系(浆细胞系):原淋巴细胞,幼淋巴细胞,淋巴细胞(原浆细胞,幼浆细胞,浆细胞).
单核细胞系:原单核细胞,幼单核细胞,单核细胞.
巨核细胞系:原巨核细胞,幼巨核细胞,颗粒型巨核细胞,产板型巨核细胞,血小板.
(3)血细胞发育成熟的一般规律 血细胞发育过程中有共同的形态学特点
(表1-1).
表1-1 血细胞发育过程中形态演变一般规律
项 目 幼稚 备 注
原始 成熟
细胞大小 大 小 原始粒细胞比早幼粒细胞小,巨核细胞由小变大
核质比例 大 小
核大小 大 小 成熟红细胞核消失
核形态 圆 凹陷 分叶 有的细胞不分叶
核染色质 细致 粗糙
疏松 致密
核染色受色 淡紫色 深紫色
核膜 不明显 明显 淋巴细胞核膜较明显
核仁 有 无
胞质量 少 多 小淋巴细胞较少
胞质颜色 蓝(嗜碱) 红(嗜酸)或天蓝 浅蓝
胞质颗粒 无 少 多 粒细胞分为三种颗粒 小淋巴细胞无颗粒
5.造血调控
(1)造血的基因调控
基因调控主要是原癌基因和抑癌基因的表达产物及信号转导参与对细胞增殖和分化的调控.
1) 原癌基因:如:c-myc基因,ras相关基因,c-abl基因,bcl-2 基因,c-kit 基因等.原癌基因编码的产物可为:细胞因子,细胞因子受体,细胞内蛋白激酶,细胞内信号传递分子及转录因子等.它们促进造血干细胞的增殖及分化.原癌基因在化学,物理,生物等因素作用下,通过点突变,染色体重排,基因扩增等途径引起结构改变可转化为癌基因,导致细胞增殖失控和分化停滞.
2)抑制癌基因: 如:P53基因,,WT1基因,NF1基因,PRB基因,DCC,Rb基因等.抑癌基因编码的蛋白质产物可以是正常细胞增殖的负调节因子,抑制细胞增殖,诱导终末分化,维持基因稳定,调节生长,负性生长因子的信号传导,诱导细胞凋亡等.
3)信号转导的调控:基因转录由称为转录因子的蛋白控制.转录因子参与信号转导途径.信号转导通路形成复杂的信号网络,并与转录因子相互作用,相互协调,使细胞在特定信号作用下基因转导作出专一性表达来诱导或抑制细胞增殖与分化.
(2)造血细胞因子的调控(体液调控)
细胞因子是由基因编码的细胞外信号分子,主要功能是在细胞之间传递信息以调节细胞增殖及分化.细胞因子由骨髓基质细胞产生的,称为近程因子,如:CSFs ,IL-3等,由内分泌器产生经血液循环达到造血组织起作用的,称为远程因子,如:红细胞生成素及血小板生成素.近程因子用四种方式发挥作用:旁分泌(邻近),自分泌(自身调节),内分泌,并置分泌(相邻). 近程因子和远程因子可共同发挥作用(表1-2).
表1-2 造血正,负调控的细胞因子
正向调控 负向调控
SCF,FL 肿瘤坏死因子-α,β
白细胞介素类 转化生长因子-β
集落刺激因子 白血病抑制因子
红细胞生成素 干扰素α,β,γ
血小板生成素 趋化因子
白血病抑制因子
1) 造血正向调控的细胞因子:
造血正向调控主要是通过促进造血的细胞因子来完成的.包括:
主要作用于早期造血细胞的细胞因子:SCF,FL及白细胞介素类.这些因子多是协同作用.
集落刺激因子(CSF),其有四种主要的类型:
粒-单细胞集落刺激因子(CSF-GM)是一种多系集落刺激因子.能够刺激红系,粒系,单核系,巨核系等集落形成.
粒细胞集落刺激因子(CSF-G)主要是粒细胞系特异的集落刺激因子.
单核细胞集落刺激因子(CSF-M)促进单核细胞,吞噬细胞集落形成.
巨核细胞集落刺激因子(CSF-Meg)促进巨核细胞的增殖和分化,促进血小板产生.
多系集落刺激因子(CSF- Multi)即是白细胞介素3(IL-3),刺激多系集落生长.
白细胞介素(ILs):是一类由活化白细胞产生的信号分子,目前已正式命名IL1～IL20.IL1,IL3和IL6作用于造血干细胞分化出髓系干细胞,IL3主要对造血干细胞及早,晚期造血祖细胞和对粒系,红系,巨核各系都有促生长作用;IL1 和IL6作用于造血干细胞分化出淋巴系干细胞,此后,淋巴系干细胞再分化出前T,前B细胞的过程中也有IL1 和IL6的作用.IL11,其有多方面功能,能促进巨核细胞产生血小板,目前在临床上,它是唯一能提高外周血血小板数的细胞因子.
红细胞生成素(EPO) 由肾,胎肝产生,促进红系集落形成,促进幼红细胞分化及血红蛋白合成及减少红系祖细胞的凋亡等.重组人EPO临床应用治疗各种贫血.
血小板生成素(TPO) 是生理性调节血小板生成最重要的因子,具有对巨核系的特异性,促进巨核细胞的增殖,分化与血小板的产生.
白血病抑制因子(LIF) 促进胚胎干细胞的增值,促巨核祖细胞的增殖与分化.
2)造血负向调控的细胞因子 :
抑制造血生长因子的称为负调节因子.包括:
转化生长因子-β(TGF-β) 是主要的抑制因子,其作用是抑制细胞周期及抑制早期祖细胞的增殖.
肿瘤坏死因子-α,β(TNF-α,β) 其对造血的调控作用是:能抑制CSF-GEMM,CSF-GM,CSF-Meg,BFU-E,CFU-E等的生长,抑制细胞周期,
白血病抑制因子(LIF) 具有双向作用,但对造血更多的是负调节,主要是抑制胚胎干细胞和造血干细胞的分化.
干扰素α,β,γ(IFN-α,β,γ) 其具有增强和调节免疫,抗病毒,抗肿瘤,抑制细胞增殖作用.
趋化因子(CK) 参与造血调控的有血小板第4因子,IL-8,MIP-1α.PF4抑制巨核细胞的增殖;MIP-1α又称为吞噬细胞炎性蛋白,在体内,外均可抑制造血细胞集落的形成.
(3)细胞外基质对造血的调控
造血调控中细胞因子外基质也起重要作用,细胞外基质对造血细胞的黏附,定位,迁移等有支持生存的作用,同时也介导细胞与细胞,细胞与基质的各种物理,化学信号传递.影响细胞因子,生长因子,转移因子的能力及抑制诱导凋亡基因的表达,从而调控造血.
细胞凋亡
(1)细胞凋亡基本概念
细胞死亡有两种方式.一种是细胞坏死,另一种死亡方式称细胞凋亡(apoptosis),这是细胞死亡的一种生理形式,是在基因调控下细胞主动死亡过程.也可称为程序性细胞死亡.
(2)细胞凋亡的形态学变化及主要生物化学特征
细胞凋亡不伴细胞溶酶体及胞膜破裂,没有细胞内容物的外溢,故不引起组织的炎症反应(表1-3).
1) 细胞膜的变化 细胞脱水,胞体变小,变圆,然后与邻近细胞脱离.膜出现发泡状并有不规则的突起,但胞膜并不破坏而是完整的.
2) 细胞核的变化 染色质凝集(核固缩)呈月牙状聚向核膜周边或凝集在核中央,染色质可啐裂成多个大小不等的小块.
3) 细胞质的变化 线粒体呈空泡状,内质网扩大疏松并逐渐与细胞膜融合.
4) 凋亡小体形成 细胞膜逐渐内陷,包裹着核啐片,胞质,细胞器形成一些大小不一的球状小体脱落,即凋亡小体.该凋亡小体很快被吞噬细胞识别而吞噬.
5) 细胞凋亡的主要生物化学特征 内源性核酸内切酶激活,DNA被其在核小体间的连接处切断,染色质DNA降解为长度180～200bp整倍的寡聚核苷酸片断,其琼脂糖凝胶电泳图呈特殊的梯状条带图形.另外,胞内Ca2+浓度增高,引起众多靶酶的活化,触发细胞凋亡.并有RNA和蛋白质大分子的合成来抵御细胞凋亡发生.
表1-3 细胞凋亡和细胞坏死的区别
特征 细胞凋亡 细胞坏死
诱发因素 特定的或生理性 各种病理性
细胞数量 单个细胞丢失 成群细胞死亡
质膜 完整保持 肿胀溶解破坏
细胞核 固缩啐裂为片断 溶解 破碎
染色质 凝集呈半月状 模糊 疏松
线粒体 肿胀通透性增加 细胞色素c释放 肿胀 破裂
细胞器 完整 损伤
内容物释放 无 有
炎症反应 无 有
核DNA 降解为完整倍数大小的片段 随机不规则断裂
凝胶电泳 梯状条带形 分散形态
(3)细胞凋亡的基因调控
细胞凋亡的调控基因按其功能分为两类, 一类是促进细胞增殖和存活的基因如:C-myc,c-abl,ras,Bcl-2,c-kit等,另一种是细胞死亡的基因如:P53基因,RB基因及WT-1基因等.
Bcl-2基因 是凋亡的重要调节因子,其家族有较多成员,在功能上有促进凋亡和抗凋亡的作用.Bcl-2抗凋亡机制主要体现在:能抑制氧化物诱导的细胞凋亡,抑制细胞周期动力学,促进对损伤染色体DNA的修复,抑制其它促凋亡蛋白的活性,能够阻断由多种信号诱导的细胞凋亡.
P53基因 是重要的抑癌基因,它能够保护细胞DNA 的完整性.当DNA损伤而不能修复时,P53基因诱导细胞凋亡.P53基因分野生型和突变型两种,突变型P53基因能够抑制野生型P53基因的功能使细胞转化,抑制细胞凋亡,并可导致肿瘤发生.
(4)细胞凋亡的常用检测方法
1)形态学观察: 包括普通显微镜检查法,倒置显微镜检查法,萤光显微镜检查法及电子显微镜检查法.
2)生物化学检测: 琼脂糖凝胶电泳见特征性梯形电泳图.
3)原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶标记技术
4)ELISA法
5)流式细胞仪检测
(5)细胞凋亡的生物学意义
1)细胞凋亡普遍的生物学意义:细胞凋亡清除了无用的细胞,多余的细胞,发育不正常的细胞,已完成了功能的细胞及有害的细胞.在生命活动中细胞凋亡与细胞增殖是矛盾的统一,在其相互制约,相互协调下保证了机体正常的生长和发育.
2)在血液系统中,活跃的细胞凋亡机制,才能维持造血干细胞的自我更新,分化和血细胞消亡的平衡,保持血细胞数量和功能的恒定.对细胞凋亡机制的研究必将深入地探讨恶性血液肿瘤的发病机制及治疗的新方法,最终达到控制和战胜控制疾病的目的.
第二章 骨髓检查
1.骨髓穿刺技术
(1)骨髓穿刺部位,方法及注意事项
1)骨髓穿刺部位
骨髓标本大部分采用穿刺法吸取.常用骨髓穿刺部位一般为:
①髂骨后上棘 ,为临床上首选的穿刺部位;②髂骨前上棘;③胸骨穿刺;④其他部位 三岁以下的小儿还可选择胫骨头内侧.⑤局部有症状者,可直接穿刺有症状的部位(即定位穿刺),骨髓穿刺部位的不同,细胞的数量和组成可能有一定的差异,尤其是病变呈局灶性分布的疾病,差异可能会更明显,因此必要时应多部位取材,以便全面了解骨髓的造血情况.
2)穿刺方法及注意事项
常规的骨髓穿刺方法主要包括以下步骤: ①选择体位,常采用侧卧位或俯卧位;②定位;③常规消毒 ;④局部麻醉 ;⑤进骨髓穿刺针;⑥抽吸骨髓液.
穿刺注意事项:
穿刺过程中应注意:①严格遵守无菌操作,防止骨髓感染;②初诊病人治疗前进行;③死亡病例需要作骨髓检查时一般要在半小时内进行;④抽取骨髓液时,量不宜过多,一般以小于0.2毫升为宜;⑤某些疾病须进行多部位穿刺和特定部位穿刺,以提高诊断率.
(2)骨髓\"干抽\"概念和发生\"干抽\"的原因
干抽(dry tap)是指非技术原因或穿刺位置不当,多次,多部位穿刺抽不出骨髓液的现象.常见于:①原发性和继发性骨髓纤维化;②骨髓极度增生,细胞排列过于密集;③骨髓增生减低;④肿瘤骨髓浸润等.
(3)骨髓取材满意的指标
①抽吸骨髓液时病人有特殊的痛感.②抽出的骨髓液中有较多的骨髓小粒和脂肪滴.③显微镜下涂片有骨髓特有的细胞如:巨核细胞,浆细胞,组织嗜碱细胞,成骨细胞,破骨细胞,肥大细胞,网状细胞,网状纤维等.④骨髓中中性杆状核粒细胞/中性分叶核粒细胞比值大于外周血中性杆状核粒细胞/中性分叶核粒细胞比值.
2.骨髓涂片检查
(1)骨髓涂片制作,染色方法
1)制片
骨髓涂片制作方法与血片制作方法基本相同,但因有骨髓小粒和脂肪滴,有核细胞较多,因此较血液黏稠,推片略难于血片,推片时角度要小一些,速度要慢一些,避免骨髓片过厚.
2)染色
临床常用的染色方法主要有:
①瑞氏(Wright)染色
②吉姆萨(Giemsa)染色
③Marshall提出的标准化的Romanowsky染色
④R-G(Romanowsky- Giemsa)染色
⑤wittekind1987年介绍的R-G染色
(2)骨髓片检查的程序及方法
1)检查步骤
[骨髓涂片检查]
①低倍镜
Ⅰ.观察取材,涂片,染色是否满意等.
Ⅱ.判断有核细胞增生程度 低倍镜下选择细胞分布均匀部位观察骨髓片有核细胞增生情况,根据骨髓片中有核细胞的密度或有核细胞与成熟红细胞的比例来估计有核细胞的增生程度.骨髓有核细胞增生程度通常分为五级,如表2-1.
表2-1骨髓有核细胞增生程度五级估计标准
增生程度
成熟红细胞:
有核细胞
有核细胞均数
(高倍镜视野)
常见病例
增生极度活跃
1:1
>100
各种白血病
增生明显活跃
10:1
50-100
各种白血病,增生性贫血
增生活跃
20:1
20-50
正常骨髓象,某些贫血
增生减低
50:1
5-10
造血功能低下
增生极度减低
200:1
<5
再生障碍性贫血
Ⅲ.观察全片巨核细胞的数量 巨核细胞数量变化较大,如将骨髓膜标准化为1.5cm×3.0cm(4.5cm2),则参考值为7-35个.
Ⅳ.观察骨髓片边缘和尾部有无体积较大的或成堆的特殊病理细胞.
②油镜
分类计数200或500个有核细胞(不包括分裂型细胞和破碎细胞).按各细胞的种类,发育阶段分别记录,并计算出百分比.同时仔细观察各系,各阶段细胞的形态是否正常.
[血涂片检查]
分类记数100-200个白细胞,计算各类白细胞的百分率,描述红细胞形态,血小板数量和分布情况.如见到幼红细胞按分类100个白细胞中幼红细胞的数量来报告,并说明其阶段性.
(3)骨髓报告
1) 结果计算
计算出各系和各阶段细胞占有核细胞总数的百分数;再算出各阶段粒细胞百分数的总和与各阶段幼红细胞百分数之总和,将前者除以后者即得出粒:红比值(G:E).粒红比值代表粒系和红系的相对数量关系,正常人约为2-4:1.如有核细胞增生亢进,G:E增大,则为粒系增多;如有核细胞增生低下,G:E增大,则为红系减少.
2) 骨髓象报告单的填写
应用简明扼要的语言,突出重点,填写骨髓检查报告单.
①\"骨髓特征\"一栏主要内容为Ⅰ.对取材,涂片,染色的评价;Ⅱ.骨髓有核细胞的增生程度和粒红比值;Ⅲ.分别叙述各系细胞的情况.Ⅳ.巨核细胞和血小板的数量,形态由全片来评估;Ⅴ.是否见到特殊的病理细胞和寄生虫.
②报告血涂片检查结果
③报告细胞化学染色结果.
④填写诊断意见 综合骨髓象,血象,结合临床资料,客观地向临床提出细胞学诊断意见或可供临床参考的意见,一般诊断意见有以下五种:
Ⅰ.肯定性诊断;Ⅱ.符合性诊断;Ⅲ.疑似性诊断;Ⅳ.阴性(或排出性)诊断,这种情况一般报告\"大致正常骨髓象\";Ⅴ.若骨髓象有某些特征性改变但并非特异性的改变,对临床诊断提不出具体支持和反对意见,也不能用临床表现加以解释者,可直接扼要地描述骨髓象特征,继续观察和随访.
3.常用血细胞化学染色
(1)过氧化物酶染色的原理和临床意义
[原理] 粒细胞和单核细胞胞浆中含有的过氧化物酶(peroxidase,POX)能将底物过氧化氢分解,产生新生态氧,它将四甲基联苯胺氧化为联苯胺蓝.联苯胺蓝自我脱氢氧化,显棕色四甲基苯醌二胺,再加入亚硝基铁氰化钠与联苯胺蓝结合,可形成稳定的蓝色颗粒,定位于细胞浆内酶所在的部位.
[临床意义]
临床上主要用于急性白血病类型的鉴别:急性淋巴细胞白血病原,幼淋巴细胞POX染色均呈阴性反应;急性粒细胞白血病 原粒细胞POX染色呈局灶分布的阳性反应;急性早幼粒细胞白血病 颗粒增多的早幼粒细胞POX染色呈强阳性反应;急性单核细胞白血病原,幼单核细胞POX染色多呈细小颗粒弱阳性反应.
(2)过碘酸-雪夫染色的原理和临床意义
[原理] 过碘酸-雪夫(Pexiodic acid-schiff,PAS)染色又称糖原染色.胞浆内存在的糖原或多糖类物质(如黏多糖,黏蛋白,糖蛋白,糖酯等)中的乙二醇基(CHOH-CHOH)经过碘酸(Periodic acid)氧化,转变为二醛基(CHO-CHO),与雪夫(Schiff)试剂中的无色品红结合,形成紫红色化合物而沉积于胞浆中糖原类物质所存在的部位.该反应称为过碘酸-雪夫(PAS)阳性反应.
[临床意义]
1)急性白血病类型的鉴别 红白血病的幼红细胞PAS染色多呈阳性反应,阳性率高,反应强;成熟红细胞有时亦可为阳性;急性淋巴细胞白血病的原,幼淋巴细胞PAS染色多为红色颗粒或块状阳性反应; 急性粒细胞白血病的原粒细胞呈阴性或胞质呈弥漫淡色阳性反应;急性早幼粒细胞白血病 异常早幼粒细胞的PAS染色为阳性反应;急性单核细胞白血病原,幼单核细胞PAS染色阳性反应呈弥漫分布的红色细颗粒,巨核细胞白血病原巨核细胞PAS染色呈阳性或强阳性反应,表现为红色颗粒或块状.
2)各类贫血的鉴别 MDS,缺铁性贫血,珠蛋白生成障碍性贫血(曾称地中海贫血)的幼红细胞PAS染色多为阴性反应,有时可出现阳性反应;巨幼红细胞贫血,溶血性贫血,再障的幼红细胞PAS染色为阴性.
3)其他细胞类型的鉴别 戈谢细胞呈强阳性反应;尼曼-匹克细胞PAS染色为弱阳性,空泡中心阴性.非霍奇金淋巴细胞PAS染色呈阳性反应;R-S细胞则为弱阳性或阴性反应.骨髓内转移的腺癌细胞PAS染色呈强阳性反应,表现为红色颗粒或块状.
(3)中性粒细胞碱性磷酸酶染色的原理和临床意义(偶氮耦联法,Kaplow)
[原理] 中性粒细胞内碱性磷酸酶(neutrophile alkaline phosphatese, NAP)在pH9.2-9.8时,能水解磷酸萘酚钠,释放出磷酸与萘酚,再以重氮盐与萘酚耦联成不溶性有色沉淀于胞质内酶所存在的部位.
[临床意义]
1)白血病 急性粒细胞白血病NAP阳性率及积分值均降低,急性淋巴细胞白血病NAP积分值明显增高;慢性粒细胞白血病(无继发感染时)NAP积分值显著降低,甚至为\"0\",类白血病反应NAP积分值明显增高,是两者鉴别的重要检测项目;慢性中性粒细胞白血病NAP积分值显著增高,常在200分/100NC以上,也有利于与慢性粒细胞白血病鉴别.
2)其他血液病
各类贫血 再障时NAP积分值增高,阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)和MDS时NAP积分值一般减低.因此NAP检测有助于与PNH,MDS等疾病的鉴别.
真性红细胞增多症时NAP积分值显著增高,继发性红细胞增多症NAP积分正常或降低,这是两者的鉴别方法之一.其他慢性骨髓增生性疾病,如骨髓纤维化,原发性血小板增多症等,NAP积分值增高.
恶性组织细胞病时NAP积分值明显减低,而反应性组织细胞增多时NAP积分值往往增高,有助于两者鉴别.
细菌性感染时NAP积分值增高,病毒感染或寄生虫,立克次体感染时NAP积分值一般正常或降低.该检测对鉴别细菌感染与其他感染有一定价值.
(4)氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色的原理和临床意义
[原理] 细胞内的氯乙酸AS-D萘酚酯酶(naphythol AS-D chloroacetate esterase,NAS-DCE)水解基质液中的氯乙酸AS-D萘酚,产生AS-D萘酚,进而与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀,定位于细胞质内酶所存在的部位.本试验常用的重氮盐为坚牢紫酱GBC,形成的有色沉淀为红色.NAS-DCE几乎仅出现在粒细胞,其特异性高,因此又称为\"粒细胞酯酶\",\"特异性酯酶\".
[临床意义] 临床上主要用于急性白血病类型的鉴别 急性粒细胞白血病和急性早幼粒细胞白血病原粒细胞NAS-DCE染色多呈(+)-(++),白血病性早幼粒细胞呈(++)-(+++);急性单核细胞白血病 原,幼单核细胞多呈阴性反应;急性淋巴细胞白血病 原,幼淋巴细胞呈阴性反应.
(5)中性非特异性酯酶染色的原理和临床意义
[原理] 中性非特异性酯酶包括醋酸AS-D萘酚酯酶(naphytholAS-D acetate esterase,NAS-DAE)染色和α-醋酸萘酚酯酶(α-naphythyol acetate esterase , α-NAE)染色.细胞内的α-醋酸萘酚酯酶(α-naphythyol acetate esterase , α-NAE)在pH中性的条件下水解基质液中的α-醋酸萘酚,释放出α-萘酚,进而与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀,定位于细胞质内酶所在的部位.
[临床意义] 主要用于急性白血病类型的鉴别.NAS-DAE染色属于中性非特异性酯酶染色,在鉴别白血病类型时需同时做NaF抑制试验.急性粒细胞白血病的原粒细胞NAS-DAE染色可呈阳性反应,且不被氟化钠抑制;急性早幼粒细胞白血病的白血病性早幼粒细胞NAS-DAE染色为阳性或强阳性反应,亦不被氟化钠所抑制;急性单核细胞白血病的原,幼单核细胞NAS-DAE染色多呈阳性或强阳性反应,但能被氟化钠抑制;急性粒-单核细胞白血病的阳性反应的单核细胞系白血病细胞能被氟化钠抑制,而粒系白血病细胞则不被抑制;急性淋巴细胞白血病的原,幼淋巴细胞呈阴性或弱阳性反应,且不被氟化钠抑制.
(6)碱性α-丁酸萘酚酯酶染色的原理和临床意义
[原理] 细胞内的α-丁酸萘酚酯酶(α-naphythyol butyrate esterase, α-NBE)在pH碱性条件下水解基质液中的α-丁酸萘酚,释放出α-萘酚,后者与基质液中的重氮盐耦联形成不溶性的有色沉淀,定位于细胞质内酶所存在的部位.本试验常用的重氮盐为坚牢紫酱GBC,形成的有色沉淀为红色.α-NBE主要存在于单核细胞中,其阳性产物能被氟化钠抑制,而其他细胞系列的阳性产物不能被氟化钠抑制.
[临床意义] 常用于急性白血病类型的鉴别.急性粒细胞白血病的原粒细胞和早幼粒细胞呈阴性反应,少数为弱阳性反应;急性单核细胞白血病的 原,幼单核细胞多呈阳性反应,能被氟化钠抑制;急性淋巴细胞白血病的原,幼淋巴细胞常呈阴性反应;多毛细胞白血病的多毛细胞呈弥散分布,颗粒细小的阳性反应,亦可见聚成半月形的粗颗粒,不被氟化钠抑制;恶性组织细胞病的异常组织细胞可呈阳性,但不被氟化钠抑制.
(7)酸性磷酸酶染色的原理和临床意义
[原理] 细胞内的酸性磷酸酶在酸性条件下,将基质中的磷酸萘酚AS-BI水解,释出萘酚AS-BI,再与重氮盐耦联,形成不溶性有色沉淀,定位于胞浆中.
[临床意义]
1)白血病类型鉴别 多毛细胞白血病的多毛细胞ACP染色呈强阳性或中度阳性反应,并耐L-酒石酸抑制作用;急性单核细胞白血病的原,幼单核细胞ACP染色为强阳性反应;急性淋巴细胞白血病的原淋巴细胞ACP染色常呈弱阳性反应;急性粒细胞白血病的原粒细胞对ACP染色反应不一;慢性淋巴细胞白血病和淋巴瘤的淋巴细胞ACP染色也可阳性,但可被L-酒石酸抑制,有助于与多毛细胞鉴别.
2)鉴别T淋巴细胞和B淋巴细胞 T淋巴细胞ACP染色呈阳性反应,颗粒粗大,密集,局限性块状;B淋巴细胞ACP染色呈阴性反应,或为颗粒稀疏,细小的弱阳性反应.
3)戈谢细胞和尼曼-匹克细胞的鉴别
戈谢细胞ACP染色呈强阳性反应;尼曼-匹克细胞呈阴性或弱阳性反应.
(8)酯酶双染色的原理和临床意义
[原理] 在同一张涂片上进行两种酯酶染色的方法称为酯酶双染色.多数采用一种特异性酯酶加一种非特异性酯酶染色,常用的有α-醋酸萘酚酯酶与氯乙酸AS-D萘酚酯酶双染色,α-丁酸萘酚酯酶与氯乙酸AS-D萘酚酯酶双染色等.反应的原理基本上同各自的染色原理,同一张涂片上的细胞要分别在两种不同的基质液中作用一定时间,最后复染,显微镜观察.
[临床意义]
酯酶双染色可同时观察两种不同的白血病细胞,因此在鉴别白血病类型方面明显优于单项染色.
1)急性粒-单核细胞白血病 该染色法在急性粒-单核细胞白血病的同一张涂片上可分别出现α-NBE染色和NAS-DCE染色阳性反应的细胞,甚至少数病例在单个细胞内同时出现以上两种酯酶染色的双重阳性反应,因此酯酶双染色反应在急性粒-单核细胞白血病的诊断上具有独特价值.
2)急性粒细胞白血病 粒细胞白血病NAS-DCE染色可出现不同程度的阳性反应,α-NBE染色则为阴性.
3)急性单核细胞白血病 α-NBE染色为阳性或强阳性反应,NAS-DCE染色为阴性,有助于与急性粒细胞白血病的鉴别.
4)急性淋巴细胞白血病 NAS-DCE染色及α-NBE染色在淋巴细胞均呈阴性反应.
(9)骨髓铁染色的原理和临床意义
[原理] 骨髓中的含铁血黄素(细胞外铁)和中,晚幼红细胞胞浆中的铁蛋白聚合物(细胞内铁)经普鲁士蓝反应形成蓝色的亚铁氰化铁沉淀,定位于细胞内外铁存在的部位.正常人骨髓细胞外铁为+-++.铁粒幼细胞阳性率为19%-44%.铁染色(iron stain;IS)中的细胞外铁反映骨髓中铁的储存量,细胞内铁反映骨髓中可利用铁的量.
[临床意义]
1)鉴别缺铁性贫血与非缺铁性贫血,前者细胞外铁减少甚至消失,铁粒幼细胞的阳性率明显减低,铁颗粒着色浅淡.
2)有助于铁粒幼细胞贫血的诊断和鉴别诊断.铁粒幼细胞贫血时铁粒幼细胞增多,且可见环形铁粒幼细胞,比例可达30%-90%.MDS的RAS型也可见环形铁粒幼细胞增多(占幼红细胞的15%或更多),借此可与再生障碍性贫血鉴别.
4.骨髓活检
骨髓活体组织检查(bone marrow biopsy, BMB)简称骨髓活检.是观察骨髓组织结构,补充骨髓涂片检查的一种方法.
(1)骨髓活检与骨髓穿刺的区别
骨髓活检和骨髓穿刺在临床的应用各有优势,骨髓穿刺比较常用,两种检查的优缺点见表(表2-2).
表2-2 骨髓穿刺及骨髓活检比较
骨髓穿刺
骨髓活检
取材方式
用骨髓穿刺针抽骨髓液后涂片瑞-姬染色后备检
用骨髓活检针取得一条骨髓组织,固定包埋切片后行姬姆萨等染色后备检
优点
1.操作较简便
2.涂片中细胞分布均匀,胞体舒展,染色良好,较易分辨各系原,幼细胞及其微细结构
3.易于识别巨型变,巨幼样变和小巨核细胞
4.细胞化学染色效果好,结果可量化
1.保持造血组织的天然结构,便于判断红髓和脂肪组织的比例
2.较全面了解骨髓增生程度,有核细胞密度及其布局
3.可避免血窦血的稀释
4.对骨髓纤维化,毛细胞白血病有确诊作用,能提示骨髓增生异常综合征向急性粒细胞白血病的转化,对\"干抽\"有鉴别作用
缺点
1.造血组织的天然结构已遭破坏,无法判断红髓,黄髓比例
2.若抽吸过猛,导致血窦血的稀释
3.若遇\"干抽\"不能分析
1.有核细胞群集,不易区分原,幼细胞的类型
2.难以观察细胞内的微细结构
3.细胞化学染色结果难以量化
(2)骨髓活检的临床应用
1) 可较全面而准确地了解骨髓增生程度,造血组织,脂肪细胞或纤维组织所占的容积比例;了解粒/红比值及骨髓内铁储存情况,对于某些疾病(如再生障碍性贫血,缺铁性贫血及骨髓增生异常综合征)及化疗后骨髓抑制程度有明确的诊断价值.
2)可以发现骨髓穿刺涂片检查不易发现的病理变化,对相关疾病的诊断,骨髓造血微环境及骨髓移植的研究有重要意义.
3) 活检比涂片能较早地预测疾病的预后.
4)可协助诊断慢性骨髓增生性疾病,如真性红细胞增多症,原发性血小板增多症,骨髓纤维化等.
5.血细胞免疫标记技术
(1)流式细胞仪的构造,原理,主要技术指标和临床应用
1)流式细胞术和流式细胞仪
流式细胞术(Flow cytometry; FCM)是集计算机技术,激光技术,电子技术,流体力学,细胞化学,细胞免疫学等多种高新技术与方法为一体的现代细胞分析技术.它以流式细胞仪(Flow cytometer)为工具,在单细胞水平上对大量细胞进行快速,准确,多参数的定量分析或分选,是现代血细胞学研究中较先进的分析技术.
流式细胞仪(flow cytometer,FCM)是流式细胞分析和分选所必需的仪器. FCM的主要构造可分为:①流动室与液流驱动系统;②激光光源及光束成形系统;③光学系统;④信号检测,储存,显示,分析系统;⑤细胞分选系统.
2)流式细胞仪工作原理
待测标本与荧光素标记的单克隆抗体(McAb)或与某些荧光染料结合后形成一定浓度的细胞悬液并放入流式细胞仪的样品管中,细胞在气体的压力下进入流动室.在流动室内鞘液的约束下,细胞排成单列从流动室的喷嘴高速喷出成为细胞液柱.细胞液柱与入射激光束垂直相交,相交点为测量区.通过测量区的细胞被激光照射后产生光散射并发出荧光,散射光与荧光穿过滤光片,被光电倍增管或光电二极管接收并转变为电信号,这些信号经加工处理储存于计算机中,用计算机软件对储存数据进行图像显示,运算,分析等,即可特异地获得血细胞的一系列重要的物理,生化,免疫学特征和功能状态等参数.
3)流式细胞技术在血液系统疾病中的应用
①白血病免疫分型
FCM免疫分型较多用于以下几种情况:Ⅰ用形态学,细胞化学染色不能确定细胞来源的白血病;Ⅱ形态学类似急性淋巴细胞白血病(ALL)或急性未分化白血病(AUL);Ⅲ混合性白血病.白血病的免疫分型对急性髓系细胞白血病(M0,M1,M2,M3,M6,M7)的分型诊断有重要意义,但对急性粒单细胞白血病(M4)和急性单核细胞白血病(M5)的分型还有一定的难度,对微量残留白血病的检测也有重要价值.
②淋巴细胞免疫表型分析
③血小板病诊断
④网织红细胞分析
⑤造血干/祖细胞计数
⑥细胞免疫功能分析
⑦DNA倍体与细胞周期分析
⑧白细胞分类计数
⑨细胞分选
流式细胞仪可将样本中所需要的细胞亚群从群体细胞中分离出来,即所谓分选(sorting).
(2)常用FISH技术的种类,原理,方法和临床应用
1)普通FISH
荧光原位杂交技术(flourenscent in situ hybridization,FISH).它用生物素(biotin)标记探针,通过荧光-抗生物素蛋白(avidine)酶联反应,在荧光显微镜下观察荧光信号即表示探针杂交的部位.FISH包括染色体FISH,间期核FISH等.FISH技术不仅可以测定中期染色体的特异序列,而且也能敏感地测定间期细胞核中的特异序列,这一优势在白血病的检测中尤为重要,因为它弥补了白血病患者骨髓细胞培养后难以获得高质量中期染色体的缺陷.
2)DNA纤维荧光原位杂交
DNA纤维FISH的优点是分辨率高,可达到1-500kb,可快速对探针排序,确定方向,测定探针间距离;较适用于端粒附近基因富集区的基因排序;对材料要求不高,新鲜组织,冰冻组织或石蜡标本等均可;对基因拷贝数的判定比较准确,可消除传统的中期FISH由于信号分裂引起基因拷贝数判断的错误.
3)比较基因组杂交(CGH)
CGH方法是近年来在多色染色体FISH基础上发展起来的—种新的分子遗传学技术,可用来确定间期核或中期细胞的染色体异常,且不需进行肿瘤细胞培养和制备其中期染色体标本,也不需事先了解染色体的结构和可能存在的异常.在一次实验中就可对整个基因组中所有的染色体异常进行总的分析.该技术在血液系统恶性肿瘤研究中已得到广泛应用.
4)多重FISH(M-FISH)
M-FISH可以检测许多具有结构异常标本或肿瘤样本中简单或复杂的染色体异常,可以解决常规染色体分析不能精确识别的染色体异常.如M—FISH可识别染色体数目异常及一些结构重排,如整条染色体的获得或丢失,简单或复杂的易位.应用比例长度分析及染色体条带转换图也可以识别染色体易位断裂点.M-FISH可以从已定论的疾病如白血病中发现新的隐匿的染色体异常.
(3)免疫细胞化学染色
免疫细胞化学染色是将血液,骨髓液,浆膜腔积液等等各种体液组织制成的涂片和骨髓等组织的切片经各种单克隆抗体的标定和常用的过氧化物酶或碱性磷酸酶显色后对白血病细胞直接镜检,以确定细胞类型.
免疫组织化学染色方法繁多,可根据标记物的不同分为:免疫酶细胞化学染色,免疫荧光细胞化学染色,免疫金银染色技术以及亲合免疫组织化学染色技术等.目前血液系统疾病检查常用免疫细胞化学染色方法有三种:过氧化物酶-抗过氧化物酶(PAP)法,碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶(APAAP)法和亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC-AP)法.
应用骨髓切片免疫组织化学技术可以对骨髓细胞进行原位观察,通过对细胞特异性抗原的定性,定位和定量分析,了解骨髓组织和细胞的结构和变化,这对血液系统疾病尤其是血液系统肿瘤的诊断,鉴别诊断,以及血液肿瘤的分类,分型和预后的判断提供了有利的研究手段.
6.造血干/祖细胞培养
体外造血干/祖细胞培养主要是利用造血干/祖细胞的生物学特性检测其在骨髓,血液和脐血中的数量及生物活性,同时也可应用于体外造血干/祖细胞类型,特性及生理意义的实验研究,在造血系统疾病的发生机制,诊断,疗效,预后判断及治疗药物的选择等方面具有十分重要的意义.
(1)常用造血干/祖细胞培养的种类和原理
1)粒-单系造血祖细胞培养
[原理] 受检者血液,骨髓或脐血经过分离获得的单个核细胞在HGFs的作用下,在体外半固体琼脂上形成由不同成熟阶段的粒细胞和单核细胞组成的细胞集落.刺激CFU-GM生长的造血生长因子主要有:GM-CSF,IL-3,G-CSF,M-CSF及SCF等.
[临床应用]
①CFU-GM减少 常见于再生障碍性贫血,阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH),急性白血病,慢粒急变期,红白血病,骨髓纤维化及骨髓增生异常综合征.
②CFU-GM增加 慢性粒细胞白血病(CML),真性红细胞增多症(部分患者伴白细胞增多)及部分缺铁性贫血患者.
2)红系祖细胞的培养
[原理] CFU-E集落为由8-50个细胞组成的细胞团.BFU-E集落为50个以上细胞组成的细胞团,形似烟火礼花,故称BFU-E.在培养体系中选择甲基纤维素作为支持物,加入适量EPO和BPA,使骨髓中红细胞系造血细胞形成BFU-E和CFU-E.每个集落可视为由一个红系祖细胞增殖分化而来,所以集落数的多少可反映培养物中红系祖细胞的量.CFU-E与BFU-E对EPO和BPA的敏感性及集落细胞多少的不同,培养时间和培养方法也有所不同.
[临床应用]
①BFU-E或CFU-E减少 见于再生障碍性贫血,单纯红细胞性再障(PRCA),急性白血病(AML和ALL更明显),慢粒急变,红白血病及铁粒幼细胞性贫血(SA)等.
②BFU-E或CFU-E增加 见于真性红细胞增多症,原发性骨髓纤维化(PMF)及部分慢粒患者.
3)巨核系祖细胞培养
[原理] 以血浆凝块或甲基纤维素为支持物,加入再生障碍性贫血患者血清或TPO,IL-3及SCF等生长因子,使骨髓中巨核系祖细胞形成CFU-MK.
[临床应用]
①CFU-MK减少 常见于再生障碍性贫血,获得性无巨核细胞性血小板减少性紫癜,骨髓增生性疾病,血小板减少症和白血病等.
②CFU-MK增加 常见于慢性粒细胞白血病,在慢粒急变时仍有较高的CFU-MK.
4)混合祖细胞培养
[原理] 以甲基纤维素作为支持物,配以各种造血生长因子如IL-3,GM-CSF和EPO或PHA-LCM加EPO作为CFU-MIX刺激因子,体外受检者骨髓造血细胞可形成含有红,粒,单核及巨核细胞系的混合集落(CFU-MIX或CFU-GEMM).
[临床应用] CFU-GEMM有助于调节多向祖细胞分化与增殖的各种刺激因子的生物活性的定量研究.CFU-GEMM产率较低,临床疾病研究还较少,一般再生障碍性贫血CFU-GEMM减少,慢性粒细胞性白血病时其增殖率增高.
7.血细胞染色体检验
(1)非显带染色体和显带染色体相关概念和技术
1)非显带染色体技术
①直接法
抗凝骨髓标本不经培养,以PBS稀释后加入秋水仙素\"阻留\"中期细胞,经低渗液处理后,再经预固定,固定后即可制片,染色,镜检.秋水仙素能干扰有丝分裂纺锤体形成,使细胞\"阻留\"在分裂中期,增加中期细胞数目.低渗处理则使染色体分散,铺展开来,便于分析.
②短期培养法
抗凝骨髓标本在含小牛血清的培养液中于37℃培养24h或48h左右,加入秋水仙素\"阻留\"中期细胞.其他同直接法.
③非显带染色体的识别和命名
中期染色体的形态:每条染色体上有一收缩成极小的部分,称为着丝粒,该处为染色体的缩窄处,又称为主缢痕(primary constriction).着丝粒在染色体上的位置各不相同,可将染色体分为二部分,染色体的短臂(short arm)用p表示;染色体的长臂(long arm)用q表示.在染色体上也可看到其他的收缩凹陷处,称为次级缢痕(secondary constriction).有些染色体的一端还可有球形小体,称随体(satellite),多见于近端着丝粒染色体.每条染色体的短臂和长臂末端称为端粒(telomere).根据着丝粒位置的不同,可将染色体分成三种:中着丝粒染色体(metacentric chromosome),亚中着丝粒染色体(submetacentric chromosome)和近端着丝粒染色体(acrocentric chromosome).
人类46条染色体可分为7组:A组,1-3号染色体,为大型中着丝粒染色体;B组,4,5号染色体,为大型亚中着丝粒染色体;C组:6-12号和x染色体,为中型亚中着丝粒染色体 ;D组,13-15号染色体,为中型近端着丝粒染色体;E组,16-18号染色体,为中型亚中着丝粒染色体;F组,19,20号染色体,为小型中着丝粒染色体;G组,21,22号和Y染色体,为小型近端着丝粒染色体.
将人体细胞秋水仙素中期染色体经显微摄像后,按以上分组排列成一套染色体图像,称为核型分析(karyotyping).这一套染色体图像就称为核型(karyotype)
2)显带染色体技术
①G显带
标本先经某种处理,再以姬姆萨染色后使染色体显带的方法.G显带的机制较复杂,一种观点认为,DNA上富含A-T碱基对的DNA和组蛋白结合紧密,胰酶处理时不易高度抽提,和染料亲和力较强,呈深带;而富含G-C碱基对的区段结合的蛋白质容易被胰酶抽提,和染料亲和力降低,呈浅带.
②R显带
R带带纹与G带,Q带正好相反,即前者的阳性带相当于后者的阴性带,而前者的阴性带则相当于后者的阳性带.R带按制备方法不同可分为荧光R带和姬姆萨R带两种类型.其显带机制尚未完全明了,可能由于DNA受热变性,使富含A-T碱基对的区段单链化,故不易为姬姆萨染色,呈浅带;而富含G-C碱基对的区段仍保持正常的双链结构,易于染色,故显深带.
③染色体同步化及高分辨染色体技术
中期染色体常规显带方法在一套单倍体仅能显示322条带,分裂中期的早,中阶段染色体较长,而晚中期以后的染色体较短小.为了获得较长而带纹更加丰富的染色体,采用某些药物如氨甲碟吟(MTX)等阻断DNA的合成达一定时间,细胞高度阻滞在细胞周期的同一位置,当阻断作用解除后各细胞的DNA合成重新同步进行,细胞即处于同一分裂周期,可获得分裂较早期的细胞.在上述同步化基础上,使用某些抑制剂抑制染色体的收缩,可使染色体长度增加20%左右,显带后可达到400-800条带,即所谓高分辨染色体显带.
(2)常见染色体数目和结构异常的有关概念和表示方法
1)染色体数目异常
染色体数目异常的主要原因是由于减数分裂或有丝分裂时染色体不分离(non-disjunction).常见的有整倍体,非整倍体,嵌合体三种.
①整倍体
如果所有的同源染色体在生殖细胞成熟分裂时全部归于—个细胞,那么这个生殖细胞的染色体数目仍然是二倍体.此生殖细胞和正常的生殖细胞结合就会形成三倍体(triploid).如果两个这种生殖细胞结合就会形成四倍体(tetraploid).这些均属整倍体(euploid).
②非整倍体
如果生殖细胞在成熟分裂时仅仅有个别染色体发生不分离,结果造成受精卵中染色体的数目不是染色单体的倍数,则称为非整倍体.因个别染色体增加而染色体总数超过二倍体者,称为超二倍体(hyperdiploid);少于二倍体者,称为低二倍体(hypoidploid).如果染色体数目仍然是二倍体,但不是23对,而是个别染色体增加合并,个别染色体缺失,则称为假二倍(pseudodiploid).
③嵌合体
如果染色体不分离现象发生在受精卵卵裂过程及胚胎发育早期的细胞分裂过程中,则此胚胎的部分细胞发生染色体数目异常,一个个体具有几个不同核型的细胞系,称为嵌合体.嵌合体的临床表型一般比较轻.
2)染色体结构异常
①缺失(deletion)
指染色体臂的部分丢失,用del表示.
②重复(duplicatlon)
指同源染色体中—条断裂后,其断片连接到另一条同源染色体的相对应部位或由同源染色体间的不等交换,使一条同源染色体上部分基因发生重复,而另一条同源染色体相应缺失,一般用dup表示.
③倒位(inversion)
指染色体中的某一片段断裂下来,颠倒1800后重新连接,造成原来基因顺序的颠倒.倒位用inv表示.
④易位(translocatiol)
指染色体的节段位置发生改变,即一条染色体断裂后,其片段接到同一条染色体的另一处或接到另—条染色体上去.易位用t(A;B)的形式表示,A,B分别表示发生易位的两条不同染色体.
易位分相互易位(reciprocal translocation)和非相互易位(nonreciprocal translocation)两种.相互易位指发生易位的两条染色体都发生断裂,断片相互交换.非相互易位指仅一条染色体发生断裂,断片插入到另一条染色体中或接在另一条染色体的末端.
凡是易位后主要的遗传物质没有丢失,个体表型正常的,称为平衡易位(balanced lranslocation).而易位后丢失了部分遗传物质,造成个体表型异常的,称为不平衡易位(unbalanced translocation).
(3)染色体分析在临床血液学中的应用
1)在白血病中的应用
①在白血病诊断和分型中的应用
在多种白血病和其它血液系统疾病中可发现特异性的和非特异性的染色体异常.染色体异常的检出对血液系统疾病的诊断,鉴别诊断等显示越来越重要的作用.如CML患者中费城(Ph)染色体发生率可达90%以上,成为慢性粒细胞白血病的细胞遗传学标志.该染色体异常是9号染色体长臂3区4带(9q34)和22染色体长臂1区1带(22q11)相互易位所致,对CML 的诊断具有重要意义.50%-80%的急性髓细胞白血病(AML)中可发现克隆性染色体异常.由于特异性染色体异常对疾病诊断有标志和分类的意义,故被MIC协作组列为急性白血病MIC(形态学,免疫学和细胞遗传学)分型的主要指标之一.
②在白血病预后判断,指导治疗中的作用
AML中具有t(15;17),inv(16),t(8;21)异常的病人对治疗反应良好,缓解期较长,而具有-5,-7,+8及t(9;22)的AML病人则预后较差.在ALL中,染色体数超过50的超二倍体者对治疗的反应良好,而t(9;22),t(4;11)及:t(8;14)者则预后很差,生存期多小于1年.
慢性粒细胞白血病(CML)患者出现双倍Ph,+8,i17q等新的异常克隆时,往往预示着急变,核型异常对慢性淋巴细胞白血病(CLL)的预后判断具有重要意义.
③鉴别白血病微小残留病灶
微量残留白血病(minimal residual leukemia,MRL)是指白血病经化疗或骨髓移植后达到完全缓解,而体内残存微量白血病细胞的状态,估计此时仍有106-108个白血病细胞存在,但用形态学方法已难以检出.这些残留的白血病细胞是复发的根源,是导致白血病患者不能长期生存的重要因素.当临床及形态学还没有复发的证据时,检测到原已消失的克隆性染色体异常和(或)新的克隆性染色体异常时,往往预示疾病将复发.
2)在骨髓增生异常综合征中的应用
染色体异常可见于40%-80%的MDS,常表现为染色体的丢失,缺失,亦可见染色体增加和结构异常如-7,-17,-Y,5q-,7q-以及+8,+ll和t(3;3)(q21;q26),t(5;17)(q32;q12)等.在MDS与再障,阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)等疾病的鉴别中染色体分析技术有十分重要作用.染色体分析也有利于判断MDS的转归及预后.
3)在淋巴瘤中的应用
核型异常同恶性淋巴瘤亚型相关.如大多数Burkitt淋巴瘤具有t(8;14),少数为t(2;8)和t(8;22).核型异常对淋巴瘤的预后判断价值也是明确的,如约85%的滤泡性(follicular)淋巴瘤具有t(14;18),或单独存在或与其他异常一起存在,前者预后良好而后者预后差.
4)在其他血液病中的应用
约40%的PV有克隆性染色体异常,常见的染色体异常有del(2v)(q11),+8和+9,可见于PV病程的始末,存在克隆性染色体异常,应列为PV的主要诊断条件之一.染色体核型分析为PV诊断和鉴别诊断提供了有力的证据.
原发性骨髓纤维化染色体异常核型检出率约为30%,最常见的染色体异常为-7,-9,+8,+2或lq,13q等结构异常.由于许多情况可伴继发性骨髓纤维化,而单纯骨髓和外周血检查又难以确诊,须依靠排除性诊断.核型分析有助于原发性骨髓纤维化的诊断和鉴别诊断.
5)在骨髓移植中的应用
染色体检查是验证骨髓移植是否成功的常用方法.在供,受者性别不合时,如男性受者接受了女性骨髓,移植后造血细胞中Y染色体消失,或女性受者接受了男性骨髓,造血细胞中出现了Y染色体,均表示完全的植入.染色体的转换常发生于移植后1个月内.
如受,供者性别相同,则可用常染色体多态性标志进行鉴别.如移植前具有随体的受者移植后随体消失或移植前不具有随体的受者移植后出现了随体,均表示植入成功.具有核型异常的白血病受者移植后原有的异常核型为正常核型所代替,也可证明移植成功.
8.分子生物学检查
血液分子生物学检验技术主要包括PCR技术,DNA测序技术,限制性片段长度多态性(RFLP),转基因技术及基因芯片(DNA-chip)技术等分子生物学技术.目前这些技术已应用于血液病基因分析,基因诊断,白血病分型,指导治疗,判断预后和微小残留病检测等方面.
(1)核酸分子杂交技术原理和方法
1)Southern印迹杂交
2)Northern印迹杂交
3)核酸原位杂交
(2)聚合酶链反应原理和常用PCR产物检查方法
聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术于1985年由美国Mullis等建立.PCR技术使体外扩增核酸片段成为可能,使人们能够在几小时内从试管中获得大量特异核酸片段.由于核酸是生物体储存和传递遗传信息的载体,因此能够迅速获得大量特异核酸片段的PCR技术给生命科学各个领域的研究手段带来了革命性的变化.该技术已经与DNA克隆,DNA重组和DNA测序等技术一样成为血液分子生物学一项不可缺少的工具.
1)PCR产物检测
①琼脂糖凝胶电泳
②Southern印迹杂交
③斑点杂交法
④PCR-ELISA法
⑤原位杂交法
(3)以PCR为基础的相关技术
近年来PCR技术在应用的过程中得到了进一步的发展.目前已出现多种以PCR为基础的PCR相关技术,形成了适用于不同目的的PCR技术系列,以下是几种在血液学及检验领域应用较多的PCR相关技术.
1)逆转录PCR
逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)是以细胞内总RNA或mRNA为材料进行的体外扩增技术.由于耐热的DNA聚合酶不能以RNA或mRNA作为模板,因此必须先将总RNA或mRNA作逆转录,生成与之互补的cDNA,然后再以cDNA作为模板进行PCR扩增,得到所需要的目的基因片段.RT-PCR常用于克隆cDNA,合成cDNA探针以及分析基因表达等.
2)定量PCR
最初的PCR技术只是用于定性检测DNA或RNA,对PCR产物的数量并不重视.随着科学研究的逐步深入,人们开始考虑用PCR技术来进行DNA或RNA的定量检测,随之出现了定量PCR(quantitative PCR,Q-PCR)技术这一新名词.目前常用的Q-PCR技术可分为终点法和实时法.
3)多重PCR
多重PCR(multiplex PCR)即在同一反应体系中加入多对引物,以同时扩增一份DNA样品中多个不同序列的靶片段.多对引物间的组合必须满足二个条件,一是将反应条件较为接近的引物组合在一起,以使该反应条件能尽量适合所有被扩增片段,二是同一反应内各扩增片段的大小应不同,以便检测时能通过电泳将各片段分离开.多重PCR比较适用于被检测基因较大,突变点较多的基因.
4)差异显示PCR
差异显示PCR(differential display PCR,DD-PCR)是一种以逆转录PCR为基础的研究基因表达差异的技术.基因在不同组织细胞中的表达不同,在细胞的不同发育阶段和状态中的表达也有差异.研究基因表达谱的变化有助于理解细胞分化,增殖,细胞周期的调节和细胞衰老,凋亡的过程.
5)原位PCR
原位PCR(in situ PCR)是指组织固定处理细胞内的DNA或RNA,并以其作为靶序列进行PCR反应的过程.原位PCR与普通PCR的主要区别在于模板的制备.经脱蜡处理的组织切片或细胞悬液均可作为扩增样品,所有反应在载玻片上进行.原位PCR技术不仅不需要从组织细胞中分离模板DNA或RNA,而且能在细胞原位进行PCR扩增,大大地提高了检测的灵敏度.目前,原位PCR已成为研究靶基因序列的细胞定位,组织分布和基因表达检测的重要手段.
(4)基因芯片技术
基因芯片技术又称DNA微阵列(DNA - chip).该技术是二十一世纪生命科学领域广泛应用的一项高效快速的分子生物学技术.DNA-chip是将大量以特定排列方式的基因探针或基因片段固定于硅片,玻片和塑料片上,样品DNA或RNA通过PCR扩增,体外转录等技术掺入荧光标记分子,与微阵列杂交后再通过荧光扫描仪及计算机分析,即可获得样品大量基因序列及表达信息.目前,基因芯片技术主要应用于白血病的免疫分型,细胞的基因表达检测,基因异常检测及单核苷酸多态分析等.
(5)分子生物学检查在血液学中的应用
1)恶性血液病融合基因的检测
白血病染色体相互易位是导致染色体重排的最常见原因.染色体重排在分子水平上常形成融合基因.重组产生的融合基因及其融合蛋白是疾病的特异性分子标志.融合基因检测对疾病的诊断,分型,治疗方案的选择,预后判断及微小残留病的检测都有重要的意义.
慢性粒细胞白血病(CML)Ph 染色体易位的后果是使位于9q34上的ABL原癌基因易位至22q11的BCR基因上,形成BCR-ABL融合基因,表达一个具有高酪氨酸激酶活性的BCR-ABL融合蛋白,后者是CML发病的分子基础.
急性早幼粒细胞白血病(APL)特异性染色体易位是t(15;17)(q22;q21),易位的结果使15号染色体的PML原癌基因与17号染色体上的维甲酸受体a(RARa)基因融合产生PML-RARa融合基因.临床上变异型APL(M3v,M3b)与急性粒细胞白血病部分分化型(M2)较难鉴别,M2的t(8;21)可产生一种融合基因AML1-ETO,这种融合基因在M2中的发生率为20%-40%,在M2b中可达90%,通过融合基因的检测可准确鉴别这两种白血病.融合基因的检测对治疗方案的选择有明确的指导作用,在ATRA和化疗达完全缓解(CR)的M3,PML-RARa融合基因阳性者极易在十个月内复发,而融合基因阴性者,复发率低.
2)免疫球蛋白重链(IgH)基因和T细胞受体(TCR)基因重排的检测 IgH和TCR的编码基因具有多态性.IgH基因重排是产生个体多样性和独特性的主要原因.由于白血病细胞源于造血干细胞,所以白血病细胞是单克隆性的.用PCR方法对重排基因进行扩增,正常白细胞的扩增产物大小不等,呈模糊的阶梯状,而白血病细胞扩增产物经电泳后条带是单一的.约80%的B淋巴细胞白血病可检测到IgH基因重排.通过PCR方法检测IgH和TCR基因重排,有助于急性淋巴细胞白血病的分型以及微量残留的检测.
3)遗传性血液病的诊断 血红蛋白病是常见的遗传性溶血性疾病,血友病是常见的遗传性出血性疾病.基因缺陷包括基因缺失,点突变,插入,倒位等.对于基因重排,可通过RT-PCR进行检测;对于点突变则可用PCR结合酶切位点分析,即当点突变使某一酶切位点消失或在某一区域出现新的酶切位点时,可用该酶切点两侧的引物进行扩增,然后将扩增产物用适当的内切酶切割,根据电泳图谱来判断有无内切酶切点的改变.对于与限制性内切酶点无连锁的点突变,则可采用PCR结合特异寡核苷酸探针(ASO)斑点杂交法进行诊断.
4)HLA基因多态性检测 采用PCR扩增产物的反相杂交(斑点杂交)进行HLA基因多态性检测十分简便,有效.将每个位点的所有寡核苷酸探针固定在固相支持物上,引物先经生物素化后,进行待测DNA的基因扩增,从而得到生物素化的DNA放大产物.用此产物与膜上的探针杂交,然后进行显色或化学发光.这样每个样本只需杂交一次即可完成.此方法适合骨髓移植的HLA基因配型及HLA基因与疾病相关性分析等.
5)肿瘤细胞多药耐药基因的检测 多药耐药性(multidrug resistance, MDR)是指肿瘤细胞接触了一种药物以后,不但对该药产生耐药性,而且对其他结构的作用机制不同的药物也产生耐药性.研究发现,MDR的出现常与多药耐药基因(MDR1)过度表达有关,目前已建立Northern印迹法,斑点和狭缝印迹法,RT-PCR法及原位杂交法,从mRNA水平对患者进行测定,了解肿瘤细胞的耐药特性.有研究表明,急性髓细胞白血病MDR1的表达与预后有密切相关,即MDR1阳性者CR率低,生存期短,且易早期复发.
6)基因治疗 基因治疗的目的是应用DNA重组技术和基因转移技术,把野生型的基因导入患者体细胞内,成为正常的基因产物,来补偿缺陷基因的功能,从而使疾病得到纠正.目前认为基因治疗的靶细胞是造血干细胞或间质干细胞等.常用的载体是逆转录病毒和腺病毒.采用含人因子Ⅸ基因逆转录病毒载体转染血友病B患者的原代皮肤成纤维细胞,使其表达一定浓度的因子Ⅸ,这将为血友病B治疗提供新的方法.
第三章 红细胞系统
1.红细胞系统形态
(1)红细胞的生成
正常人红细胞的生成包括:造血干细胞阶段,红系祖细胞阶段,红系前体细胞(原红细胞至晚幼红细胞)的增殖与分化阶段,网织红细胞的增殖及成熟过程,以及网织红细胞向外周血释放成熟红细胞的过程.
1)造血干细胞阶段
① 数量及部位:造血干细胞主要存在于骨髓,脾,肝等造血组织内.也有少量循环于外周血中.
② 细胞特点:99.5%以上的干细胞是处于G0静止期.造血干细胞具有不断地进行自我更新,维持在体内一定的数量和保持自己的特性,同时又具有向骨髓红系,粒系和巨核系祖细胞分化的能力,在体内呈不对称分布.
③ 影响其分化的因素:细胞与骨髓微环境;细胞表面;药物受体;环化酶系统;体液等多种因素的控制和调节;造血干细胞的内在基因控制也起一定的作用.
2)红系祖细胞阶段
① 细胞特征:该阶段是处于造血干细胞与红系前体细胞之间的细胞群;是调节红细胞生成自体稳定机制中的一个关键过程,早期祖细胞自我更新和自我维持的能力立即下降,晚期祖细胞完全进行对称性有丝分裂,完全丧失了自我更新的能力.
② 影响造血干细胞向红系祖细胞分化的因素:骨髓造血微环境(微血管系统,神经系统,造血间质细胞等),通过体液因子,细胞因子对造血干细胞的分化起特殊的作用和影响.
③ 红系祖细胞的分化特点:是随机的系限过程.造血祖细胞只向红系细胞发育.骨髓微环境起着决定性的作用,如造血组织氧分压增高,基质中的黏多糖变为中性,均有利于红系细胞的分化.
④ 分类: a)EPO反应细胞(erythropoietin reaction cell,ERC)或EPO敏感细胞(erythropoietin sensitive cell,ESC):指可在EPO的作用下向红系前体细胞的方向分化,增殖,最后成为成熟红细胞的这类细胞,无自我维持能力,是非均一的放大过渡细胞群;b)BFU-E:ERC或ESC细胞在高浓度的EPO条件下,当培养延续到14～16天,培养体系中会骤然生成由30000～40000个红系细胞组成的红系集落,称为红系爆式形成单位(burst forming unit-erthroid,BFU-E),可分化为红系集落形成单位(colony forming unit-cnhroid,CFU-E),数量为5～10/L×l05有核细胞,周围血中,量极少,仅占0.02%～0.05%;c)CFU-E:ERC或ESC在加入EPO的体外半固体培养环境中培养5～8天,可生成由8～65个红系细胞组成的细胞团,称为CFU-E.其形态学表现为核染色质细致,核大,有大核仁,有清楚的核周带及少量的嗜碱性胞浆.数量为50～400/L×105有核细胞,大部分处于活跃的DNA合成期,细胞表面带有较密的EPO受体,且依赖EPO存活.表达可识别红系特征的蛋白,包括唾液酸糖蛋白,血型糖蛋白A和Rh抗原,血型抗原等.转铁蛋白受体(TfR)此时表达最高.
3)红系前体细胞阶段
① 形态学特征:包括原始红细胞,早幼红细胞,中幼红细胞,晚幼红细胞,网织红细胞,红细胞.
② 代谢特点:细胞成熟过程中随着血红蛋白的增加,细胞核活性逐渐衰减,血红蛋白含量不断增加,RNA的含量不断减少;在中幼红细胞后期,细胞中血红蛋白含量≥13.5pg;晚幼红细胞已失去继续分裂的能力,以后细胞核浓缩并逸出,被单核吞噬细胞吞噬,或在脾脏内碎裂,溶解,成为无细胞核的网织红细胞;在成熟阶段不在合成血红蛋白.
③ 影响因素:红细胞成熟过程分裂的次数,细胞最终的大小与血红蛋白合成的快慢有一定的关系,如缺铁时的小红细胞是因为血红蛋白的合成速度慢,需要较长的时间才能达到需要的血红蛋白浓度,故在细胞核停止活动(或聚缩)之前分裂的次数多,造成细胞体积小;而在大细胞时过早地使细胞核变性,分裂的次数也减少.
④ 增殖时间:原始红细胞的增殖时间约为20小时,早幼红细胞约为16小时,中幼红细胞为25～30小时,晚幼红细胞不具备合成DNA的能力,属非增殖性细胞.故正常红系前体细胞由骨髓生成,经过增殖,分化直到新生网织红细胞从骨髓中逸出约需3～5天.在贫血应激时,采用跳跃式分裂,此段时间仅可为2天.网织红细胞以后又在脾内停留1～2天,继续成熟且改变膜脂质成分后再进入血循环.
4)红细胞的脱核与释放
① 红细胞的脱核: 晚红细胞通过增加本身的波状运动,再经过几次收缩,把核挤到胞浆的一端而后脱出.
② 红细胞的释放:红细胞进入血窦时,易变形的胞浆先进入,把细胞核留在血窦处,红细胞进入血窦后,内皮细胞即收缩而使血窦孔闭合.
③ 网织红细胞成熟度:可根据网状物含量分为Ⅰ～Ⅳ级,正常时仅Ⅲ及Ⅳ级见于外周血中.
(2)红细胞形态
1)正常红细胞形态
① 原始红细胞:
胞体:直径15～20 m,圆形或椭圆形,边缘常呈钝角状或瘤状突起,胞核:圆形,居中或稍偏于一旁,约占细胞直径的4/5.染色质呈颗粒状比原始粒细胞粗密,核膜明显.核仁1～2个,大小不一,染浅蓝色.胞浆:量少,深蓝色,不透明,有油画蓝感,在核周围常形成透明区.
② 早幼红细胞:
胞体:直径10～18 m,圆形或椭圆形.胞核:圆形或椭圆,占细胞2/3以上,居中或稍偏位.染色质可浓集或粗密的小块,较原红粗糙些.核仁模糊或消失.胞浆量多,呈不透明蓝色或深蓝色,仍可见瘤状突起及核周淡染区.
③ 中幼红细胞:
胞体:直径8～15 m,圆形.胞核:圆形或椭圆,约占细胞大小的1/2,核染色质紧密,浓集成块,排列成呈车轮状,其中有明显空隙宛如打碎的墨砚感,核仁完全消失.胞浆:浆内血红蛋白形成逐渐增多,嗜碱性物质逐渐减少.因含不等量血红蛋白,可呈不同程度嗜多色性.
④ 晚幼红细胞:
胞体:直径8～15 m,圆形.胞核:圆形或椭圆,占细胞1/2以下,核染色质固缩密集,呈紫黑色团块状,有时可见核碎裂,核溶解或核旁碎片,此为不正常分裂的表现.胞浆:量较多,不规则,颜色因含多量血红蛋白,几乎和成熟红细胞相同呈粉红色或略带蓝色.
⑤ 网织红细胞:
为有核红细胞刚刚失去核的阶段,仍属尚未完全成熟红细胞,浆内尚有嗜碱性物质.在正常血液内占0.5～1.5%,直径8～9μm.用煌焦油蓝作活体染色时,可在红细胞内看见蓝色网状,线状或颗粒状网织结构.此种结构越多,常表示细胞越不成熟.根据网织红细胞的发育阶段可分为以下四型.I型:嗜碱性物质位于红细胞中央,如同致密的线团状,此型多存在于正常骨髓中.Ⅱ型:红细胞中央的线团状结构开始松散,此型也多存于骨髓中.Ⅲ型:网状结构开始松散.呈不规则的枝点状散在于红细胞浆内,末梢血内可见到.Ⅳ型:红细胞浆内的嗜碱性物质进一步减少,呈单独的点状或短丝状.正常人血液中的网织红细胞多为此型.
⑥ 红细胞:
正常红细胞平均直径7.2μm,形态呈双面微凹之园盘状,中央较薄,边缘较厚,染色后呈淡红色略带紫色,中央部分较淡染,无核.
2)异常红细胞形态
① 红细胞大小不均:
正常红细胞大小较为一致,直径6～9μm,平均直径7.5μm.凡直径大于9μm者称为大红细胞,大于12μm者称巨大红细胞;大于16μm者称为超巨红细胞;小于6μm者称为小红细胞,在缺铁性贫血时,小红细胞多见;在缺乏维生素B12及叶酸所致的巨幼红细胞型贫血时,大红细胞,巨红细胞常见,后者且可有严重的红细胞大小不均,各红细胞之间的直径可相关节2～3倍或更多.
② 红细胞形态不整:
a.靶形红细胞:红细胞中央色深,外周呈苍白圈,在近红细胞边缘处又较深.宛如射击之靶,故名靶形细胞,见于各种低色素性贫血,而珠蛋白生成障碍性贫血时尤易见到.
b.镰状红细胞(drepanocyte):这种红细胞两端尖锐,长而狭,形如镰刀样,见于镰刀状红细胞型贫血.
c.球形红细胞:此种红细胞直径缩短(2.6μm),细胞中心区的血红蛋白比周围多,呈小球形状,故名球形红细胞.常见于遗传球形红细胞增多症,自身免疫性溶血性贫血.
d.裂红细胞(schizocyte):系红细胞之碎片,外形不规则,有的可呈半圆盘状,有2至3个尖角或呈盔形,称盔形红细胞(helmet cell).多见于弥散性血管内凝血,微血乏病性溶血性贫血,癌转移等.
e.椭圆形红细胞(elliptocyte):呈椭圆形,横径缩短,长径增大,横径/长径<0.78.正常人椭圆形红细胞也可高达15%.这种红细胞多见于遗传性椭圆形红细胞增多症,一般要高于25～50%,才有诊断价值.在巨幼红细胞性贫血可达25%,恶性血贫及严重缺铁性贫血,珠蛋白生成障碍性贫血及镰刀形贫血也可见到此细胞.
f.棘形红细胞(acanthocyte):红细胞这缘有较大突起,其间距不规则,长度与宽度不一.这种红细胞见于肝病,血浆β脂蛋白缺乏症或制片不及时,正常红细胞也会变成棘细胞.
g.口形红细胞:红细胞中央苍白区呈扁平口形,这种细胞正常人5%.
h.嗜多色性红细胞(polychromatic):如整个红细胞或其一部分呈灰蓝色则称为嗜多色性红细胞,它属于尚未完全成熟的红细胞,故细胞体积多较大,其蓝色嗜碱性物质为胞浆中的核糖体,它随着细胞完全成熟而消失,嗜多色性红细胞增多说明其骨髓造血功能活跃.在各种增生性贫血时均见增多,以溶血性贫血时更为多见.
i.嗜碱性点彩红细胞(basophilic stippling cell):乃指在瑞氏染色条件下,红细胞浆中存在着嗜碱性黑蓝颗粒而言,其颗粒较粗大,也可很细小,多少不一,其胞浆多具有某些嗜多性色调,此种细胞属于未完全成熟的红细胞.在正常人血片中极少见,约占0.01%.此种细胞出现表示再生加速并有紊乱的现象.有人认为它是由于在铅,铋,锌,汞中毒时红细胞膜被金属损伤后,其胞浆中的核糖体发生聚集变性后着色所致.铅中毒病人此种细胞明显增多,为诊断的重要指标之一.
j.豪-周小体(Howell-Jolly\'s小体):呈圆形,大小约1～2μm,紫红色,位于成熟红细胞或有核红细胞的胞浆中,可一个或多个,此种物质可能是细胞在分裂过程中出现的一种异常染色质,也可能是核碎裂或核溶解后所剩下之残核部分.见于溶血性贫血,恶性肿瘤,恶性贫血,脾切除后,严重贫血,新生儿,白血病等.
k.卡波环(Cabot\'s ring):为一细的线状环,呈圆环或\"8\"字形,染紫红色,存在于嗜多色性或碱性点彩红细胞之中,此种物质可能是纺锤体的痕迹,也可能是胞浆中脂蛋白变性所致.此种结构常与Howell-Jolly\'s小体同时存在,见于铅中毒,巨幼红细胞性贫血等.
(3)红细胞生成调节
1)EPO
① 生成机制:当外周血中红细胞数量减少和血红蛋白浓度降低时,红细胞携氧能力下降.血液和组织内氧张力减低,可刺激肾脏产生和释放EPO,促进骨髓内红细胞的生成;其他因素,有动脉血氧分压,心肺功能,血容量,血红蛋白与氧的亲和力以及红细胞2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)含量等.都可能通过肾脏内的EPO释放,对红细胞的生成产生反馈作用.
② 主要作用于红系祖细胞阶段.随着EPO使用剂量的加大.其作用可能会进一步扩及红系生成的全过程,成为影响红系细胞中血红蛋白合成的诱导物质和调节物质,并能促进DNA和RNA的合成.
③ 作用可归结为:刺激有丝分裂,促进红系祖细胞的增殖;激活红系特异基因,诱导分化;能显著减缓CFU—E DNA的降解速率,阻抑CFU-E的程序性死亡(凋亡),以及加速网织红细胞的释放和提高红细胞膜的抗氧化功能.
2)其他红细胞生成的调节物质
① 其他细胞因子:红系分化因子(EDF)能直接诱导血红蛋白表达及间接地促进红系祖细胞生长;红系分化去核因子(EDDF)诱导后期红细胞排核及转录;因子GATAl能激活多种红系特异基因,诱导细胞沿红系分化,并抑制细胞凋亡.
② 雄激素:主要是刺激EPO的产生并可能增加EPO敏感细胞数目及驱使G0期的CFU-S进入DNA合成期,增加红系祖细胞数量;也可直接刺激骨髓促进红细胞的生成.
③ 雌激素:可能抑制红细胞的生成.小剂量雌激素可减低红系祖细胞对EPO的反应,大剂量时可能抑制EPO生成.
④ 其他:甲状腺素,肾上腺皮质激素及生长激素等均可改变组织对氧的要求而间接影响;环腺苷酸(cAMP)亦可刺激EPO的生成;胸腺及T淋巴细胞对正常造血也有调节作用.T淋巴细胞及其产物可促进BFU-E的形成与EPO共同调节红细胞生成;再障及尿毒症患者体内有红细胞抑制素;纯红再障患者血浆中存在抑制因子.
(4)红细胞破坏
1)破坏的部位:
① 主要在单核-吞噬细胞系统.首要器官是脾脏和肝脏.其次为骨髓及其他部位.
② 脾脏内葡萄糖浓度低,氧分压及pH值低,血流缓慢.正常红细胞通过脾小动脉进入白髓的边缘区而进入红髓,通过狭窄的脾索而被挤压进入脾窦,再经过脾窦(含有单核—吞噬细胞)的内皮细胞孔隙,直接进入脾静脉.某些部位的血管内径特别细小,细胞需要变形才能顺利地通过,如果衰老的或有损伤的红细胞易受机械性滤过作用,被阻留于脾脏内,更加重葡萄糖的消耗,造成pH低,缺氧的非生理性环境,促使红细胞的脆性增加,易被吞噬细胞吞噬.
③ 肝脏仅对畸变较明显的红细胞才有清除作用,通过脾脏的血容量为35%.
2.红细胞结构与功能
(1) 红细胞膜的组成
1)膜糖类:以糖蛋白或糖脂蛋白形势存在,有多种功能如受体反应,抗原性,信息传递等,包括葡萄糖,半乳糖,甘露糖等中性糖,氨基糖类包括氨基半乳糖.
2)膜脂质:有三种:①磷脂占60%,其特性为双性物质,在脂质双层形成中起主要作用;②胆固醇和中性脂肪酸占33%,在膜中起调节脂质物理状态的作用;③糖脂占7%,其功能包括红细胞膜抗原性,细胞表面的黏附,细胞间的相互作用.
3)膜蛋白:多与脂质或糖结合在一起,既有维持红细胞结构的作用,又有一定的生理功能,仅起结构作用的蛋白很少,包括骨架蛋白,跨膜蛋白.
4)膜酶:可分为两大类:一类位于膜上,胞浆内不存在,如核苷酸代谢酶类(腺苷酸环化酶等),糖代谢酶类,ATP酶(Na+,K+-ATP酶,Ca2+,Mg2+-ATP酶),蛋白激酶及乙酰胆碱脂酶等;另一类在膜与胞浆中均存在,如某些磷酸酶类(酸性磷酸酶,2,3-二磷酸甘油酸磷酸酶等),葡萄糖代谢酶类(3-磷酸甘油醛脱氢酶,乳酸脱氢酶等),谷光甘肽代谢酶类(谷光甘肽还原酶,谷光甘肽还原酶).
(2)红细胞膜的结构
1)膜的不对称性:膜脂双层的内外两层脂类分子分布的不均一及物理性质的不同,以及膜蛋白在膜内外两侧分布也是不对称性.
2)膜流动性:红细胞膜结构的基本特征,是指膜内部分子运动性,主要是脂质和蛋白质的运动.适当的流动性是膜正常功能必需的.
(3)红细胞膜的功能
1)物质运输:①阳离子运转;②阴离子转运;③水的运输;④葡萄糖运转.
2)红细胞膜的抗原性:①血型抗原;②老化抗原.
3)红细胞的变形性:影响因素有①膜骨架蛋白组分和功能状态;②膜脂质流动性大有利于变形;③细胞表面积与细胞体积比值.
4)红细胞的免疫功能:①清除免疫复合物(IC)的作用;②对淋巴细胞的调控作用;③对吞噬细胞的作用;④对补体活性调节.
(4)血红蛋白的结构与功能
1)血红素是氧结合的铺基,由铁原子和原卟啉Ⅸ组成.
2)血红蛋白分子由四个亚基组成;
3)血红素的可逆氧合作用;
4)Hb对一氧化碳的亲和作用.
3.红细胞检查
(1)红细胞一般检查
1)红细胞计数
2)血红蛋白测定
3)红细胞比积测定
4)红细胞平均容量,红细胞平均血红蛋白量,红细胞平均血红蛋白浓度
5)网织红细胞
(2)有关铁指标的测定
1)血清铁测定
[原理] 血清铁Fe3+形式与转铁蛋白(transferrin,Tf)结合存在,降低介质的pH及加入还原剂(如抗坏血酸,盐酸羟胺等) 使高铁(Fe3+)还原为F2+,则转铁蛋白对铁离子的亲和力降低而解离,解离出的二价铁离子(Fe2+)与显色剂(菲咯嗪和2,2′-联吡啶等)反应,生成有色络合物,同时作标准对照,计算出血清铁的含量.
[参考值] 成年男性11.6～31.3μmol/L,女性9.0～30.4μmol/L
[临床评价] 血清铁降低常见于生理性铁需要量增加,缺铁性贫血,急性感染,恶性肿瘤等.各种原因所引起的缺铁性贫血患者,血清铁含量均明显降低,故可用于鉴别缺铁与非缺铁性贫血的诊断.
血清铁增高常于急性肝炎,恶性贫血,再生障碍性贫血,溶血性贫血及巨幼细胞贫血等.
2)血清总铁结合力
3)血清铁蛋白测定
4)铁吸收率测定
5)血清转铁蛋白测定
[原理] 免疫散射比浊法;利用抗人转铁蛋白血清与待检测的转铁蛋白结合形成抗原抗体复合物,其光吸收和散射浊度增加,与标准曲线比较,可计算出转铁蛋白含量.目前还有放射免疫法和电泳免疫扩散法.
[参考值] 免疫散射比浊法:28.6%～51.9%
[临床评价]
增加:见于缺铁性贫血和妊娠.
降低:常见于肝硬化,肾病综合征,恶性肿瘤,炎症.
6)血清转铁蛋白受体测定(measurement of serum transferrin receptor)
[原理] 血清转铁蛋白受体测定一般采用酶联免疫双抗体夹心法.把对转铁蛋白受体特异的多克隆抗体包被在96孔板上,用标准品和未知样本与转铁蛋白受体的多克隆抗体进行反应,然后加入酶标记的对转铁蛋白受体具有特异性的多克隆抗体,使之与抗原抗体复合物进行反应,通过洗板去掉未与酶标记的多克隆抗体结合部分,再加入底物使之酶联复合物发生颜色反应.颜色的深浅与转铁蛋白受体的量成正比.
[参考值] 以不同浓度标准品的吸光度值在普通坐标纸上绘制标准曲线,通过标准曲线上查出未知标本的转铁蛋白受体水平.
[临床评价]
升高:常见于缺铁性贫血和溶血性贫血.
降低:见于再生障碍性贫血,慢性病贫血及肾功能衰竭等.
(3)叶酸和维生素B12的测定
1)血清和红细胞叶酸测定
2)血清维生素B12的测定(measurement of vitamin B12)
[原理] 放射免疫法,用抗氧化剂和氰化钾在碱性环境下(pH>12),将人血清中的维生素B12从载体蛋白中释放出来.加入57Co标记的维生素B12,与固定在微晶纤维颗粒上纯化的维生素B12结合物(纯化的猪内源内因子)竞争结合,检测其放射活性,其量与受检血清的维生素B12含量成反比,与标准管作对照,换算出维生素B12含量.
[参考值] 成人148～660pmol/L
[临床评价] 血维生素B12降低对巨幼细胞贫血诊断有重要价值;而白血病患者血清维生素B12明显升高;真性红细胞增多症,某些恶性肿瘤和肝细胞损伤时也可增加.
3)血清维生素B12吸收试验
[原理] 给受检者口服放射性核素57Co的维生素B120.5μg,2小时后肌注未标记的维生素B121mg,收集24小时尿测定57Co排出量.
[参考值] 正常人>7%
[临床评价] 巨幼细胞贫血<7%,恶性贫血290s
[临床评价] 遗传性球形红细胞增多症AGLT50明显缩短(25～150s).自身免疫性溶血性贫血,肾功能衰竭,妊娠等AGLT50也可缩短.
4) 高渗冷溶血试验(hyperosmotic cold hemolysis test)
5) 红细胞膜蛋白电泳分析
[原理] 将制备的红细胞膜样品进行SDS-PAGE电泳,根据样品中各蛋白相对分子质量的不同,分离得到红细胞膜蛋白的电泳图谱,从而可见各膜蛋白组分百分率.
[参考值] 各种膜蛋白组分百分率变化较大,多以正常红细胞膜蛋白电泳图谱作比较.或以带3蛋白为基准,各膜蛋白含量以与带3蛋白的比例表示.
[临床评价] 许多溶血性疾病常见红细胞膜蛋白异常.各种膜缺陷疾病如遗传性球形红细胞增多症有收缩蛋白等含量减低或结构异常.某些血红蛋白病骨架蛋白可明显异常.
(7)血红蛋白异常的检验
1)红细胞包涵体试验(Heinz-body forming test)
2) 血红蛋白电泳检测
[原理] 血红蛋白电泳(hemoglobin electrophoresis)是根据不同的血红蛋白带有不同的电荷,等电点不同,在一定的PH缓冲液中,缓冲液的PH大于Hb的等电点时其带负电荷,电泳时在电场中向阳性泳动;反之,Hb带正电荷向阴极泳动.经一定电压和时间的电泳,不同血红蛋白所带电荷不同,相对分子质量不同,其泳动方向和速度不同,可分离出各自的区带,同时对电泳出的各区带进行电泳扫描,可进行各种血红蛋白的定量分析.
[参考值] pH8.6 TEB缓冲液醋酸纤维膜电泳:正常血红蛋白电泳区带;HbA>95%,HbF<2%,HbA2为1%～3.1.pH8.6 TEB缓冲液适合于检出HbA,HbA2,HbS,HbC,但HbF不易与HbA分开,HbH与Hb Barts不能分开和显示,应在选择其他缓冲液进行电泳分离.
PH6.5 TEB缓冲液醋酸纤维膜电泳:主要用于HbH与Hb Barts的检出.HbH等电点为5.6,在pH6.5 TEB缓冲液中电泳时泳向阳极,Hb Barts则在点样点不动,而其余的血红蛋白都向阴极移动.
[临床评价] 通过与正常人的血红蛋白电泳图谱进行比较,可发现异常血红蛋白区带.如HbE,HbH,Hb Barts,HbS,HbD和HbC等异常血红蛋白.
HbA2增多,见于β珠蛋白生成障碍性贫血,为杂合子的重要实验室诊断指标.HbE病时也在HbA2区带位置处增加,但含量很大(在10%以上).HbA2轻度增加亦可见于肝病,肿瘤和某些白血病.
3)抗碱血红蛋白测定
[原理] 胎儿血红蛋白F(HbF)具有比HbA更强抗碱能力,将待检的溶血液与一定量的氢氧化钠混匀,作用1分钟后加入半饱和硫酸铵中止碱变性反应.HbF抗碱变性作用强,没有变性存在于上清夜中,HbA变性沉淀,取上清液于540nm处测定戏光度,检测出HbF的浓度.此试验也称为碱变性试验,其检测的是抗碱血红蛋白,除HbF外,Hb Barts和部分HbH也具有抗碱能力,需通过电泳鉴别.
[参考值] 成人<2%,新生儿90%,对葡萄球菌杀菌率 >85%.
[临床应用] 是判断中性粒细胞杀菌能力的一个指标.
7)白细胞趋化试验(滤膜渗入法)
[原理] 检测离体后中性粒细胞从滤膜的一侧潜过到达有趋化因子一侧的定向移动能力.
[参考值] 趋化指数 3.0～3.5
[临床应用] 趋化功能缺陷见于代谢性疾病(糖尿病,尿毒症),感染,白血病及各种皮炎.当趋化因子生成不足或其抑制因子过多也表现为趋化功能缺陷.
8)中性粒细胞黏附功能
[原理] 中性粒细胞有在体外黏附异物的性质,将肝素抗凝血通过尼龙纤维后,计数通过前,后的中性粒细胞数.
[参考值]
黏附率(%)=100- × 100
正常健康人黏附率约为 47%～83% .
[临床应用] 是判断中性粒细胞黏附能力的一个指标.
(2)粒细胞代谢及产物检验
1)性粒细胞碱性磷酸酶染色 见细胞化学染色章
2)过氧化物酶染色 见细胞化学染色章.
3)特异性酯酶染色 见细胞化学染色章.
4)嗜酸粒细胞阳离子蛋白测定(ECP测定)
[原理] ECP是嗜酸粒细胞特异性标志,可反映嗜酸粒细胞的活化程度.
[参考值] 免疫萤光法:正常儿童血清含量为4.26±2.34μg/L;哮喘儿童为18.24±8.88μg/L
[临床应用] 患者ECP水平与末梢血中嗜酸粒细胞数无关.ECP水平与疾病的严重程度密切相关,测定ECP对过敏性哮喘的诊断,监视及抗炎治疗等均有重要意义.
5)嗜碱粒细胞脱颗粒试验
[原理] 嗜碱粒细胞与过敏原混合一定时间后,产生脱颗粒作用使细胞不再被着色,染色的细胞数明显减少.
[参考值] 计数9个大方格内染成蓝色的嗜碱粒细胞数(F),计算脱颗粒指数(DI): 判断结果以DI > 30% 为阳性.
[临床应用] 是嗜碱粒细胞脱颗粒功能的常作试验.在过敏性疾病或骨髓增殖疾病时,嗜碱粒细胞颗粒释放能力增高.
6)白三烯测定(LTB4测定)
[原理] 中性粒细胞内磷脂中的花生四烯酸在脂氧化酶作用下加氧生成白三烯化合物(LTS),其后再经水解生成稳定的LTB4.
[参考值] LTB4( 46214±172.99)ng/107 中性分叶粒细胞 .
[临床应用] LTS具有很强的生物活性,参与体内多种生理生化代谢;并且与临床某些疾病的病理机制密切相关.
7)中性粒细胞质膜标志酶测定
质膜指中性粒细胞去除胞质中颗粒和细胞核后的完整膜,即为胞质体.质膜上的各种受体与标志酶与中性粒细胞的功能相关.
①酸性磷酸酶测定:
[原理] 酸性磷酸酶表达在中性粒细胞质膜内侧,在初级颗粒和核膜上也有表达.在酸性缓冲液中(pH4.8)中,该酶使对硝基苯磷酸(P-NPP)水解为黄色的对硝基苯酚和磷,对硝基苯酚在405nm处有吸收峰,吸光度与酶活性呈正相关.
酶活性计算:活性单位用对硝基苯酚的含量表示.
AU= PNP nmol/(min·mg) Protein
[临床应用] 多种癌症(子宫,胃,结肠和乳腺癌)患者中性粒细胞酸性磷酸酶活性明显增高.
②碱性磷酸酶测定:
[原理] 碱性磷酸酶表达在中性粒细胞质膜外侧.在碱性条件下(pH10)下,对硝基苯磷酸被该酶水解生成黄色的对硝基苯酚和磷,并在405nm处有吸收峰,吸光度与酶活性呈正相关.
酶活性计算:活性单位用对硝基苯酚的含量表示.
AU= PNP nmol/min/mg Protein
[临床应用] 碱性磷酸酶是一种反映中性粒细胞在循环中和脾中寿命的标志酶.在细菌感染性疾病时其活性增高;但慢性粒细胞性白血病患者中性粒细胞碱性磷酸酶缺失或活性低下.
③5\'- 核苷酸酶测定(5\'-NT)
[原理] 5\'- 核苷酸酶不仅是中性粒细胞的标志酶,也是淋巴细胞成熟的标志物.本法用金属离子Ni 抑制5\'-核苷酸酶的活性,从不抑制的样品中测出的吸光度(A)值减去Ni 抑制的样品的 A值,即可从无特异性的磷酸酶中得出5\'-核苷酸酶活性.
酶活性计算:用每分钟每mg蛋白催化ATP释放磷(Pi)的nmol数表示:Pi nmol/mg Pr/min .
[临床应用] 5\'- 核苷酸酶活性随着粒细胞的分化成熟而下降,其在原幼粒细胞膜上表达较多.
(3) 粒细胞动力学检查
1)氚标记脱氧胸苷测定
[原理] 在粒细胞培养中使其进入有丝分裂期,再加入 3H-TdR后可被粒细胞摄入参与其DNA合成,摄入的量与DNA合成的量及增殖细胞数成正比.
[参考值] SI 20×109/L .
[临床应用] 本方法可间接但准确地反映骨髓中粒细胞的储备功能.该试验对某些骨髓受损引起的轻度粒细胞减少有一定参考及诊断价值;反之,则反映储备不足.
3)肾上腺素激发试验
[原理] 注射肾上腺素后血管收缩,黏附于血管壁上的粒细胞脱落,从边缘池进入循环池,致外周血粒细胞数增高.
[参考值] 粒细胞上升值一般低于(1.5～2.0)×109/L .
[临床应用] 本试验可鉴别粒细胞减少症是否为\"假性\"减少,如果增高低于上述值,须进一步确定粒细胞减少原因.
4)二异丙酯氟磷酸盐标记检测
[原理] 利用含有放射性磷的二异丙酯氟磷酸盐(DF32P)作为胆碱酯酶的抑制剂,其能与粒细胞膜上的胆碱酯酶结合.采血制成标记物后,立刻静脉注射.经过一段时间再次采血,分离粒细胞, 观察其放射活性的变化,则可测知外周血中有关粒细胞的参数.
[参考值] 粒细胞总数的测定:
标记粒细胞半衰期(T1/2): 4～10小时;血中滞留时间:10～14小时.
全血粒细胞池(TBGP): (35～70)×107/kg
循环粒细胞池(,CGP): (20～30)×107/kg
边缘粒细胞池(MGP): (15～40)×107/kg
粒细胞周转率(GTR): (60～160)×107/(kg · d)
[临床应用] 本方法可在体外及体内标记粒细胞以观察骨髓中细胞增殖情况.
5)流式细胞仪检测DNA合成及含量
流式细胞仪(FCM)能够快速而准确地获得形态学,生物化学,免疫学等多种参数(DNA,RNA,蛋白质,细胞体积,抗原等),从而实现对细胞的定量分析和分选.
①DNA合成的检测
[原理] 用5-溴脱氧尿嘧啶(5-BrdU)掺入S期细胞的DNA,然后用抗5-BrdU抗原的特异性抗体,用FCM准确测定细胞的DNA合成速率.
[结果] 提供有关细胞周期各时相分布的动态参数.
[临床应用] 间接了解DNA的合成情况,协助临床上制定最佳治疗方案.
②DNA含量的测定
[原理] 用荧光染料碘化丙啶(PI)与双链DNA分子特异性结合,DNA的含量与荧光染料的结合量成正比.利用FCM绘出DNA直方图作细胞周期分析.
[结果]
细胞DNA含量:用DNA指数(DI)表示相对含量.
细胞周期各时相细胞的相对数包括:G0/G1期,S期和G2-M期各时相细胞的百分比,SPF(%)及细胞增殖指数PI(%) .
[临床应用] 了解髓系白血病细胞的倍体水平和增殖情况;了解急性白血的不同细胞周期细胞数的百分比,协助判断预后情况.对比白血病治疗前后患者白血病细胞内的DNA含量,可了解其对化疗药物是否敏感,从而指导临床用药.SPF(%)高者对周期特异性药物比较敏感,可诱导白血病细胞进入S期,以提高化疗效果.
6)粒细胞抗体检测
①萤光免疫法
[原理] 在正常人粒细胞悬液中加入受检血清,如血清中有粒细胞抗体,便与正常人粒细胞结合,再加入标记有萤光物质的抗抗体,可与粒细胞膜结合而显示萤光.
[参考值] 正常时血清阴性,有阳性反应表示受检血清中有粒细胞抗体.
[临床应用] 本方法临床上常作为确诊免疫性粒细胞减少的试验.
②化学发光法
[原理] 用化学发光技术测定单个核细胞与抗体被覆的粒细胞相互作用产生的代谢反应,间接测定抗粒细胞抗体.
[参考值] 以发光指数表示结果.
[临床应用] 本法可用于确诊免疫性粒细胞减少症.
③流式细胞技术检测
[原理] 用正常人\"O\"型抗凝血分离出单核细胞和粒细胞,经1%多聚甲醛固定,二者再等量混合制成细胞悬液,加受检血清孵育,再加结合异流氰酸萤光素(FITC)和抗人F(ab)2IgG,,采用FCM进行分析.
[参考值] 荧光强度与粒细胞抗体量呈线性关系,根据萤光强度的大小即可得到粒细胞抗体的量
[临床应用] 本法可对粒细胞抗体作半定量测定及对抗体类型进行分析,以确定是否存在免疫复合物.
④白细胞抗人球蛋白消耗试验
[原理] 在受检血的粒细胞悬液中加入抗人球蛋白抗体,如粒细胞膜上吸附有不完全抗体,则加入的抗人球蛋白抗体即与之结合而被消耗.
[参考值] 如测定组效价低于标准对照组2管或2管以上为阳性,表明受检血清中有不完全抗粒细胞抗体.正常对照和盐水对照组应无消耗.
[临床应用] 可间接测定受检者血清或粒细胞表面存在不完全抗体.
(4)白细胞免疫标记检测
免疫标记存在于细胞表面或胞质内,其代表某一细胞种类或某一亚群,如表面受体,分化抗原等.白细胞在其成熟过程中有不同的分化抗原表达.白细胞免疫标记检测在国际上公认流式细胞术.
1)萤光显微镜计数检测
[原理] 利用萤光素把抗体蛋白标记为萤光抗体.此萤光抗体与细胞表面的分化抗原相结合后在萤光显微镜特定激发光的照射下发出荧光,成为可见的圆形物.以此对细胞表面标志作出鉴定和定位.
[结果] 计算阳性细胞率.
[临床应用] 参见生物素-亲和素酶标法.
2)流式细胞仪计数检测
[原理] 将粒细胞标本用荧光标记制成悬液,用流式细胞仪在短时间分析数万个细胞,用计算机记录处理后快速对各个细胞进行多参数定性和定量分析.
[结果] 流式细胞仪的数据显示通常以一维单参数直方图,二维点阵图,二维等高图或假三维图来表示.单参数直方图是一维数据应用最多的图形.
[临床应用] 参见生物素-亲和素法
3)碱性磷酸酶-抗-碱性磷酸酶桥联酶标法
[原理] 碱性磷酸酶-抗-碱性磷酸酶桥联酶标(APAAP)法首先是以牛肠碱性磷酸酶作为抗原免疫小鼠,制备小鼠杂交瘤抗碱性磷酸酶单克隆抗体,再与碱性磷酸酶结合,形成APAAP复合物.以小鼠杂交瘤单克隆抗体为第一抗体,兔抗-鼠免疫球蛋白为第二抗体(桥),APAAP复合物为第三抗体.通过碱性磷酸酶水解底物显色,达到抗原定位.
[结果] 高倍镜下计数200个有核细胞,其中细胞膜上或胞质内显示红色标记物为阳性,无红色标记物为阴性.计算各片阳性细胞百分率,该百分率即分别代表各单抗所指向抗原的阳性百分率.阳性细胞 ≥20%为阳性结果.
[临床应用] 参见生物素-亲和素法
4)生物素-亲和素酶标法
[原理] 生物素先与辣根过氧化物酶偶联,再与亲和素结合,形成亲和素-生物素- 辣根过氧化物酶复合物,即ABC.细胞抗原与特异性抗体(第一抗体)结合后,与已标记上生物素的第二抗体起反应,再与ABC结合.ABC上辣根过氧化物酶作用于显色剂,使其产生有色沉淀,确定抗原存在部位.
[结果] 计数方法同APAAP.
[临床应用] 抗人白细胞分化抗原CD的测定有重要的临床意义.用于对造血干,祖细胞的研究或分离与纯化,T细胞亚群的检测.也常在血液系统疾病中应用,如:在急性白血病中鉴别AML和ALL,急性白血病化疗药物的选择;微量残留白血病的检测,恶性淋巴瘤分类和诊断以及在造血干细胞移植中;都运用白细胞免疫标记技术.
第五章 单核细胞系统
1.单核-吞噬细胞的生物化学与代谢
(1)单核-吞噬细胞的生物化学
单核细胞转变为吞噬细胞的过程中胞质中溶酶体颗粒增多.溶酶体主要包括β-葡萄糖醛酸酶,酸性磷酸酶等多种变性酶,这与该细胞吞噬,杀死和消化微生物及清除受损伤和衰老的血细胞的功能密切相关.线粒体,线粒体酶(如细胞色素氧化酶)的活性及细胞呼吸率也增加.
(2)单核-吞噬细胞的化谢
单核-吞噬细胞的代谢特点是:
1)呼吸爆发 静止的单核-吞噬细胞仅有很低的需氧代谢,代谢所需的能量大部分来自于其中的厌氧糖原酵解.当受到激活时,无论有无配体与单核-吞噬细胞表面受体结合,单核-吞噬细胞都表现为氧消耗增加,厌氧糖原酵解增加,戊糖磷酸途径活跃.同时产生高毒性的氧衍生物O2-,H2O2等,这一系列反应即称为呼吸爆发,产生的活性态氧物质都具有杀菌或细胞毒活性.
2)活性氮中间体的产生 单核-吞噬细胞中存在一氧化氮合成酶的酶系统.这种合成酶作用于L-精氨酸末端胍基氮,从而产生一系列高活性氮中间体如NO等,具有强烈的杀伤效应和免疫系统的调节作用.
3)在单核-吞噬细胞及其他吞噬细胞的吞噬溶酶体或溶酶体中,有许多酶或非酶蛋白质,它们在pH发生改变时,也可以产生不依赖于活性氧和活性氮的杀伤作用.
4)单核-吞噬细胞中的花生四烯酸代谢也十分活跃.
2.单核-吞噬细胞功能
(1)趋向性 单核细胞和吞噬细胞在内,外源性的趋化因子的作用下能定向移动
(2)吞噬功能 单核-吞噬细胞能将病原微生物(主要针对结核杆菌,原虫,真菌等),衰老损伤的细胞和异物颗粒等固体物质和液体物质,分别经吞噬和胞饮作用摄入细胞内形成吞噬小体,并进一步与溶酶体融合形成吞噬溶酶体,并发生脱颗粒现象.
(3)诱导及免疫调节反应 ①正调节功能:在诱导免疫反应时,吞噬细胞摄取并处理抗原,并将有效抗原成分递呈给淋巴细胞,②负调节功能:吞噬细胞受到某些刺激信号,如LPS,分枝杆菌成分或肿瘤抗原等的持续,过度激活,会转成抑制性吞噬细胞.抑制性吞噬细胞可以通过本身或其分泌的物质(如PGE2),直接抑制作用,对免疫应答起负调控作用.
(4)抗肿瘤活性 主要是通过抗体依赖性细胞毒机制(ADCC);激活的吞噬细胞释放的TNF或其胞内的溶酶体杀伤肿瘤细胞等.
(5)吞噬细胞的分泌作用 吞噬细胞分泌不同的因子,主要有酸性水解酶,中性蛋白酶(纤维蛋白溶酶原活化因子等),溶菌酶,补体成分,凝血因子,血管生长因子,EPO,成纤维细胞生长因子,TNF,花生四烯酸代谢产物,分别起不同的生物学作用.
(6)对白细胞生成的调节
人正常单核细胞和吞噬细胞产生CSF,作用于自身骨髓祖细胞CFU-GM而诱导分化分化成粒细胞,单核细胞或吞噬细胞.吞噬细胞通过产生前列腺素(如PGE1)来抑制CFU-GM的分化,与CSF的刺激作用共同参与维持白细胞生存的平衡.成熟粒细胞可产生乳铁蛋白,抑制吞噬细胞产生CSF,并产生抑素,抑制其祖细胞的增殖.
3.单核-吞噬细胞动力学
(1)骨髓 骨髓中有单核细胞的干细胞池,生成池和贮存池.原始,幼稚单核细胞构成生成池.幼稚单核细胞分化为两个单核细胞,组成贮存池.骨髓中几乎不存在单核细胞的贮存池.
(2)血液 骨髓中的单核细胞进入血液后,在循环池与边缘池之间进行交换,边缘单核细胞池约为循环单核细胞池的3倍.
(3)组织 血液中单核细胞移向结缔组织或其他器官.它们在结缔组织内继续分化,经过5-9天后成为一个典型的吞噬细胞,成熟的吞噬细胞不再分裂.感染,毒物刺激或组织损伤能刺激骨髓产生单核-吞噬细胞,加速吞噬细胞的更新.吞噬细胞分泌的某些体液因子对单核细胞的产生增强和调节作用.
第六章 淋巴细胞浆细胞系统
1.淋巴细胞-浆细胞的生物化学与代谢
(1)淋巴细胞的分类:淋巴细胞源于骨髓干细胞,根据淋巴细胞发育和成熟的途径不同以及含有不同的表面分化抗原,大致分为T细胞,B细胞,NK细胞三类
(2)淋巴细胞的生物化学特点:血液中静止淋巴细胞所含阳离子主要有K+,Na+和Ca2+.T细胞糖原储备贫乏,DNA含量和其它二倍体细胞相同,而RNA含量较低.其溶酶体中包含酸性水解酶,如酸性磷酸酶,β-葡萄糖醛酸酶和α-糖苷酶等.
(3)淋巴细胞的代谢:①核酸的合成:与淋巴细胞核酸代谢有关的酶有:末端脱氧核苷酸转移酶,腺苷脱氨酶和嘌呤核苷磷酸化酶等.其中TdT是血液系统最重要的酶之一.血液中静止的淋巴细胞含有与DNA复制,修复等功能有关的酶,如DNA多聚酶Ⅰ和Ⅱ,RNA多聚酶,还有嘌呤和嘧啶合成的酶等.②脂肪酸和脂类代谢:能将14C醋酸盐掺入长链脂肪酸,不合成前列腺素.③糖类代谢:其能量主要来源于糖酵解途径和三羧酸循环,一少部分来源于磷酸戊糖途径.④蛋白合成:淋巴细胞蛋白质合成也与其存活和功能有关.
2.淋巴细胞-浆细胞功能
淋巴细胞的主要功能包括参与体液免疫,细胞免疫和分泌淋巴因子.
(1)T细胞的功能
1)介导细胞免疫反应 T细胞分为TCRαβ(TCRⅡ型),TCRγδ(TCRⅠ型)T细胞.TCRⅡ型T细胞分为CD4+ T细胞和CD8+ T细胞.CD4+ T细胞分为两个功能亚群:①辅助性T细胞:能够促成T细胞和B细胞的免疫反应.②诱导抑制性T细胞:能诱导CD8+ T细胞中细胞毒功能和抑制T细胞功能.另外,CD4也是人类免疫缺陷病毒的受体分子,可结合HIV.CD8+ T细胞可分为两个功能亚群:①抑制性T细胞:能抑制T细胞和B细胞的免疫反应.②细胞毒性T细胞:其主要作用是直接与靶细胞结合,通过释放穿孔素等杀伤靶细胞.
2)免疫调节作用 执行免疫调节功能的T细胞主要为TH和TS细胞.TH能够辅助B细胞产生抗体和辅助TC功能,分别由TH1和TH2亚群完成.另外TH1亚群还能介导特异性的炎症反应. TH2主要负责刺激B细胞增生,分化为抗体产生细胞即浆细胞.CD4+ T亚群中的诱导抑制T细胞能诱导CD8+ T中细胞毒功能和抑制性T细胞功能.TS对B细胞合成和分泌抗体,TH细胞介导的细胞免疫和迟发性变态反应以及TC介导的细胞毒作用都有抑制作用.
(2)B细胞的功能 体液免疫,免疫调节
B细胞通过Ig接受抗原刺激,并在TH2细胞辅助下分化为浆细胞,合成和分泌Ig.B细胞有三个主要的功能:产生抗体,提呈抗原及分泌细胞因子与参与免疫调节.
1)体液免疫 细胞介导体液免疫,可由胸腺依赖抗原或非胸腺依赖抗原引起.
2)免疫调节作用 激活的B细胞能产生大量细胞因子,它们参与免疫调节,炎症反应及造血过程.通过抑制作用和抗原递呈作用两种方式参与免疫调节作用:①抑制性B细胞: ②抗原递呈作用:
(3)NK细胞的功能
大约有10%～15%的外周血淋巴细胞缺少T或B细胞标志.在形态上,这群细胞属于大颗粒淋巴细胞.80%的LGL能够不经预先致敏即可杀伤肿瘤细胞以及病毒和寄生虫感染的细胞.它们杀伤靶细胞的作用也不受MHC限制.这类细胞称为NK细胞
3.淋巴细胞-浆细胞动力学
(1)T细胞(胸腺依赖性淋巴细胞)
在胸腺中淋巴细胞的增殖与分化不依赖于抗原的刺激.最终分化为能与异物抗原发生反应的CD4+或CD8+的单阳性细胞,进一步分化成不同的T细胞亚群.
(2)B细胞(囊依赖性淋巴细胞)B细胞分化过程分为两个阶段,即抗原非依赖性期(中枢免疫器官内进行)和抗原依赖期(主要在外周免疫器官内进行).各阶段的主要标志为Ig基因的重排和膜表面标志的表达.当成熟B细胞分化为浆细胞时,B细胞表面的大部分标志均可丧失,并可出现一些新的浆细胞特有标志,如浆细胞抗原-1(PCA-1)等分子.
(3)淋巴细胞再循环 是指淋巴细胞在血液与淋巴组织之间的反复循环.通过淋巴细胞再循环,可使淋巴细胞接触抗原的机会增加,增强免疫反应,也能使免疫记忆性淋巴细胞有机会经常接触到相应的特异性抗原,保持其免疫记忆功能.
第七章 血栓与止血
1.巨核细胞形态和功能
巨核细胞系统由髓系干细胞发育而来,包括原始巨核细胞,幼稚巨核细胞,颗粒型巨核细胞,产血小板型巨核细胞,裸核型巨核细胞及血小板.巨核细胞的生长和成熟包括胞核的分裂和成熟,胞质的成熟及血小板生成.巨核细胞增殖时,细胞核内DNA含量成倍增加,核分裂,但胞体不分裂,形成多倍体细胞,故胞体明显大于其他血细胞.正常人骨髓中,16N巨核细胞占多数.
(1)正常巨核细胞形态
1)原始巨核细胞(megakaryoblast) 胞体直径15～30μm,不规则,常可见指状胞质突起,周边常有少许血小板附着;胞质较少,深蓝色,周边深浓,无颗粒;胞核较大,圆形或不规则,胞核1～2个,染成紫红色,染色质较粗,排列较紧密且分布不均匀,核仁2～3个,常不清晰,呈淡蓝色.
2)幼稚巨核细胞(promegakaryocyte) 胞体直径30～50μm,常不规则,也可有指状突起,有时细胞周边有少许血小板附着;胞质较丰富,深蓝色或淡蓝色,近核处常有较明显的淡染区,胞质中出现细小,大小一致的淡紫红色颗粒,颗粒一般在近核处首先出现而使此处的胞质呈淡红色;胞核不规则,有重叠或扭曲,呈肾形或分叶状,核染色质粗颗粒状或小块状,排列紧密,核仁常无.
3)颗粒型巨核细胞(granular megakaryocyte) 胞体直径40～70μm,有时可达100μm以上,常不规则,胞膜完整;胞质极丰富,呈淡红色或淡蓝色,胞质中充满大量淡紫红色颗粒,早期细胞的边缘呈狭窄的嗜碱性透明区,形成外浆,而内浆充满颗粒;胞核巨大,不规则,核分叶后常重叠,核染色质呈粗块状或条状,无核仁.
4)产血小板型巨核细胞(thromocytogenic megakaryocyte) 胞体直径40～70μm,有时可达100μm,胞膜不完整,呈撕破,毛边状,或呈伪足状;胞质极丰富,淡红色,胞质边缘的颗粒可聚集呈簇(称为雏形血小板),其胞质的外侧常有被释放出来的血小板;胞核巨大,不规则,核分叶后常重叠,核染色质呈条状或块状,无核仁.
5)裸核型巨核细胞(naked megakaryocyte) 胞核同产血小板型巨核细胞,胞质无或有少许.裸核型巨核细胞有时是由于涂片制作时,将胞质推散所致,此核最终被吞噬细胞吞噬.
6)血小板(platelet) 见本章2..
(2)异常巨核细胞形态
1)微小巨核细胞 又称为淋巴样巨核细胞.其胞体在15～20μm以下,周围常有血小板;核单个,圆形或椭圆形,核如淋巴细胞大小,无核仁;胞质少,呈浅红色或灰蓝色,常含有淡紫红色颗粒.此细胞几乎都出现于恶性血液病.
2)小巨核细胞 胞体20～40μm ;核小,1～2个,呈圆形或椭圆形;胞质多少不一,有少量淡紫红色颗粒或血小板.
3)多小核巨核细胞 胞体40～80μm ;胞核小,多个,无核丝相连,圆形;胞质丰富,有少量淡紫红色颗粒,多无血小板形成.
4)大单核巨核细胞 胞体20～40μm ;胞质丰富,有淡紫红色颗粒,多无血小板形成;核大,圆形,偏位.
5)巨核细胞核分叶过度 胞体大小似颗粒型巨核细胞,其核分为多叶,其中有的以核丝相连,分叶的核常大小及形态不一,常无核仁.
6)变性巨核细胞 指巨核细胞胞质及或胞核中形成空泡(多少不一),颗粒明显减少.
(3)巨核细胞功能
巨核细胞是骨髓中最大的造血细胞,其功能就是形成血小板,每个巨核细胞产生血小板量的多少与巨核细胞的倍体数有关.巨核细胞能合成多种特异性的蛋白质,如血小板第4因子,β-血小板球蛋白,巨核细胞还能合成转化生长因子,血小板衍生生长因子,碱性纤维母细胞生长因子等具有广泛生物学作用的因子,在细胞生长,核酸代谢,血管形成,骨髓纤维化等生理及病理过程中起着重要的作用.巨核细胞还具有摄取细胞外物质的功能.巨核细胞也可见于其他器官如肺,脾脏及肝脏等,至于巨核细胞在这些器官中的起着什么作用不清楚.
2.血小板形态和功能
血小板虽然是血液中最小的一个细胞,但它在血栓和止血中起着重要的作用.循环的血小板来源于骨髓巨核细胞.血小板释放到血中后,约1/3贮存在脾脏中,寿命为8～11天,主要在肝脏和脾脏中破坏.
(1)血小板形态
1)普通显微镜下形态
正常血小板胞体直径2～4μm,厚度为0.2-0.4μm,平均体积(MPV)约为6.8～13.5fl,呈星形,圆形,椭圆形,逗点状或不规则形;胞质淡红色或淡蓝色,有时胞质周围呈淡蓝色,称为透明区,中心部位有细小,分布均匀的淡紫红色颗粒,称为颗粒区;胞核无.
异常血小板包括①小血小板:指直径小于2μm;②大血小板:指直径5-7μm;③巨大血小板:指直径大于7.5μm;④超巨大血小板:指直径大于20μm;⑤畸形血小板:呈长轴状,花生形,蝌蚪形,类圆形等;⑥蓝色血小板:胞质蓝色,无颗粒或大颗粒,又称为年轻的血小板.
2)电镜下形态
扫描电镜下,静息血小板呈双面微凸圆盘状,似铁饼;透射电镜下的血小板形态由四部分组成:表面结构,骨架系统,细胞器及特殊膜系统.
①表面结构
血小板表面结构又称为外周区,主要由血小板膜和细胞外衣组成.
Ⅰ.血小板膜 血小板 细胞膜主要由蛋白质和脂质组成,还有少量的糖类.糖类与蛋白质结合形成糖蛋白(glycoprotein,GP),糖类与脂质结合形成糖脂;脂质主要由鞘磷脂和甘油磷脂组成,甘油磷脂主要包括磷脂酰胆碱,磷脂酰乙醇胺,磷脂酰丝氨酸,磷脂酰肌醇.磷脂具有以下生理作用:Ⅰ)膜磷脂代谢:血小板被激活时,膜磷脂在磷脂酶PLA2 ,PLC作用下形成花生四烯酸(arachidomic acid,AA),AA在环氧化酶作用下形成前列腺素内过氧化物(PGG2,PGH2),PGG2和PGH2在血栓烷A2(thromboxane A2,TXA2)合成酶作用下形成有活性的TXA2.TXA2能抑制腺苷酸环化酶(AC)而促进血小板聚集,此外TXA2还具有收缩血管的作用,但其半衰期短,很快转化为稳定而无活性的血栓烷B2(thromboxane B2,TXB2,),TXB2在肝脏氧化酶作用下能形成更稳定的去二甲基-血栓素B2(DM-TXB2) 和11-去氢--血栓素B2(11-DH-TXB2).TXA2和PGI2(在血管内皮细胞膜上合成)是一对作用完全相反的调控系统,在生理情况下两者呈动态平衡,使血管和血小板保持正常功能;Ⅱ)形成血小板活化因子(platelet activating factor,PAF),PAF是迄今发现的最强血小板聚集诱导剂,并参与炎症反应及免疫调节;Ⅲ)形成血小板第3因子(platelet factor 3,PF3):详见本节血小板功能中的促凝活性.
Ⅱ.细胞外衣 又称为糖萼(glycocalyx),主要由糖蛋白的糖链膜外段部分组成,它是许多血小板膜受体的所在部位,如ADP,肾上腺素,胶原,凝血酶,vWF,纤维蛋白原受体等.血小板膜糖蛋包括血小板质膜糖蛋白和颗粒膜糖蛋白.血小板质膜糖蛋白有多种(见表7-1).
表7-1 血小板质膜主要膜糖蛋白特性
国际名称
CD名称
相对分子量
特性
GPⅠa
CD49b
160 000
与GPⅡb形成复合物,是胶原的受体
GPⅠb
CD42 b(Ⅰbα)
CD42 c(Ⅰbβ)
165 000
GPⅨ形成复合物,是vWF,凝血酶的受体
GPⅠc
CD49f
148 000
GPⅡa形成复合物,是纤维连接蛋白的受体,也是层素的受体
GPⅡa
CD29
130 000
与GPⅠa和 GPⅠc形成复合物,是胶原和纤维连接蛋白的受体
GPⅡb
CD41b
145 000(Ⅱb)
Ⅱ与Ⅲ形成复合物,是纤维蛋白原的受体,也是和纤维连接蛋白的受体
和Ⅲa
CD61
90 000(Ⅲa)
CD41a(Ⅱb/Ⅲa)
GPⅣ
CD36
88 000
是凝血酶敏感蛋白的受体
GPⅤ
CD42d
82 000
与GPⅠb,Ⅸ形成复合物,构成凝血酶的受体
GPⅨ
CD42a
22 000
GPⅠb形成复合物,是wWF的受体
α颗粒膜蛋白-140(granular membrane protein-140,GMP-140)是一种颗粒膜糖蛋白,又称为血小板选择素(P-selectin).它是a颗粒膜上分子量为140KD的糖蛋白,血小板未活化时位于α颗粒膜上,血小板被活化时在血小板膜上大量表达并释放入血浆中,因此GMP-140是血小板活化的一个重要指标.
②骨架系统(skeletal system)
骨架系统又称为溶胶-凝胶区,由位于膜内侧的微管,微丝及膜下细丝组成,其中最重要的是环形微管.此外,还有凝溶蛋白,肌动蛋白结合蛋白,a-辅肌动蛋白,外廓蛋白等也参与了血小板骨架系统的工作.
Ⅰ.微管(microtubules) 主要成份是微管蛋白A,B,两者组成了二聚体,一定数量的二聚体排列形成了细丝, 12～15根这种细丝围绕形成环形微管.环形微管在低温环境下消失,这时血小板变成了不规则球形;当血小板加热至37℃时,环形微管重新出现,血小板又变成了圆盘状.可见环形微管对维持血小板形态具有重要的作用,是血小板骨架系统中的主要组成部分.
Ⅱ.微丝(microfilaments) 是血小板收缩作用的主要成份,有许多蛋白质调节着微丝的形成.它为实心细丝状结构,由肌动蛋白细丝和肌球蛋白粗丝组成,两者组成比例为100:1.血小板在静息状态下,微丝通常不易见到;当血小板被活化时,胞质中出现大量的微丝.血小板的收缩实际上是肌动蛋白和肌球蛋白相互滑动,收缩的结果,所以微丝在血小板的变形,释放反应及血块收缩中起着重要的作用.
Ⅲ.膜下细丝(submembrane filaments) 位于细胞膜与环形微管之间,结构和作用与微丝相似.
总之,血小板被活化时,细胞由圆盘状转变为球形,出现突起,使血小板变形,伸展和伪足形成,血小板的这种形态改变称为黏附变形.
③细胞器(organelle)
血小板胞质中含有多种细胞器,其中α颗粒(a-granules),致密颗粒(dense granules)和溶酶体(lysosome)最为重要.
Ⅰ.α颗粒 每个血小板中有十几个,圆形,直径为250～500nm,颗粒有界膜包围,内容物呈中等电子密度.α颗粒是血小板可分泌蛋白质的主要贮存部位包括血小板第4因子(platelet factor 4,PF4),β-血小板球蛋白(β-thromboglobulin,β-TG),凝血酶敏感蛋白,纤维连接蛋白,血小板衍生生长因子,因子Ⅴ,Ⅺ,Fg,vWF,HMWK等.其中PF4和β-TG是血小板特有的蛋白质,PF4能中和肝素的抗凝活性,β-TG能抑制血管内皮细胞合成PGI2,故能间接地促进血小板聚集和血栓形成.
Ⅱ.致密颗粒 又称为δ颗粒,主要贮存低分子量的活性物质.每个血小板中有4～8个,圆形,直径为200～300nm,颗粒有界膜包围,颗粒与界膜之间常有一层透亮的间隙,主要含有钙离子,ADP,ATP,5-HT,抗纤溶酶等.致密颗粒中含有较多的钙离子,所以其电子密度很高.血小板中ATP是维持血小板形态,功能和代谢活动所需的能量来源;ADP与血小板次发聚集有关,当血小板被活化时,可释放出而引起血小板次发聚集.
Ⅲ.溶酶体 又称为γ颗粒,每个血小板数目少,形态上不易与a颗粒区分.溶酶体是血小板的消化结构,其中含有丰富的水解酶及蛋白酶如芳香族硫酸酯酶,β-N-乙酰氨基葡糖甙酶,β-甘油磷酸酶,β-葡萄醛酸酶等.溶酶体的内容物只有在强诱导剂(如凝血酶,胶原等)作用下才发生释放反应.
④特殊膜系统
Ⅰ.开放管道系统(open canalicular system,OCS) OCS的膜来源于巨核细胞的质膜,是血小板膜凹陷于血小板内部形成的曲折管道系统, OCS不仅增加了与外界接触的面积,将外界的刺激信息传递到血小板内部,而且也是血小板与血浆之间物质交换的通道,血小板释放反应就是通过OCS释放的.
Ⅱ.致密管道系统(dense tubular system,DTS) DTS的膜来源于巨核细胞的粗面内质网,与外界不相通.DTS是血小板贮存钙离子的场所,也是合成TXA2的场所,从而调节血小板收缩活动和血小板释放反应.此外,DTS具有巨核细胞和血小板所特有的一种酶即血小板过氧化物酶(platelet peroxidase ,PPO),通过检测PPO对鉴别巨核细胞和其他细胞有重要的价值.
(2)血小板功能
1)血小板黏附功能
血小板黏附(adhension)功能是指血小板与非血小板表面的黏附.参与血小板黏附的因素包括血小板,血浆中桥联物质和非血小板表面.在体内,非血小板表面主要是血管内皮下组织,黏附能力强的内皮下组织有胶原,微纤维及基底膜等;在体外,非血小板表面为带负电荷的物质上如玻璃,白陶土,金属等.vWF是血浆中的桥联物质,血小板黏附胶原等时必须有vWF作为桥联物质.血小板质膜上的GPIb/Ⅸ复合物借vWF的桥联作用黏附于血管损伤处的内皮下组织.血小板GPⅡb/Ⅲa也可通过与vWF,纤维蛋白连接蛋白(Fn)等黏附蛋白作用导致伸展黏附.
2)血小板聚集功能
血小板聚集(aggregation)功能是指血小板与血小板之间的黏附形成聚集体,它在初期止血中起着重要作用.血小板聚集可有两类不同机制诱发,一类是诱导剂,另一类是流动状态下的剪切变应力.血小板的诱导剂包括ADP,肾上腺素,凝血酶,胶原,瑞斯托霉素,5-HT,AA,PAF,微纤维,内毒素,细菌,病毒,肿瘤细胞,免疫复合物等,其中前五者是体外最常用的诱导剂.诱导剂引起的血小板聚集有三种途径: ADP途径,TXA2途径和PAF途径.
参与血小板聚集的因素包括: GPIIb/IIIa,钙离子及纤维蛋白原.血小板被活化,GPIIb/IIIa的空间构型发生变化,导致纤维蛋白原受体暴露,从而发生聚集.在某种情况下,除纤维蛋白原外的一些其他大分子黏附蛋白如vWF,Fn也可与 GPIIb/IIIa 结合介导血小板聚集反应.
血小板的聚集有两种类型:①初发聚集(又称为第一相聚集):指在外源性诱导剂作用下发生的血小板聚集,这种聚集是可逆的;②次发聚集(又称为第二相聚集):指在血小板释放的内源性诱导剂作用下的聚集,是不可逆的.
3)血小板释放反应
血小板释放反应(release reaction)是指血小板被激活后,形态改变, 血小板中的颗粒与质膜融合,使颗粒中的生物活性物质从开放管道系统释放到血中的过程.血小板的释放通常在血小板聚集后发生,现已证明大部分聚集诱导剂能引起血小板释放反应,但强,弱诱导剂所引起的释放反应程度不同.弱诱导剂所诱导的释放不超过α颗粒和致密体颗粒内容物的25%,强诱导剂可使70%～90%内容物释放.致密体内容物在受弱刺激如ADP,低浓度胶原作用下,即可诱导释放反应;溶酶体内容物需要在强刺激物作用下才可诱导释放反应.
4)血小板促疑活性 是指血小板参与凝血反应,加速内源凝血系统,促进血液凝固的功能.血小板被激活时,静息状态下位于膜内侧的磷脂酰丝氨酸转向外侧,形成PF3,为凝血提供了因子活化的产所;血小板表面存在着凝血因子Ⅹa的结合位点,促进凝血酶原酶形成;释放多种凝血因子等参与凝血过程.
5)血块收缩功能 血块收缩依赖血中纤维蛋白原和血小板的数量,质量.被激活的血小板伸出多个伪足,伪足搭在纤维蛋白网上.当伪足呈向心性收缩时,纤维蛋白网变小,其网中的血清被挤出来,使血块收缩.
6)维护血管内皮细胞完整性 血管内皮细胞和内皮细胞之间存在着空隙,这间隙由血小板来填充,故能增强血管壁的抵抗力,降低血管的脆性和通透性.
综上所述,血小板通过黏附,聚集和释放反应参与初期止血过程,再通过释放其内含凝血因子,提供催化表面和血块收缩等功能参与二期止血过程.
3.血小板检查
(1)血小板黏附试验
[原理] 血小板黏附试验(platelet adhension test,PAdT)是利用血小板在体外可黏附于玻璃的原理设计的.根据所使用玻璃器材不同,将血小板黏附试验分为玻璃珠柱法,旋转玻球法及玻璃漏斗法.基本原理是将离体的新鲜全血置玻璃珠柱或玻璃漏斗或旋转的玻璃球中,同玻璃接触一定时间后,计数接触前,后的血中血小板数,得出血小板黏附率.
[参考值]
血小板黏附率(%)= ×100%
玻璃珠柱法:53.9%～71.1%
玻璃漏斗法:21.0%～42.8%
旋转玻球法(12ml玻瓶):男性28.9%～40.9%;女性34.2%～44.6%
[临床意义]
1)减低 先天性和继发性血小板功能异常(以后者多见),如血管性假血友病,巨大血小板综合征,低(无)纤维蛋白血症,异常纤维蛋白血症,急性白血病,骨髓增生异常综合征,骨髓增殖性疾病,肝硬化,尿毒症,服用抗血小板药物等.
2)增加 见于血栓前状态和血栓形成性疾病,如高血压病,糖尿病,妊娠高血压综合征,肾小球肾炎,肾病综合征,心脏瓣膜置换术后,心绞痛,心肌梗死,脑梗死,深静脉血栓形成,口服避孕药等.
(2)血小板聚集试验
[原理] 血小板聚集试验(platelet aggregation test,PAgT)常用的是比浊法.在富含血小板血浆的比浊管中加入诱导剂,仪器自动搅拌,随着血小板聚集的发生其透光度逐渐增高,记录仪自动记录血小板透光度的变化(即血小板聚集曲线),通过分析血小板聚集曲线的最大聚集率(MAR)等参数判断血小板的聚集功能.
[参考值] 每个实验室的参考值相差较大,各实验室应根据自己的实验具体情况及实验结果调节诱导剂的浓度,建立自己的参考值.中国医学科学院血液研究所常用的体外诱导剂测得的MAR为:
11.2μmol/L ADP液: 53%～87%
5.4μmol/L肾上腺素: 45%～85%
20 mg/L花生四烯酸: 56%～82%
1.5g/L瑞斯托霉素: 58%～76%
20mg/L胶原: 47%～73%
[临床意义]
1)减低 血小板无力症,血小板贮存池病(无第二个峰),血管性假血友病,巨大血小板综合征,低或无纤维蛋白原血症,急性白血病,骨髓增生异常综合征,骨髓增殖性疾病,肝硬化,尿毒症,服用抗血小板药物,特发性血小板减少性紫癜等.
2)增加 见于血栓前状态和血栓形成性疾病,如糖尿病,肾小球肾炎,肾病综合征,心脏瓣膜置换术后,心绞痛,心肌梗死,脑梗死,深静脉血栓形成,抗原-抗体复合物反应,高脂饮食,口服避孕药,吸烟等.
(3)血块收缩试验
[原理] 血块收缩试验(clot retraction test,CRT)是反映血小板收缩功能的试验,分为定量法,试管法和血浆法.其原理为全血或血浆凝固后,由于血小板收缩使血清从纤维蛋白网眼中挤出而使血块缩小,观察血清占原有全血量(如定量法,试管法)或血浆量(如血浆法)的百分比(即血块收缩率),可反映血块收缩程度.
[参考值]
定量法:48%～64%
试管法:1h开始收缩,24h完全收缩
血浆法:>40%
[临床意义]
1)下降 见于血小板减少症,血小板增多症,血小板无力症,低或无纤维蛋白原血症,严重凝血功能障碍,异常球蛋白血症,红细胞增多症(定量法及试管法)等.
2)增加 纤维蛋白稳定因子缺乏症,严重贫血(定量法及试管法).
(4)血小板活化指标检测
1)血浆b-血小板球蛋白和血小板第4因子检测
[原理] b-血小板球蛋白(b-TG)和血小板第4因子(PF4)是血小板特有蛋白质,血小板被激活时可释放到血浆中,用双抗体夹心法可进行检测.
[参考值] b-TG:(6.6～26.2)μg/L ,PF4:(0.9～5.5)μg/L
[临床意义]
①减低 见于先天性或获得性α-贮存池病.
②增加 见于血栓前状态及血栓性疾病,如糖尿病伴血管病变,妊娠高血压综合征,系统性红斑狼疮,血液透析,肾病综合征,尿毒症,大手术后,心绞痛,心肌梗死,脑梗死,弥散性血管内凝血,深静脉血栓形成等.
2)P选择素检测
[原理] P选择素存在于α颗粒膜中,当血小板被活化后P选择素在血小板膜表面表达并释放到血中,故测定血浆或血小板表面的P选择素可判断血小板被活化的情况,检测原理为双抗体夹心法.
[参考值] 血浆P选择素 (9.2～20.8)μg/L,血小板P选择素数目 (7900～10100)分子数/血小板.
[临床意义] 增加见于血栓前状态及血栓形成性疾病,如心肌梗死,脑梗死,糖尿病,自身免疫性疾病等.
3)血栓烷B2检测
[原理] 血小板被激活后,血小板膜磷脂发生AA代谢,形成稳定的血栓烷B2,可用ELISA法进行检测.其原理为将TXB2包被在反应板中,将待测标本(或不同浓度的标准液)和抗TXB2抗体加入反应板中,标本中的TXB2和反应板中的TXB2竞争性地与抗TXB2抗体结合,酶标板经洗涤后,加入酶标抗体,最后加底物显色,显色深浅与血中TXB2含量呈反比,根据标准曲线可得出待测标本的TXB2含量.
[参考值] (28.2～124.4)ng/L
[临床意义]
①减低 见于服用阿司匹林类等非甾体类抗炎药物或先天性环氧化酶缺乏等.
②增加 见于血栓前状态及血栓形成性疾病,如糖尿病,肾病综合征,妊娠高血压综合征,动脉粥样硬化,高脂血症,心肌梗死,心绞痛,深静脉血栓形成等.
4)11-脱氢-血栓烷B2检测
[原理] 11-脱氢-血栓烷B2(11-DH-TXB2)是TXB2在肝脏氧化酶作用下形成的产物,可用ELISA法进行检测.在包被有鼠抗兔IgG酶标板中,依次加入游离11-DH-TXB2(指的是待测标本或不同浓度的标准液),兔抗人11-DH-TXB2抗体,乙酰胆碱酯酶标记11-DH-TXB2,此时游离11-DH-TXB2和标记11-DH-TXB2竞争性地与兔抗人11-DH-TXB2抗体结合形成复合物,复合物再与酶标板中鼠抗兔IgG结合,酶标板洗涤后加入酶底物显色,显色深浅与标本中11-DH-TXB2含量呈反比,根据标准曲线可得出待测标本中含量.
[参考值] (2.0～7.0)ng/L
[临床意义] 同TXB2测定.
(5)血小板第3因子有效性检测
[原理] 利用白陶土作为血小板的活化剂促进PF3形成,用氯化钙作为凝血反应的启动剂,用正常血浆,患者血浆的PPP和PRP相互组合(详见表7-2),测定各自的凝固时间,比较各组时间,可判断PF3有否缺陷.
表7-2 PF3有效性测定分组
组别
患者血浆(ml)
正常血浆(ml)
PRP
PPP
PRP
PPP
1
0.1
0.1
2
0.1
0.1
3
0.1
0.1
4
0.1
0.1
[参考值] 第3组,第4组分别为患者和正常人(作为对照管),患者PF3有缺陷或内源凝血因子有缺陷时第3组凝固时间比第4组长.当第1组较第2组凝固时间延长5s以上,即为PF3有效性减低.
[临床意义]
1)减低 见于先天性血小板PF3缺乏症,血小板无力症,肝硬化,尿毒症,弥散性血管内凝血,异常蛋白血症,系统性红斑狼疮,特发性血小板减少性紫癜,骨髓增生异常综合征等.
2)增加 见于高脂血症,食用饱和脂肪酸,一过性脑缺血发作,心肌梗死,动脉粥样硬化,糖尿病伴血管病变等.
(6)血小板膜表面相关抗体和相关补体检测
[原理] 在某些免疫性疾病中,血小板膜表面存在着抗体(IgG,IgA,IgM)或补体,导致血小板破坏过多,测定血小板膜表面相关抗体(platelet associated immunglobulin,PAIg)或补体(platelet associated complement,PAC)的含量有助于判断血小板减少的原因.测定血小板抗体的方法有很多,其中国内最为常用的方法为双抗体夹心法.
[参考值]
PAIg G:(0～78.8) ng/107血小板
PAIgA: (0～2) ng/107血小板
PAIgM: (0～7 )ng/107血小板
PA C3: (0～129)ng/107血小板
[临床意义]
1)它是特发性血小板减少性紫癜(ITP)诊断,治疗效果,预后观察的指标及切脾的指征,90%以上的ITP病人PAIgG增加.
2)其它疾病如同种免疫性血小板减少性紫癜,Evans综合征,药物免疫性血小板减少性紫癜,慢性活动性肝炎,系统性红斑狼疮,恶性淋巴瘤,慢性淋巴细胞白血病,多发性骨髓瘤等也可增加 .
(7)血小板膜糖蛋白检测
[原理] 用抗人血小板膜糖蛋白(GPⅠb,GPⅡb,GPⅢa)单克隆抗体与受检者血小板膜上的特异性糖蛋白结合,通过放射免疫法检测血小板膜上的糖蛋白含量.
[参考值]
GPⅠb:(1.05～2.03)×104分子数/血小板
GPⅡb/Ⅲa:(4.26～6.64)×104分子数/血小板
[临床意义] GPⅠb 缺乏见于巨大血小板综合征,GPⅡb/Ⅲa缺乏见于血小板无力症.本试验的特异性和敏感性高,故对诊断巨大血小板综合征和血小板无力症具有诊断价值.
(8)血小板生存时间检测
[原理] 阿司匹林(ASP)具有不可逆性抑制血小板环氧化酶的作用,使血小板不能合成TXB2,直至新的血小板生成才能合成TXB2.因此观察受检者服用ASP后TXB2的恢复情况,可推断血小板的生存时间.
[参考值] (7.6～11.0)d
[临床意义] 血小板生存时间缩短见于特发性血小板减少性紫癜,弥散性血管内凝血,Evans综合征,<B style=\'color:black;background-color:#ffff66\'>脾功能亢进,血栓性血小板减少性紫癜-溶血性尿毒症综合征及各种血栓性疾病.
(9)血小板钙流检测
[原理] 利用荧光探针标记血小板内钙离子,在诱导剂作用下,血小板的钙离子通道打开,用共聚焦显微镜观察血小板荧光的强弱变化并经计算机控制系统及图像分析系统观察血小板中钙离子浓度和钙流的变化.
[参考值] 正常细胞内钙浓度为(20～90)nmol/L, 正常细胞外钙浓度为(1.1～1.3)nmol/L.
[临床意义] 血小板钙流是一项新的检测项目,测定有助于了解钙离子在血小板活化和各种止血功能中的作用,也可用于判断钙通道阻滞剂的药理作用.
4.血液凝固
(1)凝血因子的主要特性及分组
参加血液凝固的凝血因子至少有14个,包括12个经典的凝血因子以及激肽系统的激肽释放酶原和高分子量激肽原.根据凝血因子的作用和理化特性可分为四组.
1)依赖维生素K的凝血因子
包括因子II,VII,IX和X,它们的共同特点是分子结构中N端含有数量不等γ-羧基谷氨酸残基(γ-GLa),而该残基在肝细胞内的生物合成依赖维生素K的介导.血浆中的这些因子可同时被硫酸钡所吸附.
凝血酶在止血血栓中的生理病理作用有:①水解Fg;②激活因子XI,VIII,V,VII,XIII;③激活血小板;④激活抗凝系统的蛋白C;⑤抑制纤溶活性等.
2)接触凝血因子
包括因子XII,XI,激肽释放酶原及高分子量激肽原.它们的共同特点是通过接触反应启动内源凝血途径,并可参与纤溶和补体等系统的活化,临床发现接触因子缺乏并不出现出血现象(除因子XI缺乏有轻度出血外),反而表现出不同程度的血栓形成倾向或纤溶活性下降.
3)凝血酶敏感凝血因子
包括因子I,V,VIII,XIII.它们都对凝血酶敏感,从而发生酶促反应或被激活.
4)其他凝血因子
包括因子Ⅲ和Ⅳ.
①因子Ⅲ 习惯称之为组织因子(TF)是正常人血浆中唯一不存在的凝血因子.其广泛存在于各种组织中,尤其在脑,胎盘和肺组织中含量极为丰富,单核-吞噬细胞和血管内皮细胞均可表达.TF是FⅦ的受体,可与FⅦ或FⅦa结合,提供凝血反应的催化表面,参与外源凝血途径的激活.
②因子Ⅳ 习惯称之钙离子(Ca2+),Ca2+作为因子Ⅳ存在于血浆中,与其他二价金属离子(如Mg2+和Zn2+)都可能共同参与凝血过程.
(2)血液凝固,内源性途径,外源性途径及共同途径的概念
1)血液凝固 是指血液由液体状态转为凝胶状态的过程,简称凝血.
2)内源凝血途径 是指从FXII被激活到FXa形成的过程.本途径包括因子Ⅻ,Ⅺ,Ⅸ,Ⅷ,Ca2+及PK,HMWK之间的作用.这一途径在体内已不再是主要的凝血途径.而FVII-TF复合物对因子Ⅸ的活化,以及由FVIIa-TF最终形成凝成凝血酶后对因子Ⅺ的活化作用更大.因此而这里的FⅪa 和FⅨa只是对体内因血管内皮损伤引起的凝血病理生理反应的一个补充.
3)外源凝血途径 是指从TF的释放入血到FX被激活的过程.TF由各种途径(血管损伤,血液中细胞的释放,表达等)进入血液,引起FVII的活化,并与之构成复合物,进而激活FX,FII,最终形成纤维蛋白.这是体内凝血的主要途径,也是发生止血血栓病理改变的主要原因之一.
4)共同凝血途径 是指从因子X的激活到纤维蛋白形成的过程,为内,外源凝血系统所共有.包括凝血酶酶原酶或称凝血活酶的生成,凝血酶的生成及纤维蛋白的形成三个阶段.
(3)凝血机制的过程
凝血是一系列凝血因子相继酶解激活的过程,结果是生成凝血酶,形成纤维蛋白凝块.该过程一般分为内源性凝血途径和外源性凝血途径(其中包括凝血的共同途径),两条凝血途径的主要区别在于启动方式及参加的凝血因子不同,结果形成两条不同的FX激活通路.现在认为两条凝血途径并不是各自完全独立,而是相互密切联系,在机体的整个凝血过程中可能发挥不同的作用.
5.凝血因子检查
常用筛选试验:
(1)活化部分凝血活酶时间测定
[原理] 37℃条件下,以白陶土激活因子XII和XI,以脑磷脂(部分凝血活酶)代替血小板,在Ca2+参与下,观察贫血小板血浆凝固所需时间,即为活化部分凝血活酶时间(APTT),是内源凝血系统较敏感和常用的筛选试验.有手工法和仪器法.
目前主要有3类仪器法检测纤维蛋白的形成,其原理有下述三方面.
1) 光学法 当纤维蛋白原逐渐变成纤维蛋白时,经光照射后产生的散射光(散射比浊法)或透射光(透射比浊法)发生变化,从而得以测定.
2)电流法(钩方法) 根据纤维蛋白具有导电性,利用纤维蛋白形成时的瞬间电路连通来判断凝固终点.
3)黏度法(磁珠法)利用血浆凝固时血浆黏度增高,使正在磁场中运动的小铁珠运动强度减弱,以此判断凝固终点.
[方法学评价] 手工法虽重复性差一点,且耗时,但操作简便,有相当程度准确性,现仍作为参考方法.仪器法快速,敏感和简便,所用配套的试剂,质控物,标准品均保证了试验的高精度;但在诊断的准确性方面,仪器法并不比手工法更高;且仪器本身也会产生一定误差.APTT是一个较为敏感的检测内源凝血因子缺乏的简便试验,已替代普通试管法CT测定.
[质量控制] 标本采集,抗凝剂用量,仪器和试剂,实验温度等均对APTT试验的准确性产生重要的影响,故对实验的要求基本与PT相同(见PT测定).由于缺乏标准的试剂和技术,APTT测定的参考值也随所用的检测方法,仪器和试剂而变化,因此,按仪器和试剂要求进行认真检测比选择测定的方法更为重要.
1)激活剂和部分凝血活酶试剂 来源及制备不同,均可影响测定结果.① 激活剂:常用的有白陶土(KPTT),还可以用硅藻土,鞣花酸.即使是同一类激活剂,其质量也可能有很大的差异.② 部分凝血活酶(磷脂):主要来源于兔脑组织(脑磷脂);不同制剂质量不同,一般选用FVIII,FIX和FXI的血浆浓度为200~250U/L时敏感的试剂.
2)标本采集和处理:基本要求同PT试验.注意冷冻血浆可减低APTT对狼疮抗凝物以及对XII,XI,HMWK,PK缺乏的灵敏度;室温下,FVIII易失活,因此,须快速检测;高脂血症可使APTT延长.
[临床意义] APTT反映内源凝血途径凝血因子(XII,XI,IX,VIII),共同途径中FII,FI,FV和FX的水平.虽然,APTT测定的临床意义基本与凝血时间相同,但灵敏度较高,可检出低于正常水平15%-30%凝血因子的异常.APTT对FVIII和FIX缺乏的灵敏度比对FXI,FXII和共同途径中凝血因子缺乏的灵敏度高.必须指出,单一因子(如因子FVIII)活性增高就可使APTT缩短,其结果则可能掩盖其他凝血因子的缺乏.
1) APTT延长 超过正常对照10s以上即为延长.① 主要见于轻型血友病,可检出FVIII活性低于15%的患者,对FVIII活性超过30%和血友病携带者灵敏度欠佳.在中,轻度FVIII,FIX,FXI缺乏时,APTT可正常.② 血中抗凝物如凝血因子抑制物,狼疮抗凝物,华法林或肝素水平增高,FII,FI及FV,FX缺乏时灵敏度略差.③ 其他如肝病,DIC,大量输入库血等.
2)APTT缩短 见于DIC早期,血栓前状态及血栓性疾病.
3)监测肝素治疗 对血浆肝素的浓度较敏感,是目前广泛应用的实验监测指标.此时,要注意APTT测定结果必须与肝素治疗范围的血浆浓度呈线性关系,否则不宜使用.一般在肝素治疗期间,APTT维持在正常对照的1.5~3.0倍为宜.
(2)血浆凝血酶原定时间测定(一期法)
[原理] 在受检血浆中加入过量的组织凝血活酶(人脑,兔脑,胎盘及肺组织等制品的浸出液)和钙离子,使凝血酶原变为凝血酶,后者使纤维蛋白原转变为纤维蛋白.观察血浆凝固所需时间即凝血酶原时间(PT).该试验是反映外源凝血系统最常用的筛选试验.有手工和仪器检测两类方法.仪器法检验纤维蛋形成的原理与APPT基本相同.
[方法学评价]
1) 手工法 常用普通试管法,曾用毛细血管微量法,后者虽采血量少,但操作较繁琐,已淘汰;也可用表面玻皿法,尽管准确性较试管法高,但操作不如后者方便.手工法虽重复性差一些,耗时,但仍有相当程度的准确性,且操作简便,故仍在临床应用,并可作为仪器法校正的参考方法.
2)仪器法 仪器连续记录凝血过程引起光,电或机械运动的变化,其中,黏度法(磁珠法)可不受光学法影响因素(黄疸,乳糜,高脂血症,溶血等)的干扰.
半自动仪法(加样,加试剂仍为手工操作)提高了PT测定的精确度和速度,但存在标本交叉污染的缺点.全自动仪法(加样,加试剂全部自动化)使检测更加精确,快速,敏感和简便;同时,仪器测定法所用的试剂,质控物,标准品均有可靠的配套来源,保证了试验的高精度.但在临床诊断的准确性方面,仪器法并不比手工法更高.
凝血仪干化学法测定,操作简单,特别有助于床边DIC的诊断,但价格较贵,尚未能普及.
3)标本采集和处理
①患者的准备 患者应停用影响止凝血试验的药物至少1周.
②抗凝剂 国际血液学标准化委员会推荐用于止凝血试验的抗凝剂为0.109M枸橼酸钠(有利于稳定V和VIII,有利于提高APTT监测肝素时的灵敏度),其与血液的容积比为1:9;该比例是基于血标本Ht在正常范围内为前题,若血标本的Ht异常增高或异常减低,由于枸橼酸离子不能进入红细胞内,如不调整适合不同Ht的抗凝剂量,则可使PT延长或缩短.矫正公式:抗凝剂用量=0.00185×血量(ml)×(100—患者Ht).
③采血和处理 止血带使用时间要短,否则可使局部血液浓缩,内皮细胞释放t-PA增加;使用高质量真空带盖采血管或硅化管或塑料管;如不加盖,可使血液中的二氧化碳丢失,pH增高,从而凝固时间延长;采血必须顺利快捷,避免凝血溶血和气泡(气泡可使Fg,FV,FVII变性和引起溶血,溶血又可引起FVII激活,使PT缩短);凝血检测用的血标本应单独采集,立即分离血浆,按规定的离心力除去血小板;创伤性或留置导管的血标本以及溶血,凝血不适宜做凝血试验.
④储存温度和测定时间 低温虽可减缓凝血因子的失活速度,但可活化FVII,FXI.如储存血标本,也要注意有效时间,储存时间过长,凝血因子(尤其FVIII)的活性明显减低,因此,从标本采集到完成测定的时间通常不宜超过2h.
⑤测定 手工法测定,标本温浴时间不宜低于3min,也不宜超过10min;判断何时为纤维蛋白形成(血浆凝固)则是测定PT的关键性技能之一.仪器法测定必须按规范的操作要求进行,不能随意改变测定条件;不同仪器,不同凝固法的终点判原理不一,应建立各自的参考值.
4)组织凝血活酶试剂质量
该试验灵敏度的高低依赖于组织凝血活酶试剂的质量.试剂可来自组织抽提物,应含丰富的凝血活酶(TF和磷脂);现也用纯化的重组TF(r-TF)加磷脂作试剂,r-TF比动物性来源的凝血活酶对FII,FVII,FX灵敏度更高.组织凝血活酶的来源及制备方法不同,使各实验室之间及每批试剂之间PT测定结果差异较大,可比性差,特别影响对口服抗凝剂患者治疗效果的判断,因此,应使用标有国际敏感指数(ISI)的试剂.
5)国际敏感指数和国际标准化比值
为了校正不同组织凝血活酶之间的差异,早在1967年WHO就将人脑凝血活酶标准品(批号67/40)作为以后制备不同来源组织凝血活酶的参考物,并要求计算和提供每批组织凝血活酶的ISI.
ISI表示标准品组织凝血活酶与每批组织凝血活酶PT校正曲线的斜率.即在双对数的坐标纸上,纵坐标是用标准品测定的PT对数值,横坐标是用待校正的组织凝血活酶测定相同标本PT的对数值,经回归求得直线斜率,则待标定的组织凝血活酶的ISI=已知ISI×斜率.批号67/40的组织凝血活酶的参考物ISI为1.0.ISI值越低,试剂对有关凝血因子降低的敏感度越高.
对口服抗凝剂的患者必须使用国际标准化比值(INR)作为PT结果报告形式,并用以作为抗凝治疗监护的指标.
INR=(患者凝血酶原时间/正常人平均凝血酶原时间)ISI.
作PT测定前,应首先了解所用组织凝血活酶试剂的ISI,ISI值通常由厂商提供,测定PT后,即可计算出INR.INR也可从试剂制造商提供的图表中查得.使用ISI和INR可缩小各实验PT测定在技术上和试剂上差异,使抗凝疗法监测中,不同机构的检测结果有可比性.
由于INR是由公式INR=PTRISI换算而来,ISI对INR有很大影响.当ISI=1时,其精密度与敏感度都最高,此时INT=PTR.随着ISI值的增加,INR与PTR的CV值逐渐增大,同时敏感性也逐渐降低.一般认为,用于监测口服抗凝剂治疗时,所用组织凝血活酶的ISI值以1.0~1.5为好.
6) 正常对照 必须至少来自20名以上男女各半的混合血浆所测结果.
7)报告方式 一般情况下,可同时报告受检者PT(s)和正常对照PT(s)以及凝血酶原比率(PTR),PTR=被检血浆PT/正常血浆PT.当用于监测口服抗凝剂用量时,则必须同时报告INR值.
[参考值] 每个实验室应建立所用测定方法相应的参考值.通常:① 成人:11~15s;新生儿延长2~3s;早产儿延长3~5s(3~4d后达到成人水平).② PTR:0.85~1.15.③ INR:口服抗凝剂治疗不同疾病时,需不同的INR.
[临床意义] 是检测外源性凝血因子有无缺陷较为敏感的筛检试验,也是监测口服抗凝剂用量的有效监测指标之一.
1)PT延长 超过正常对照3秒以上或PTR超过参考值范围即为延长.主要见于:① 先天性FII,FV,FVII,FX减低及纤维蛋白原缺乏(Fg<500mg/L),或无纤维蛋白原血症,异常纤维蛋白原血症.② 获得性凝血因子缺乏,如DIC,原发性纤溶亢进症,阻塞性黄疸和维生素K缺乏,循环抗凝物质增多等.香豆素治疗时,当FII,FV,FVII,FX浓度低于正常人水平40%时,PT即延长.
PT对FVII,FX缺乏的敏感性较对FI,FII缺乏的要高,但对肝素的敏感性不如APTT.
2)PT缩短 ① 先天性FV增多.② DIC早期(高凝状态).③ 口服避孕药,其他血栓前状态及血栓性疾病.
3)口服抗凝药的监测 临床上,常将INR为2~4时作为口服抗凝剂治疗时剂量适宜范围.当INR大于4.5时,如Fg和血小板数仍正常,则提示抗凝过度,应减低或停止用药.当INR低于4.5,而同时伴有Fg和(或)血小板减低时,则可能是DIC或肝病等所致,也应减低或停止口服抗凝剂.
7.血液凝固调节系统
(1)抗血液凝固系统的组成和功能
抗血液凝固机制包括细胞和体液二方面的因素.重点是体液抗凝蛋白的特性与作用.
1)蛋白C系统:蛋白C系统除PC外,还包括蛋白S(PS),血栓调节蛋白(TM)和内皮细胞蛋白C受体(EPCR).PC必须转变成活化的PC(APC)才能发挥其抗凝作用.凝血酶是PC唯一的生理性活化剂,TM可大大加速凝血酶对PC的激活.APC的作用靶是因子Va和因子VIIIa.另外,APC可抑制因子Xa与血小板膜磷脂的结合;激活纤溶系统;增强AT-III与凝血酶的结合.APC可以被a2抗纤溶酶,α1抗胰蛋白酶, a2巨球蛋自和3型纤溶酶原激活抑制物所灭活.
2)肝素-抗凝血酶途径:在肝素的存在下,AT-III抑制凝血酶,因子Xa,XIa,IXa以及其它丝氨酸蛋白酶.血浆AT-III缺陷与血栓形成性疾病的相关性表明,它在调节体内止血方面起着至关重要的作用.肝素是众所周知的高效抗凝物,它的抗凝活性归因于其加速AT-III对凝血蛋白酶的灭活作用.
3)组织因子途径抑制物:TFPI是一种与脂蛋白结合的生理性丝氨酸蛋白酶抑制物,在生理性抗凝血蛋白作用中占相当重要的比重,并且直接参与了血液凝固的全过程.它可以直接抑制活化的因子X(Xa),并以依赖Xa的形式在Ca++存在条件下抑制TF-VIIa复合物;还能抑制胰蛋白酶,对纤溶酶及糜蛋白酶也有轻微抑制,但不抑制凝血酶,APC,t-PA等.
4)其它凝血抑制物:蛋白Z和蛋白Z依赖的蛋白酶抑制物;表面结合抑制物,包括磷脂酶A2,狼疮抗凝物,维生素K依赖性凝血蛋白活化片段及血管抗凝物.
【记忆要点】 主要体液抗血液凝固蛋白可总结于表7-3,便于记忆.
表7-3 主要抗血液凝固物质
名称 组成成份 主要作用靶
蛋白C系统 PC,PS,TM,EPCR FVa,FVIIIa
肝素-抗凝血酶III AT-III,HC-II 凝血酶,FXa,FIXa等
组织因子途径抑制物 TFPI TF/VIIa
其它凝血抑制物 PZ,PZI等 FXa等
(2)纤维蛋白溶解系统的组成和功能
纤维蛋白溶解系统(简称纤溶系统),是指纤溶酶原被特异牲激活物转化为纤溶酶(PL),纤溶酶降解纤维蛋白的过程.这一系统的主要功能是将沉积在血管内外的纤维蛋白溶解而保持血管畅通,防止血栓形成或使已形成的血栓溶解,血流复通.
1)纤溶酶原:在组织型纤溶酶原激活物和尿激酶型纤溶酶原激活物的作用下,激活成纤溶酶,使纤维蛋白溶解.
2)组织纤溶酶原激活物:其作用是使纤溶酶原激活转化为纤溶酶.
3)尿激酶型纤溶酶原激活物:肾小管部分上皮细胞,内皮细胞,单核细胞,纤维母细胞以及一些肿瘤细胞株均能合成和分泌u-PA.其作用也是使纤溶酶原激活转化为纤溶酶.
4)纤溶酶:PL是由PLG经纤溶酶原激活物作用裂解后所产生的.主要作用有:①降解纤维蛋白原和纤维蛋白;②水解各种凝血因子(V,VII,X,XI,XII);③分解血浆蛋白和补体;④将单链t-PA,u-PA转变为双链t-PA,u-PA;⑤将谷-PLG转变为赖-PLG;⑧降解GPIb,GPIIb/IIIa;⑦激活转化生长因子,降解纤维连接蛋白,TSP等各种基质蛋白质.
5)纤溶抑制物:有纤溶酶原激活抑制物-1(PAI-1),纤溶酶原激活抑制物-2(PAI-2),纤溶酶原激活抑制物-3(PAI-3),α2-抗纤溶酶(α2-AP),α2-巨球蛋白(α2-MG)等.
纤维蛋白(原)降解机制:纤维蛋白溶解过程是一系列蛋白酶催化的连锁反应,主要分为二个阶段,即PLG在其激活物的作用下转变成PL和PL水解纤维蛋白(原)及其他蛋白质的过程.
纤溶酶原激活途径:内激活途径,外激活途径,外源性激活途径.
纤维蛋白〔原〕降解机制:纤溶酶作用于纤维蛋白原,水解释放出两条多肽,即Bβ1～42和Aa链上裂解下来的碎片A,B,C,H,留下X片段.X片段继续被纤溶酶作用,裂解为D片段及Y片段,Y片段再进一步被裂解为D和E片段.可溶性纤维蛋白及交联纤维蛋白在纤溶酶的作用下,最终形成X\',Y\',D和E\'片段,还生成D-二聚体和g-二聚体等产物.
纤维蛋白(原)降解产物的作用:纤维蛋白原降解产物(FgDP)和纤维蛋白降解产物(FbDP)统称为纤维蛋白(原)降解产物(FDP),均具有抗血液凝固的作用.
【记忆要点】 表7-4总结纤维蛋白溶解系统主要成份及作用.
表7-4 纤维蛋白溶解系统
名称 组成成份 主要作用靶
纤溶酶 PLG,PL Fb,Fbg等
纤溶酶原激活物 t-PA,u-PA PLG
纤溶抑制物 PAI-1,PAI-2,PAI-3等 t-PA,u-PA,PC等
纤维蛋白(原)降解产物 碎片A,B,C,D,H,
X片段,Y片段,D-二聚体等 凝血酶等(抗凝作用)
8.血液凝固调节系统的检查
(1)生理性抗凝物质检测
1)蛋白C活性及抗原测定
2)抗凝血酶III活性及抗原测定
3)凝血酶—抗凝血酶III复合物
4)组织因子途径抑制物活性及抗原测定
(2)病理性抗凝物质检测
1)复钙交叉实验
2)血浆肝素水平测定
3)凝血酶时间及其纠正实验
4)凝血因子VIII抑制物测定
5)狼疮抗凝物
(3)纤维蛋白溶解活性检测
1)组织纤溶酶原激活物活性及抗原测定
2)纤溶酶原激活物抑制物活性及抗原测定
3)血浆纤溶酶原活性及抗原测定
4)纤溶酶—抗纤溶酶复合物
5)a2-抗纤溶酶活性及抗原测定
(4)纤维蛋白降解产物检测
1)血浆硫酸鱼精蛋白副凝固实验
2)纤维蛋白(原)降解产物测定
3)D-二聚体测定
4)纤维蛋白单体(TM)测定
5)纤维蛋白肽Bb1-15与Bb15-42测定
【记忆要点】 表7-5总结检测抗凝及纤溶系统主要项目.
表7-5 检测抗凝及纤溶系统主要项目
项目 参考值 临床应用
蛋白C活性检测 100.24%±13.18% 易栓症,先天性PC缺陷症
蛋白C抗原检测 102.5%±20.1%
抗凝血酶III活性测定 108.5%±5.3% 高凝状态,遗传性AT-III缺乏
抗凝血酶III抗原测定 (0.29±0.06)g/L
组织因子途径抑制物活性测定 < 1U 先天性TFPI缺乏,
组织因子途径抑制物抗原测定 (75～120)mg/L 消耗性TFPI缺乏
血浆肝素水平测定 0 U/L 肝素抗凝监测
凝血酶时间 16～18s 纤溶亢进,DIC,溶栓监测
组织纤溶酶原激活物活性测定 300～600 U/L 纤溶亢进,DIC,高凝状态
组织纤溶酶原激活物抗原测定 1～12 g/L
纤溶酶原激活物抑制物活性测定 (100～1000)AU/L 高凝状态,原发及继发纤溶
纤溶酶原激活物抑制物抗原测定 4～43 mg/L
血浆纤溶酶原活性测定 85.55%±27.83% 高凝状态,原发及继发纤溶
血浆纤溶酶原抗原测定 (0.22±0.03)g/L
a2-抗纤溶酶活性测定 95.6%±12.8% 血栓形成,DIC,先天性a2-
a2-抗纤溶酶抗原测定 66.9±15.4 mg/L 抗纤溶酶缺乏
血浆硫酸鱼精蛋白副凝固实验 阴性 DIC
纤维蛋白(原)降解产物测定 < 5 mg/L 血栓形成,原发及继发纤溶
D-二聚体测定 0～0.256 mg/L 血栓形成,继发纤溶,DIC
第八章 红细胞疾病的检查
1.贫血的诊断和分类
(1)确定贫血存在,程度及类型
贫血是指患者的血红蛋白浓度低于相应的年龄组,性别组和海拔高度组的参考值下限.
表8-1 贫血的诊断标准及程度
男性 女性 孕妇
贫 血 Hb<120g/L Hb<110g/L Hb<100g/L
极重度 Hb100 >34 叶酸/B12缺乏症
部分骨髓再生障碍性贫血
正细胞性贫血 80~100 27~34 急性失血
溶血性贫血
部分骨髓再生障碍性贫血
继发性贫血
小细胞性贫血 <80 1.0 1.0 <1.0 0.5 0.5 <0.5 20 20 <20 <20
骨髓增生程度 低下 极度低下 低下 极度低下 极度低下
预后 较好 差 较好 差 差
(2)再生障碍危象
1)定义 是由于多种原因所致的骨髓造血功能暂时性的急性停滞.常在原有疾病的基础上合并感染,特别是病毒感染诱发.患者可突然贫血或原有贫血突然加重,多数在1~2周内恢复.
Hb常低至20~30g/L,网织红细胞急剧下降或为0为特点.骨髓象多数增生活跃,正常幼红细胞难见,可见巨大原始红细胞,粒系受累时可见巨大的早幼粒细胞.
本病需与急性再生障碍性贫血和纯红细胞再生障碍性贫血相鉴别.后者以骨髓单纯红细胞系统造血障碍为特征的一组异质性综合征.诊断主要是根据其血象和骨髓象中单纯的红细胞系的减少,网织红细胞显著减少,无病态造血和髓外造血;有关溶血性贫血的实验室检查均为阴性.
2.缺铁性贫血
(1)铁缺乏症和缺铁性贫血的定义,病因和分期
1)定义 铁缺乏症是指机体铁含量低于正常.铁缺铁性贫血是指因铁的需要量增加或/和铁的吸收减少所致机体储存铁减少或耗竭,导致红细胞生成障碍所致贫血.
2)病因 ①铁摄入不足;②铁丢失过多.婴幼儿,儿童及孕妇的缺铁性贫血以营养性为主,成年人缺铁性贫血的以出血为主.
3)分期 铁缺乏症可分为三个连续的阶段:储存铁耗竭,缺铁性红细胞生成,缺铁性贫血.
(2)血象,骨髓象和其他检查
(3)诊断标准与鉴别诊断
1)储存铁耗竭 符合以下条款1,再加上2或3中任意一条即可诊断.①有明确的缺铁病因和临床表现;②血清铁蛋白<14μg/L;③骨髓铁染色铁粒幼红细胞<10%或消失,细胞外铁缺如.
2)缺铁性红细胞生成 符合储存铁耗竭的诊断标准,同时有以下任何一条者即可诊断.转铁蛋白饱和度<15%,血清铁64.4μmol/L (或转铁蛋白>3.8g/L);②红细胞游离原卟啉>0.9μmol/L或>4.5g/gHb.
3)缺铁性贫血 ①符合铁耗竭和缺铁性红细胞生成的诊断标准;②小细胞低色素性贫血;③铁剂治疗有效.
4)合并感染,炎症,肿瘤时缺铁的诊断标准 ①红细胞内碱性铁蛋白5%或6叶者>1%;③骨髓巨幼红细胞>10%.粒细胞也有巨幼样变,特别是晚幼粒细胞.巨核细胞可有巨幼样变和核分叶过多及血小板生成障碍.
特殊检查:①血清叶酸(放射免疫法)<6.91nmol/L(<3ng/ml);②红细胞叶酸(放射免疫法)<227nmol/L(<100ng/ml);③脱氧尿嘧啶核苷抑制试验不正常,并可被叶酸纠正者;④诊断性治疗有效.
符合特殊检查标准任意两项,或同时具有消化道症状者诊断为叶酸缺乏症.达到实验室检查标准的①和②(或③),同时有临床表现者诊断为叶酸缺乏性巨幼细胞贫血.
2)维生素B12缺乏性巨幼红细胞贫血
临床表现:①贫血症状;②消化道症状及舌炎;③神经系统症状.
实验室检查与叶酸缺乏性巨幼细胞贫血相同.
特殊检查:①血清维生素B12(放射免疫法)<75pmol/L;②红细胞叶酸(放射免疫法)<227pmol/L(10%
(↑)膜异常 自身溶血试验+)
遗传性椭圆形红细胞增多症(椭圆形红细胞 >15%)
红细胞渗透 遗传性口形红细胞增多症 (口形红细胞 ↑)
脆性试验
G6PD缺乏 (G6PD酶活性↓)
(正常) 酶异常
PK缺乏 (PK活性测定↓)
α-珠蛋白生成障碍性贫血(Hb Bart\'s, HbH)
(↓)血红蛋白异常 β-珠蛋白生成障碍性贫血 (HbA2↑,HbF↑)
镰形细胞贫血 (红细胞镰变性异常,HbS)
不稳定血红蛋白病 (异丙醇试验+,变性珠蛋白小体>30%)
图 8-3 遗传性溶血性贫血的病因诊断示意图
2)临床特征 大多数在儿童期发病,轻型病人到成年时才诊断.偶尔可以表现为溶血危象.典型病例为中等度脾肿大,慢性溶血性贫血.脾切除可以永久性消除溶血.
3)实验室检查与诊断 渗透脆性增加;外周血涂片上小球性红细胞增多(多>10%),可高大60~70%;自溶血试验溶血大于5%;酸化甘油溶血试验阳性(150秒以内).阳性家族史非常重要.
(3)葡萄糖-6-脱氢酶缺乏症
1)定义,遗传方式,发病机理及分型
G6PD是已发现的遗传性红细胞酶缺陷病中最常见的一种.主要分布于非洲,亚洲和有此两种血统的人群中,地中海地区也较常见.G6PD基因位于X染色体上,以伴性不完全显性方式遗传.携带G6PD疾病基因的男性和纯合子女性为疾病患者,而杂合子女性因两条X染色体中一条随机失活,细胞G6PD的表达很不一致,可从正常到明显缺乏不等.
G6PD活性降低,使细胞的还原能力(NADPH和还原型谷光苷肽)缺乏,使血红素的亚铁离子,血红蛋白和其他结构蛋白的巯基被氧化而损伤.
2)临床表现 ①急性溶血性贫血:患者在疾病稳定期无贫血表现,只在某些诱导因素作用下才发生;②先天性非球性红细胞性溶血性贫血:其共同特点是体外酶活性降低,且极不稳定,溶血无明显诱因.患者在新生儿期即可有黄疸和贫血;③新生儿高胆红素血症多于出生后一周内发生黄疸;④蚕豆病:以儿童居多.发病具有明显的季节性(3~5月),患者具有进食新鲜蚕豆或哺乳期婴儿有母亲进食蚕豆史,摄入蚕豆后数小时至数天突然发生急性血管内溶血.
3)实验室检查与诊断 G6PD活性筛选试验有高铁血红蛋白还原试验,荧光斑点试验,硝基四氮唑蓝纸片法及Heinz 包涵体试验.有条件的应提倡使用G6PD活性定量试验.
阳性家族史.筛选试验中两项中度异常,或一项中度异常伴排除其它血红蛋白病后的Heinz包涵体试验阳性(>45%),或一项中度异常伴阳性家族史,或一项严重异常,或定量测定酶活性异常,即可确定诊断.
(4)免疫性溶血性贫血
1)定义 是一组由于红细胞表面结合抗体或/和补体而引起的溶血性贫血.包括自身免疫性(温抗体型和冷抗体型),同种免疫性(血型不合输血和新生儿溶血病)和药物免疫性(自身抗体型,免疫复合物型和半抗原型)溶血性贫血.其中温抗体型自身免疫性溶血性贫血是免疫性溶血中最常见的一种.
表8-6 自身免疫性溶血性贫血的诊断依据
温抗体型 冷抗体型
获得性溶血性贫血 获得性溶血性贫血
直接Coomb\'s 试验IgG 或/和C3 + 直接Coomb\'s试验IgG-/C3 +
4个月内无输血和特殊药物史 *寒冷时手足发绀
*冷凝集素效价>1:40
@冷热溶血试验+
注 *冷凝集素综合征 @阵发性冷性血红蛋白尿
2)临床特征 主要是贫血和不明原因的发热.本病如伴免疫性血小板减少称为Evans综合征.
3)检验与诊断 直接抗人球蛋白试验阳性是诊断免疫性溶血性贫血的依据.但是,其结果与溶血的严重程度之间没有关系.进一步的试验可以帮助分类:①同种免疫性溶血性贫血通过血型鉴定可以确诊;②药物性免疫性溶血常有明确的药物接触史,间接Coombs未加药物阴性,加药物后为阳性.③符合表8-6条件者可分别诊断为温抗体型或冷抗体型自身免疫性溶血性贫血.
(5)阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)
1)定义 是唯一的获得性的红细胞膜缺陷所致的溶血病.已证明本病为造血干细胞的糖化磷脂酰肌醇-锚(GPI-A)基因突变,使红细胞对补体的敏感性增加.
2)临床特征 ①慢性溶血性贫血;②特征性的,间歇性发作的睡眠后血红蛋白尿;③主要累及静脉系统的血栓形成;④感染和出血.
3)检验 ①几乎所有患者有贫血,多数Hb<60g/L,通常是大细胞性的,可见有核细胞和红细胞碎片;半数患者为全血细胞减少;②半数以上的骨髓三系细胞增生活跃,尤以红系造血旺盛为特征;不同穿刺部位增生程度明显差异,可呈增生低下;③尿含铁血黄素试验阳性;④溶血存在的实验室证据;⑤补体敏感的红细胞存在的证据.蔗糖溶血试验(筛选)阳性;热溶血试验(阴性可极大程度上排除PNH)阳性;酸溶血试验(确诊)阳性.
4)诊断 ①临床表现符合PNH;②证明有补体敏感的红细胞群存在.
(6)血红蛋白病
1)定义 是一组遗传性或基因突变所致的血红蛋白合成障碍性疾病.根据其缺陷的不同又分为珠蛋白肽连数目合成异常或结构异常两大类.前者被称为珠蛋白生成障碍性贫血, 是常染色体隐性遗传性疾病,包括常见的β-珠蛋白生成障碍性贫血和少见的α-珠蛋白生成障碍性贫血;后者被成为狭义的血红蛋白病,为常染色体显性遗传性疾病,如HbS,HbE和HbC等.
血红蛋白病代表了一种世界范围内最常见的遗传性疾病.珠蛋白生成障碍性贫血约有1.5亿基因携带者;HbS约有1亿基因携带者;HbE在南亚约有30%的基因携带者;HbC在西非约有25%的基因携带者.
各种血红蛋白的组成见表8-7.
2)β-珠蛋白生成障碍性贫血 由于β链合成减少,过多的α链:①使含α链的血红蛋白HbA2或/和HbF的增加;②在幼红细胞和红细胞中形成包涵体,使红细胞特别扁平,中间的血红蛋白稍多,而周边较少,形成靶形红细胞;③形成的α链包含体附着于红细胞膜,使红细胞僵硬,导致无效造血和溶血;④使红细胞对钾离子的通透性增加,能量代谢能力降低,生存期缩短.
根据β-链合成是部分或是完全缺如,分别称为β+-和β0-两种基因型.其基因型和表型(或疾病)之间的关系见表8-8.
表8-7 各种血红蛋白的肽链组成
血红蛋白种类 珠蛋白肽链组成
HbA α2β2
HbA2 α2δ2
HbF α2γ2
Hb Gower1 ζ2ε2
Hb Gower2 α2ζ2
Hb Porland γ2δ2
各型β珠蛋白生成障碍性贫血的临床表现和实验室结果的差异极大,详见表8-9.
表8-8 β-珠蛋白生成障碍性贫血基因型和表型(或疾病)的关系
表型/疾病 基 因 型
极轻型β-珠蛋白生成障碍性贫血 杂合子 β+/β
轻型β-珠蛋白生成障碍性贫血 杂合子 β+/β
β0/β
(δβ)0/β
(δβ)Lepore/β
中间型β-珠蛋白生成障碍性贫血 纯合子 β+/β+
(δβ)0/(δβ)0
双重杂合子 βo/(δβ)0
β+/(δβ)0
β0/(δβ)Lepore
β+/(δβ)Lepore
(δβ)0/(δβ)Lepore
(δβ)0/β
杂合子 β0/β
重型β-珠蛋白生成障碍性贫血 纯合子 β0/β0
β+/β+
(δβ)Lepore/(δβ)Lepore
双重杂合子 β0/β+
[诊断和鉴别诊断]
①重型β珠蛋白生成障碍性贫血:Ⅰ.多在出生后6~9个月出现贫血,发育障碍,智力受损,肝脾明显肿大,黄疸,骨骼改变,特殊\"地中海贫血面容\".需要输血治疗;Ⅱ.血红蛋白<70g/L,MCV48~72fl,;靶形红细胞在10%~30%,网织红细胞5%~15%,外周血可见有核红细胞;骨髓红细胞系统明显增生;HbA 为零或存在,HbF20%~95%,HbA2在纯合子时可以低,正常和增高.酸洗脱试验显示HbF分布相当异质
表8-9 β珠蛋白生成障碍性贫血的临床特征
项目 重型 中间型 轻型 极轻型
遗传学 纯合子 纯合子 杂合子 杂合子
双重杂合子 双重杂合子
临床严重性 ++++ +++/++ +/± ±/0
输血 定期 不需要 0 0
铁负荷 ++++ +++/++ ± 0
骨骼改变 ++++/+++ +++/0 +/0 0
脾 肿 大 ++++ ++/+++ +/0 0
黄疸 +++ ++/+ 0 0
贫血 100g/L ±
小细胞增多 +++ +++/++ + 0
低色素 ++++ +++/++ ++ +
靶形红细胞 10~35% ++ + ±
网织红细胞 5~15% 3~10% 2~5% 1~2%
0 没有异常;± 没有或极轻度异常;+ 轻度异常;+++/++++ 明显异常.
性;Ⅲ.双亲均为杂合子β+或β0珠蛋白生成障碍性贫血;或一方为杂合子β+,另一方为杂合子β0珠蛋白生成障碍性贫血;Ⅳ.患者珠蛋白肽链合成速率显示β/α降低(0~0.3),基因分析为纯合子β+或β0珠蛋白生成障碍性贫血,或双重杂合子β0/β+.
有慢性溶血性贫血的临床表现,HbF增加,能排除HbF增加的其他疾病,重型β珠蛋白生成障碍性贫血的诊断即成立.
②中间型β珠蛋白生成障碍性贫血:Ⅰ.多在2~5岁时出现贫血,症状和体征较重型轻,不需要输血;Ⅱ.血红蛋白70~100g/L,MCV明显降低,成熟红细胞形态与重型相似;网织红细胞3%~10%;偶见有核红细胞;HbA为零或存在,HbF20%~80%, HbA2量可减低,正常或增高;Ⅲ.双亲为β+或β0或其他类型珠蛋白生成障碍性贫血的杂合子;Ⅳ.珠蛋白肽链合成速率显示β/α比值降低,基因分析可知突变基因类因.
中间型珠蛋白生成障碍性贫血的特点是一些病例检查结果像重型,临床表现又不像.另一些病例检查结果像轻型,但临床表现又较重.他们包含着多种遗传学上不相同的疾病.具备重型β珠蛋白生成障碍性贫血的基本的诊断条件,但不需要输血,血红蛋白维持在70g/L以上,可诊断为本型珠蛋白生成障碍性贫血.
③轻型β珠蛋白生成障碍性贫血:Ⅰ.可有轻度贫血,无黄疸,偶见脾轻度肿大,无明显骨骼改变;Ⅱ.血红蛋白>100g/L;轻度小细胞,低色素,网织红细胞2%~5%,外周血无有核红细胞,HbA2>3.2%, HbF1%~6%;Ⅲ.双亲一方为杂合子β+或β0或其他类型珠蛋白生成障碍性贫血;Ⅳ.患者为杂合子β+或β0或其他类型珠蛋白生成障碍性贫血.
HbA2轻度增加,能排除HbA2增加的其他原因和缺铁性贫血,本并病的诊断即成立.
④极轻型β珠蛋白生成障碍性贫血:Ⅰ.偶见轻度贫血,无黄疸,无肝脾肿大,多为其他疾病做血液学检查时发现;Ⅱ.血红蛋白正常,偶见红细胞呈小细胞低色素,网织红细胞1%~2%;外周血无有核红细胞和靶形红细胞;HbA97%,HbA2<3.2%, HbF<1%;Ⅲ.双亲一方为杂合子β+或β0珠蛋白生成障碍性贫血;Ⅳ.患者珠蛋白肽链合成速率显示α/β为1.3左右;基因分析为杂合子β+珠蛋白生成障碍性贫血
本型诊断一般根据双亲的一方是正常的,另一方是HbA2升高的轻型β珠蛋白生成障碍性贫血而进行推断.珠蛋白肽链合成速率测定或基因分析可确诊.
3)α珠蛋白生成障碍性贫血
α珠蛋白生成障碍性贫血是由于α基因缺失所致的α链合成速度明显降低或几乎不能合成.在胎儿期过多γ链聚合形成γ4,即Hb Bart\'s.Hb Bart\'s与氧的亲和力高,在组织中放氧极少,常导致胎儿窒息死亡,或因胎儿水肿综合征在围产期死亡.出身后,由于γ链的合成逐步转化为β链,过多的β链聚合形成β4,即HbH.但因为HbH一般在30%以下,出生后能存活和成长.HbH是一种不稳定血红蛋白,形成小量的红细胞内包涵体,并易沉积在红细胞内;同时这种红细胞膜的通透性增高,红细胞膜易破碎,使红细胞的生存时间明显缩短,出现慢性溶血性贫血和骨髓造血代偿性增加.
α链合成部分缺如称为α+基因,完全缺如称为α0基因.α+基因表示为(-α),α0基因表示为(--).α珠蛋白生成障碍性贫血表型与基因型之间的关系见表8-10.
表8-10 α珠蛋白生成障碍性贫血基因型与表型(或疾病)的关系
表型/疾病 基因型
胎儿水肿综合征 纯合子α0 (--/--)
Hb H病 双重杂合子α0/α+ (--/-α)
轻型α珠蛋白生成障碍性贫血 杂合子α0 (--/αα)
纯合子α+ (-α/-α)
极轻型α珠蛋白生成障碍性贫血 杂合子α+ (-α/αα)
各型α珠蛋白生成障碍性贫血的临床表现和实验室结果见表8-11.
表8-11 α珠蛋白生成障碍性贫血的临床特征
项目 胎儿水肿综合征 Hb H病 轻型 极轻型
遗传学 纯合子α0/α0 双重杂合子α0/α+ 杂合子α0 杂合子α+
纯合子α+
胎儿/新生儿死亡 是
慢性溶血性贫血 相当于中间 轻度贫血 无临床和
型珠蛋白生成障碍性贫血 血液学异常
新生儿的Hb组成 Hb Bart\'s80~90% Hb Bart\'s20~40% Hb Bart\'s2~10% Hb Bart\'s0~2%
Hb H Hb H5~10%
Hb Portland HbF
一岁后Hb组成 Hb H 5~40% HbA270%, HbH5%~10%, Hb Portland 10%~15%;Ⅲ. 胎儿双亲均为杂合子α0珠蛋白生成障碍性贫血;Ⅳ.胎儿缺失4个α珠蛋白基因,基因型为--/--(纯合子α0珠蛋白生成障碍性贫血).
水肿胎儿,Hb Bart\'s>70%,能排除Rh或ABO血型不合所致的胎儿水肿,诊断即成立.
②血红蛋白H病:Ⅰ.出生后一岁左右逐步出现轻度贫血,轻度黄疸,肝脾肿大,骨骼改变,轻度\"地中海贫血\"面容;Ⅱ.血红蛋白70~80g/L,MCV,MCH均降低;新生儿:Hb Bart\'s20~40%,HbH 5%~10%,其余为HbF;大于6g个月或成人可见大量的HbH细胞(结晶紫染色有包涵体的细胞),HbH10%~20%;少量Hb Bart\'s或/和HbCS;Ⅲ.患者双亲一方为杂合子α+珠蛋白生成障碍性贫血,另一方为杂合子α0珠蛋白生成障碍性贫血;Ⅳ. 患者基因型为--/-α(混合杂合子α+α0).
血红蛋白电泳出现HbH带,能排除继发性HbH病,诊断即成立.
③轻型α珠蛋白生成障碍性贫血:Ⅰ.常无贫血;Ⅱ.轻度低色素和小细胞增多;新生儿脐血Hb Bart\'s 2%~10%,出生一年后消失;之后,HbH不存在,HbA250%),红细胞即发生镰形变.镰形变的红细胞易在血管内外被破坏而溶血.镰形变的红细胞也使血液的黏滞度增加,血流缓慢,引起血管堵塞.堵塞的血管加重组织缺氧和酸中毒,导致更多的红细胞镰形变.
镰形细胞贫血有纯合子和杂合子两种基因型,其临床和实验室特征见表8-12.HbS与其他血红蛋白病的双重杂合子,如Hb SC,Hb SE,Hb SD等统称为镰形变综合征.
[诊断] ①阳性家族史;②血红蛋白电泳或层析分析发现HbS;③血涂片上观察到镰形细胞改变有助于诊断.
表8-12 镰形细胞贫血的临床和实验室特征
血红蛋白病 基因型 临床表现 血红蛋白组成
镰形细胞贫血 纯合子(Hb SS) 一岁起病 HbS>90%
①慢性溶血性贫血 HbF<10%
②血管栓塞致疼痛 HbA2<3.2%
危象和多器官损伤
镰形细胞特征 杂合子(Hb AS) 无症状,罕见无 HbS35~45%
症状血尿 HbA297%
网织红细胞2~6% HbF0.5~2%
靶形红细胞>90%
偶见小球形红细胞
HbC特征 杂合子(Hb AC) 无症状 HbA2不能分离出
可出现血尿/阴茎异常勃起 HbC30~40%
靶形红细胞5~30% HbA50~60%
诊断依赖于血红蛋白电泳或层析发现HbC,阳性家族史很重要.
6)HbE病
是由于β链第26位上的谷氨酸被赖氨酸取代而形成的血红蛋白变异体,是第二种常见的血红蛋白病.80%的患者生活在东南亚.临床和实验室特征见表8-14.
表8-14 HbE的临床和实验室特征
血红蛋白病 基因型 临床表现 血红蛋白组成
HbE病 纯合子(Hb EE) 无或轻微贫血 HbA2不能分离出
明显的小红细胞 HbE92~95%
MCV55~65fl HbF正常或增加
靶形/细长红细胞
HbE特征 杂合子(Hb AE) 无症状 HbA2不能分离出
小红细胞MCV65fl HbE20~35%
靶形红细胞 其余为HbA
诊断依赖于血红蛋白电泳或层析发现HbE.
7)不稳定血红蛋白病
是由于维持血红蛋白分子稳定性特别重要的氨基酸被替换所致,这主要是涉及到血红素与珠蛋白之间的连接处.其基因型都是杂合子,遗传方式是常染色体显性遗传.不稳定血红蛋白变异体可自发或被氧化性物质诱导而形成红细胞内的变性珠蛋白小体,使红细胞寿命缩短.这组疾病的临床表现为慢性或药物诱导的溶血性贫血,Heinz包涵体和中暗褐色尿.
热变性试验和异丙醇沉淀试验都能可靠地检测出不稳定的血红蛋白
6.继发性贫血
继发性贫血即造血系统以外的全身性疾病导致的贫血.
(1)慢性感染或肿瘤性贫血
贫血是慢性感染或肿瘤性疾病的结果.以结核,类风湿关节炎,克隆氏病,亚急性细菌性心内膜炎,溃疡性结肠炎,肿瘤最为常见.约2/3患者是正细胞的,1/3的患者为小细胞的,虽有血清铁水平降低而储存铁增加.原因:①病原微生物或/和炎症组织释放的毒素使红细胞生成素释放减少;②吞噬细胞固定贮存铁,因此不能与转铁蛋白迅速进行交换,使铁被排除在正常的铁循环之外,而致血红蛋白和合成减少;③某些红细胞外在因素导致红细胞寿命缩短等.症状主要取决于原发病.
(2)慢性肝脏疾病所致贫血
一般为大细胞性.主要原因:①摄入和储存不足致营养性的叶酸或/和B12缺乏;②<B style=\'color:black;background-color:#ffff66\'>脾功能亢进和脂肪代谢障碍使红细胞破坏过多;③凝血因子合成减少所致的出血;④EPO减少使骨髓红细胞系统增生障碍等.临床上以肝病的临床表现为主,
(3)慢性肾脏疾病所致贫血
一般为中度贫血.以血清肾功能试验异常和EPO减少为特征.贫血原因:①肾小管周围细胞EPO的分泌减少;②抑制EPO活性的物增多.临床上表现为慢性肾功能不全的症状和体征.
(4)内分泌疾病所致贫血 内分泌疾病所致的贫血主要见于因垂体,甲状腺,肾上腺和性腺等疾病.在激素替代治疗以前很常见.目前,应用激素替代治疗后已罕见.临床表现以相应的内分泌腺的症状和体征为主.
第九章 恶性造血系统疾病的检查
1.急性白血病的FAB分型及各型的实验室诊断标准
(1)概念 急性白血病是造血干细胞的克隆性恶性疾病,其主要特征是异常的原始细胞及早期幼稚细胞(白血病细胞)在骨髓中大量增殖并浸润各种器官,组织,使正常的造血功能受抑.
(2)急性白血病的分型 传统的分类方法主要根据白血病细胞的形态学特征及化学染色将AL分为急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia, ALL)和急性非淋巴细胞白血病(acute non-lymphocytic leukemia,ANLL),两者可进一步分为若干亚型.
1)FAB分型 FAB分型是目前应用最广泛的一种急性白血病的分型方法,其主要依据是骨髓细胞形态学和细胞化学特征,尤其是原始细胞的数量和形态,规定原始细胞≥30%为急性白血病的诊断标准,并将急性白血病分为急性淋巴细胞性白血病(acute lymphocytic leukemia, ALL)和急性非淋巴细胞性白血病(acute non-lymphocytic leukemia, ANLL)或称急性髓性白血病(acute myeloblastic leukemia,AML)两大类,其中ALL有3个亚型(L1,L2,L3),ANLL有8个亚型(M0,M1,M2,M3,M4,M5,M6,M7).各亚型的特点见表9-1.
表9-1 急性白血病FAB分型
类型
分 型 依 据
ALL
L1
以小原淋巴细胞为主,胞体小而一致,胞浆量极少,核形多规则,染色质呈较粗颗粒,核仁小而不清楚.
L2
以大原淋巴细胞为主,胞体大小不均,胞浆量较多,核形不规则,常见凹陷或切迹,染色质颗粒较L1型细致,易见核仁.
L3
以原淋巴细胞为主,胞浆量较多染深蓝色,富含空泡,核形多规则,染色质呈细颗粒状,核仁明显.
AML
M0
急性髓细胞白血病极微分化型:原始细胞≥30%,无T,B淋巴系标记,至少表达一种髓系抗原,免疫细胞化学或电镜MPO阳性.
M1
急性粒细胞白血病未成熟型:骨髓中原粒细胞≥90%(非红系细胞),早幼粒细胞很少,中幼粒细胞以下阶段不见或罕见.
M2
急性粒细胞白血病部分分化型:骨髓中原始粒细胞占30%～89%(非红系细胞),早幼粒细胞及以下阶段粒细胞>10%,单核细胞20%(非红系细胞);③M4c 原始粒细胞既具粒细胞系,又具单核细胞系形态特征者>30%(非红系细胞);④M4e 除上述特点外,骨髓非红系细胞中嗜酸性粒细胞>5%,这些嗜酸性粒细胞较异常,除有典型的嗜酸颗粒外,还有大的(不成熟)嗜碱颗粒.
M5
急性单核细胞白血病:根据细胞分化成熟程度分为二种亚型,即①M5a(未分化型)骨髓中原始单核细胞≥80%(非红细胞系);②M5b(部分分化型) 骨髓中原始和幼稚单核细胞(非红系细胞)>30%,原单核细胞50%,且常有形态学异常,骨髓非红细胞系原粒细胞(或原始+幼稚单核细胞)Ⅰ+Ⅱ型>30%;若血片中原粒细胞或原单核细胞>5%,骨髓非红系细胞中原粒细胞或原始+幼稚单核细胞>20%.
M7
急性巨核细胞白血病:骨髓中原巨核细胞≥30%,电镜下血小板过氧化酶(PPO)阳性,外周血中有原巨核(小巨核)细胞,血小板膜蛋白Ⅰb,Ⅱb/Ⅲa或因子Ⅷ相关抗原(vWF)阳性
注:原始细胞:指不包括原始红细胞及小巨核细胞,原始细胞包括Ⅰ型和Ⅱ型,Ⅰ型为典型原始细胞,Ⅱ型胞质可出现少许细小嗜天颗粒.核质比例稍低,其他同Ⅰ型原始细胞.
2)免疫学分型 白血病细胞的表面上有大量的蛋白抗原,可以用单克隆抗体来识别,这些抗原和抗体系根据分化簇(CD)的号码来区分的.近年来采用急性白血病的一线单抗来筛选AML及T,B淋巴系白血病,用二线单抗进一步确定亚型.
①ALL免疫学分型 目前较常用将ALL分为T细胞系(占20%)和B细胞系(80%)两大型.T细胞系分前T-ALL和T-ALL两个亚群,二者都有CD7和TdT阳性,但前者CD2阴性,后者阳性.B细胞系ALL一般分为4个亚型.
②AML的免疫学分型 髓系相关抗原的表达反映了细胞的起源,在AML中,各亚型的细胞表面上也有粒细胞,单核细胞或其他细胞的抗原,当形态学,细胞化学的检查结果不明确时,这些标记有助于各亚型的诊断,并有助于混合白血病的诊断.
③细胞遗传学分型 细胞遗传学的发展,特别是高分辨分带技术和分子生物学技术的应用,已发现多数急性白血病患者有特异的染色体异常(如异位,缺失,倒位),已发现AML核型异常检出率达93%,大约90%以上ALL可检出克隆性核型异常,其66%为特异性染色体重排,染色体异常表现与急性白血病的关系已渐明确,因此,国际上结合白血病细胞形态学(M),免疫学(I)和遗传学(C)特点提出MIC分类法.
④分子生物学分型 白血病的基因改变,基因重排及融合基因的形成与白血病的发病机制,治疗及预后等关系极为密切,如AML-M3型,90%以上患者可见到t(15;17)(q22;q12)的染色体异常,17q上的维甲酸α受体和15q上的早幼粒细胞白血病基因发生易位,形成PML-RARα融合基因,是其特异性分子标志.
⑤WHO关于急性白血病的分类建议 WHO分类将AML分为四类,即①伴重现性遗传学异常的AML;②伴多系增生异常的AML;③治疗相关性AML和MDS;④不能按上述分类的AML.将ALL分为三类,即①前B-ALL;②前T-ALL;③BurKitt细胞白血病.
(3)急性白血病的诊断与疗效判断标准
1)急性白血病的诊断
急性白血病的诊断是形态学诊断为基础,结合免疫学,细胞遗传学和分子生物学检验的MICM综合性诊断,目前,仍以FAB分类标准对急性白血病进行诊断与分型,急性非淋巴细胞白血病分8型,急性淋巴细胞白血病分3型.各型诊断标准见表9-1.
2)急性白血病疗效判断标准
急性白血病患者经治疗后,大部分患者可获得完全缓解,但缓解后部分患者可复发,有些患者可达到临床治愈,具体标准见表9-2.
表9-2 急性白血病疗效判断标准(1987年11月制订)
1.缓解标准 (1)完全缓解(complete remission,CR):
骨髓象:原粒细胞Ⅰ型+Ⅱ型(原单+幼单或原淋+幼淋)≤5%,红细胞及巨核细胞系正常
M2b型:原粒Ⅰ型+Ⅱ型≤5%,中性中幼细胞比例在正常范围;M3型:原粒+早幼粒≤5%;M4型:原粒Ⅰ型+Ⅱ型,原单+幼单核≤5%;M6型:原粒Ⅰ型+Ⅱ型≤5%,原红+幼红以及红系细胞比例基本正常;M7型:粒,红两系比例正常,原巨及幼巨核细胞基本消失
血象:男性血红蛋白≥100g/L,女性及儿童血红蛋白≥90g/L,中性粒细胞绝对值≥1.5×109/L,血小板≥100×109/L,外周血分型中无白血病细胞
临床:无白血病浸润所致的症状和体征,生活正常或接近正常
(2)部分缓解(partial remission,PR):骨髓原粒细胞Ⅰ型+Ⅱ型(原单+幼单或原淋+幼淋)>5%≤20%;或临床,血象2项中有一项未达完全缓解标准者
(3)未缓解(non-remission,NR):骨髓象,血象及临床3项均未达上述标准者
2.复发标准 有下列三者之一者称为复发(relapse):①骨髓原粒细胞Ⅰ型+Ⅱ型(原单+幼单或原淋+幼淋)>5%且20%者;③骨髓外白血病细胞浸润者
3.持续完全缓解(continual complete remission,CCR) 指从治疗后完全缓解之日起计算,其间无白血病复发达3-5年者
4.长期存活 白血病确诊之日起,存活时间(包括无病或带病生存)达5年或5年以上者
5.临床治愈 指停止化学治疗5年或无病生存(disease free survived,DFS)达10年者
注:凡统计生存率时,应包括诱导治疗不足1疗程者.诱导治疗满1疗程以上的病例应归入疗效统计范围
(4)急性髓性白血病
急性髓性白血病(AML)是由于髓系造血干/祖细胞的恶性变,目前,仍以FAB协作组的诊断标准对其进行诊断与分型,该协作组将AML分为M0～M78个亚型,并规定骨髓中原始细胞必须大于非红系细胞的30%,还将原粒细胞分为二型,即Ⅰ型为典型原粒细胞,胞浆中无颗粒;Ⅱ型有原粒细胞的特征,胞浆量较少,有少量细小颗粒(我国原用的标准是一旦出现嗜天青颗粒就划分为早幼粒细胞).
1)急性髓细胞白血病微分化型(M0)
①血象 白细胞数可低可高,血小板减少或正常,伴正细胞正色素性贫血.
②骨髓象 骨髓有核细胞增生活跃,原始细胞>30%,可达90%以上,白血病细胞形态较小,亦可较大,核圆,核仁明显,胞质少,嗜碱性,无颗粒,亦可透明,无Auer小体,易误诊为ALL的L1或L2型,红系,巨核系有不同程度的增生减低.
③细胞化学染色 POX及SBB染色为阴性或阳性率<3%;PAS及特异性酯酶染色呈阴性或弱阳性.
④免疫学标志检测 髓系分化抗原CD13,CD34,CD14,CD15,CD11b中至少有一种阳性,不表达T,B系特异性抗原,可表达无系列特异性未成熟标志CD34,TdT,HLA-DR.
⑤遗传学和分子生物学检验 大多有染色体异常,但无特异性核型.
2)急性粒细胞白血病未成熟型(M1)
①血象 血红蛋白和红细胞下降明显,大部分患者血红蛋白90%,可见小原粒细胞(胞体小,与淋巴细胞相似,胞核圆形,核染色质呈细颗粒状,较正常原粒细胞密集,核仁1～2个,有伪足),须与淋巴细胞鉴别.早幼粒细胞少,中幼粒细胞及以下各阶段细胞罕见或不见.少数病例白血病细胞内可见Auer小体,核分裂细胞较多见.大多数病例幼红细胞及巨核细胞明显减少,淋巴细胞减少.
③细胞化学染色 POX染色至少有3%原粒细胞阳性.
④免疫学检验 本型往往显示HLA-DR,MPO,CD34,CD33及CD13阳性,CD11,CD15阴性.CD33阳性者CR率高,CD13阳性,CD33阴性者CR率低.
3)急性粒细胞白血病部分成熟型(M2)
国内将M2型分为M2a和M2b两种亚型.
【M2a型】
①血象 贫血显著,白细胞的改变与M1相似,以原始粒细胞及早幼粒细胞为主,血小板中度到重度减少.
②骨髓象 骨髓中原始粒细胞占30%～89%(非红系),早幼粒细胞以下阶段至中性分叶核粒细胞>10%,单核细胞30%),以异常的中性中幼粒细胞为主,且>30%,此种细胞形态明显异常,核浆发育显著不平衡,核染色质细致,疏松,有1～2个大而清楚的核仁,与原粒细胞的核结构相似,但胞浆中已有较多细小而分布较密集的特异性中性颗粒,胞体较大,核可不规则,胞浆丰富,易见空泡,在核凹陷区常有一淡染区.
③细胞化学染色 POX染色呈阳性或强阳性反应.
④免疫学标志 表达HLA-DR,MPO,CD13,CD33和CD57,其中CD33,CD13阳性率减低,而表达列成熟的髓系抗原CD15和CD11b.
⑤遗传学和分子生物学特征 t(8;21)染色体易位,可作为M2b基因的标志,其检出率高达90%,其最大特点是常伴有性染色体丢失.也有伴其他核型异常,如-9,-15,-18等.
4)急性早幼粒细胞白血病(M3)
①血象 血红蛋白,红细胞及血小板计数减少,大多数病例白细胞轻度增高,少数患者白细胞总数减少,此时患者的血象表现为全血细胞减少.分类以异常早幼粒细胞为主,可见少数原粒及其他阶段的粒细胞,Auer小体易见.
②骨髓象 多数病例增生明显或极度活跃,个别病例增生低下.分类以颗粒增多的异常早幼粒细胞为主,>30%(非红系细胞),此类细胞胞体大小不一,外形多不规则,胞核相对较小,但大小不一,常偏位,可为圆形或类圆形,常有凹陷,折叠或分叶,染色质细致,核仁1～3个,胞浆丰富,含有很多大小不等且密集的嗜天青颗粒,有的细胞为椭圆形,核在一端,另一端为异常颗粒,有的细胞胞浆可分为内外二层,内浆含大量颗粒,外浆透明蓝色而无颗粒,常形成伪足状或瘤状突起,部分病例早幼粒细胞胞浆中有Auer小体,有的病例一个细胞可有数至数十根,呈柴捆样排列,称为\"柴捆细胞\".根据胞浆中颗粒的大小又将M3型分为两种亚型:Ⅰ.M3a(粗颗粒型):颗粒粗大,密集或融合染深紫色,可掩盖核周围甚至整个胞核;Ⅱ.M3b(细颗粒型):胞浆中嗜苯胺蓝颗粒密集而细小,核扭曲,折叠或分叶,易与急单白血病混淆.
③细胞化学染色 POX染色呈阳性或强阳性反应.非特异性酯酶染色呈阳性反应,但不被氟化钠抑制,此为急单白血病鉴别的依据之一.
④免疫学标志 典型的免疫表型呈CD13,CD33阳性,CD34及HLA-DR阴性.故以髓系标志为主而HLA-DR为阴性者M3型的可能性大.CD34阳性的APL恶性细胞颗粒小和少,且易出现白细胞计数增高,预后较差.
⑤染色体及分子生物学检验 约70%～90%的APL具有特异性的染色体易位t(15;17),是APL特有的遗传学标志,t(15;17)染色体易位使17号染色体上的维甲酸受体α(RARα)基因发生断裂,与15号染色体上的早幼粒细胞白血病(PML)基因发生融合,形成PML-RARα融合基因.
5)急性粒-单核细胞白血病(M4)
①血象 血红蛋白和红细胞数为中度到重度减少,白细胞数可增高,正常或减少,可见粒及单核两系早期细胞,原单核和幼单核细胞有时可达30%～40%,且有较活跃的吞噬现象,而粒系早幼粒细胞以下各阶段均易见到.血小板呈重度减少.
②骨髓象 骨髓增生极度活跃或明显活跃,粒,单核两系同时增生,红系,巨核系受抑制.本病是一组异质性很强的疾病,至少包括两种类型:Ⅰ.异质性白血病细胞增生型:白血病细胞分别具有粒系,单核系形态学特征;Ⅱ.同质性白血病细胞增生型:白血病细胞同时具有粒系及单核系特征.此型部分细胞可见到Auer小体,浆细胞常增多.
原粒单和幼粒单核细胞的特征为核染色质细网状,核圆,易见凹陷,扭曲,折叠及分叶,核仁较明显,胞质丰富,呈浅蓝色或蓝灰色,有的可见大小不一的嗜苯胺蓝颗粒,部分可见特异性中性颗粒,成熟粒单细胞在形态上类似正常成熟单核细胞,但胞质内可见中性颗粒.
③细胞化学染色
Ⅰ.POX,SB染色:原单及幼单细胞呈阳性或弱阳性反应;而幼粒细胞呈阳性或强阳性反应.
Ⅱ.非特异性酯酶染色:应用α-醋酸萘酚为底物进行染色,原始和幼稚细胞呈阳性反应,其中原粒细胞不被氟化钠(NaF)抑制,而原单细胞可被NaF抑制.
Ⅲ.酯酶双重染色:可呈现醋酸萘酚酯酶阳性细胞,氯醋酸酶阳性细胞或双酯酶阳性细胞.
④免疫学检验 白血病细胞主要表达粒,单系抗原CD13,CD14,CD15,CD33,HLA-DR.
⑤遗传学及分子生物学检验 常累及11号染色体长臂的异常,包括缺失和易位,后者尤以t(9;11)(p21;q23)为多见.M4E0常有非随机16号染色体异常,主要表现为inv(16),del(16)和t(16;16)三种类型,伴inv(16)的M4E0患者CR率较高.
6)急性单核细胞白血病(M5)
①血象 血红蛋白和红细胞数中度到重度减少,大多数患者白细胞数偏低,分类可出现原单和幼单核细胞增多,血小板明显减少.
②骨髓象 骨髓增生极度活跃或明显活跃,原单加幼单细胞≥30%.M5a以原始单核细胞为主,≥80%;M5b骨髓中原始和幼稚单核细胞(非红系细胞)>30%,原始单核细胞30%,或见到巨大原始巨核细胞及小巨核细胞,小巨核细胞体积小,多数直径约10μm,少数达20μm,胞体圆形,边缘不整齐,呈云雾状或毛刺状,胞质蓝色不透明,着色不均,周围可有伪足样突起,核染色质较粗,偶见蓝染小核仁,幼稚巨核细胞也增多.巨核细胞分裂象多见,成熟巨核细胞少见.
③细胞化学染色 PAS阳性,呈大小,粗细不等的阳性颗粒,ANAE阳性,并可被氟化钠抑制,MPO及SBB染色阴性.
④免疫学检查 原始细胞上有vWF(von Willebrand factor)抗原和Ⅰb,Ⅱb/Ⅲa,Ⅲa糖蛋白.
⑤遗传学检验 染色体有inv(3)或del (3),+8,+21异常.
本型白血病因骨髓中常有纤维组织增生,故穿刺时往往干抽,须作骨髓活检,可发现原始和巨核细胞增多,网状纤维增加.
(5)急性淋巴细胞白血病
急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia,ALL) 是由于原始和幼稚淋巴细胞在造血组织中无限增殖所致的恶性血液病.本病可发生于任何年龄,以儿童及青壮年多见.其临床特征除有急性白血病的表现外,还易并发中枢神经系统白血病,尤其在完全缓解期发病率高.睾丸白血病及高尿酸血症并发率也高.
1)血象 多数病例白细胞总数增多,少数患者白细胞数可正常或减少,分类中原始及幼稚淋巴细胞增多,破碎细胞易见,中性粒细胞减少或缺如.大多数患者有不同程度的红细胞数和血红蛋白量的减少,常为正细胞正色素性贫血.血片中偶见红细胞大小不等,嗜碱性点彩或呈多染性,可见到少数幼红细胞.血小板常减少,约半数病例30%,常伴有形态异常,成熟淋巴细胞较少见.粒细胞系,红细胞系增生受抑,巨核细胞系显著减少或不见.根据其形态
学特征将ALL分为L1,L2和L3三个亚型.
3)细胞化学染色 主要用于协助形态学鉴别各类白血病,常用的白血病细胞化学染色反应见表9-3.
表9-3 急性白血病常用的细胞化学反应鉴别
急性淋巴细胞白血病
急性粒细胞白血病
急性单核细胞白血病
过氧化物酶(POX)
(-)
分化差的原始细胞
(-)～(+)
分化好的原始细胞
(+)～(+++)
(-)～(+)
糖原染色(PAS)
(+)成块或颗粒状
(-)或(+),弥漫性淡红色
(-)或(+)呈弥漫性淡红色或颗粒状
非特异性酯酶(NSE)
(-)
(-)～(+)NaF抑制不敏感
(+)能被NaF抑制
中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)
增加
减少或(-)
正常或增加
4)免疫学标志 急性淋巴细胞白血病的免疫标志检测临床应用较多,常用一线单克隆抗体诊断T或B系急淋与AML,再用二线单克隆抗体确定ALL各亚型.
5)染色体及分子生物学检验 大约有70%～90%的急淋有克隆性核型异常,其中60%以上为特异性基因重排,染色体的改变包括染色体数目异常和结构异常.
2. MDS,CML,MM,MH等恶性血液病的细胞形态学特点与诊断
(1)MDS
1)概念 骨髓增生异常综合征(myelodysplastic symdrome,MDS)是一种造血干细胞克隆性疾病,骨髓出现病态造血,外周血血细胞减少.
2)分类
①FAB协作组分类 根据骨髓中原始细胞的多少及外周血中原始细胞的有无将MDS分为5个类型,即难治性贫血(refractory anemia,RA);环形铁粒幼细胞难治性贫血(refractory anemia with ringed sidero blast,RARS);原始细胞过多难治性贫血(refractory anemia with excess blasts,RAEB);转化中的原始细胞过多难治性贫血(RAEB in transformation,RAEB-T);慢粒-单核细胞白血病(chronic myelomonocytic leukemia,CMML).
②WHO的分类 2000年世界卫生组织(world health organization,WHO)对原有的FAB分类作了修订,见表9-4.
表9-4 WHO对MDS的分类及其标准
类型
外周血
骨髓
难治性贫血
贫血
无原始细胞或罕见
仅有红系发育异常
原始细胞<5%,环状铁粒幼细胞<15%
难治性贫血
伴环状铁粒幼细胞(RARS)
贫血
无原始细胞
仅有红系发育异常
原始细胞<5%,环状铁粒幼细胞≥15%
难治性血细胞减少症
伴有多系发育异常
(RCMD)
血细胞减少(两系减少或全血细胞减少)
无原始细胞或罕见
无Auer小体
单核细胞<1×109/L
髓系中≥2个细胞系中发育异常的细胞≥10%
原始细胞<5%
无Auer小体
环状铁粒幼细胞<15%
难治性血细胞减少症
伴有多系发育异常和环状铁粒幼细胞(RCMD-RS)
血细胞减少(两系减少或全血细胞减少)
无原始细胞或罕见
无Auer小体
单核细胞<1×109/L
髓系中≥2个细胞系中发育异常的细胞≥10%
原始细胞<5%
无Auer小体
环状铁粒幼细胞≥15%
难治性贫血
伴原始细胞增多-1
(RAEB-1)
血细胞减少
原始细胞<5%
无Auer小体
单核细胞<1×109/L
1系或多系发育异常
原始细胞5%～9%
无Auer小体
难治性贫血
伴原始细胞增多-2
(RAEB-2)
血细胞减少
原始细胞5%～9%
有或无Auer小体
单核细胞<1×109/L
1系或多系发育异常
原始细胞10%～19%
有或无Auer小体
MDS,不能分类
(MDS-u)
血细胞减少
无原始细胞或罕见
无Auer小体
粒系或巨核细胞系1系发育异常
原始细胞<5
无Auer小体
MDS伴单纯del(5q)
贫血
原始细胞<5
血小板计数正常或增高
巨核细胞数正常或增加伴有核分叶减少
原始细胞90%,出现大量未成熟粒细胞,以中性中幼粒及晚幼粒细胞增多尤为突出,杆状和分叶核粒细胞也增高,尤其是嗜碱性粒细胞可高达10%～20%,是慢粒的特征之一,有助于其诊断且是与其它粒细胞增多的疾病相鉴别依据之一.淋巴细胞和单核细胞的比率减少,少数患者单核细胞也增高.随着病期进展,原始粒细胞可增多,加速期可>10%,急变期可>20%.
Ⅱ)红细胞和血红蛋白 在疾病早期,红细胞数正常或增多,以后逐渐出现贫血,一般为正常细胞性贫血,可有红细胞大小不均和异形,嗜多色性或点彩红细胞和有核红细胞.
Ⅲ)血小板 初诊断病例血小板正常或增多,有时可高达1000×109/L,加速期及急变期,血小板可减少.血小板形态可发生变异,偶见巨核细胞碎片或裸核.
Ⅱ.骨髓象 骨髓有核细胞增生明显至极度活跃,以粒细胞为主,红系细胞相对减少或受抑制,粒,红比值可高达10～50:1.主要是中性中幼,晚幼及杆状核粒细胞明显增多(原始粒细胞<10%,嗜酸,嗜碱性粒细胞增多.巨核细胞正常或增多,晚期减少.
本病的晚期可发生急性变(慢粒急变),又称原始细胞危象(blast crisis).大多数病例发展为急粒变,约占50%～60%,其次为急淋变,约20%～30%,少数患者可急变为单核细胞,红细胞,巨核细胞等类型急性白血病.此时的骨髓象特点为原始细胞明显增高,因慢粒急变时可发展成为任何类型急性白血病,故骨髓中原粒细胞(Ⅰ型+Ⅱ型)或原淋+幼淋,或原单+幼单等相应类型的原始和幼稚细胞增高,≥30%,嗜碱性粒细胞增高,红系,巨核系细胞均受抑制或减少.
骨髓活检病理切片见骨髓组织几乎完全为白血病细胞所浸润,而无脂肪组织.在疾病后期,部分病例出现局灶性骨髓纤维化.
Ⅲ.细胞化学染色 NAP阳性率及积分明显减低,甚至为0分.慢粒合并感染,妊娠及急变期,NAP积分可升高.治疗获得完全缓解时,若NAP活力恢复正常,提示预后较好.
Ⅳ.免疫学标志 慢粒急变后免疫标志表达较复杂,慢粒髓细胞变多表现CD33,CD13,CD15,CD14及HLA-DR阳性;淋巴细胞变有CD3,CD7,CD2,CD5,CD10,CD19,CD20,CD22及HLA-DR阳性;巨核细胞变可出现CD41a,CD41b及PPO阳性.
Ⅴ.血液生化 血清及尿中尿酸浓度增高,血清钾亦增高,主要是化疗后大量白细胞破坏所致.血清维生素B12浓度及其结合力显著增加,且与白血病细胞增多程度呈正比.血清乳酸脱氢酶,溶菌酶亦增高.
Ⅵ.染色体及分子生物学检验 细胞遗传学的发展,90%以上的慢性粒细胞白血病患者的血细胞中出现Ph染色体.1973年Rowley证实Ph染色体系第9号与22号染色体长臂末端相互易位后所形成.Ph染色体不仅出现于粒细胞,也出现于幼红细胞,幼稚单核细胞,巨核细胞及B细胞,少部分急性淋巴细胞白血病患者中也可出现,这表明本病的病变起源于多能干细胞,是干细胞克隆发生突变和肿瘤转化所致.
②诊断
根据CML的临床表现特征,血象,骨髓象,染色体核型分型及分子生物学技术对此病进行诊断与分期,具体标准见表9-5.本病主要与类白血病反应,骨髓纤维化,血吸虫病等疾病进行鉴别.
表9-5 慢性粒细胞白血病的诊断与临床分期标准
分期
诊 断 标 准
慢性期
具下列四项者诊断成立:
(1)贫血或脾大
(2)外周血白细胞≥30×109/L,粒系核左移,原始细胞(Ⅰ型+Ⅱ型)10%
(5)外周血嗜碱粒细胞>20%
(6)骨髓中有显著的胶原纤维增生
(7)出现Ph以外的其他染色体异常
(8)对传统的抗慢粒药物治疗无效
(9)CFU-GM增殖和分化缺陷,集簇增多,集簇和集落的比值增高
急变期
具下列之一者可诊断为本期:
(1)原始细胞(Ⅰ型+Ⅱ型)或原淋+幼淋,或原单+幼单在外周血或骨髓中≥20%
(2)外周血中原始粒+早幼粒细胞≥30%
(3)骨髓中原始粒+早幼粒细胞≥50%
(4)有髓外原始细胞浸润
此期临床症状,体征比加速期更恶化,CFU-GM培养呈小簇生长或不生长
2)真性红细胞增多症
①概念 真性红细胞增多症(polycythemia vera, PV)是一种原因未明的以红细胞异常增生为主的慢性骨髓增殖性疾病.
②诊断 目前国内诊断PV的标准如下.
Ⅰ.临床表现
Ⅰ)皮肤,黏膜呈绛红色,尤以两颊,口唇,眼结合膜,手掌等处为著;
Ⅱ)脾大;
Ⅲ)高血压或病程中有血栓史.
Ⅱ.实验室检查
Ⅰ)血红蛋白及红细胞计数增加(男性血红蛋白>180g/L,红细胞>6.5×1012/L,女性血红蛋白>170g/L,红细胞>6.0×1012/L);
Ⅱ)血细胞容量绝对值增加,51Cr标记法红细胞容量男性39ml/Kg,女性>27 ml/Kg;
Ⅲ)红细胞比容增高,男性≥0.54,女性≥0.50;
Ⅳ)无感染及其他原因引起白细胞计数多次>11.0×109/L;
Ⅴ)血小板计数多次>300.0×109/L;
Ⅵ)外周血中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)积分>100;
Ⅶ)骨髓象示增生明显活跃或活跃,粒,红与巨核细胞系均增生,尤以红系细胞为显著.
Ⅲ.能除外继发性红细胞增多症.
Ⅳ.能除外相对性红细胞增多症.
诊断真性红细胞增多症可有A,B两种方法,最好采用A法,确无条件测红细胞容量时,则采用B法.
A法:具有Ⅰ类中任何两项,加Ⅱ类中第Ⅰ)及第Ⅱ)项,再加Ⅲ类即可诊断本病.
B法:具有Ⅰ类中第Ⅰ)及第Ⅱ)项加Ⅱ类中第Ⅰ)项(标准改为男性多次血红蛋白≥200g/L,女性≥190g/L).此外,尚需具备第Ⅲ)项至第Ⅶ)项中任何四项,再加上Ⅲ类及Ⅳ类方可诊断本病.
3)原发性血小板增多症
①概念 原发性血小板增多症(essential thrombocythemia,ET)是一种原因不明的以巨核细胞异常增生,血小板持续增多为特征的骨髓增殖性疾病.
②诊断 诊断本病的基本条件是血小板计数增高,但须除外其他引起血小板增多的疾病,即可诊断本病,具体诊断标准如下.
Ⅰ.临床上可有出血,脾脏肿大,血栓形成引起的症状和体征.
Ⅱ.实验室检查符合:Ⅰ)血小板计数>1000×109/L;Ⅱ)血片中血小板成堆,有巨大血小板;Ⅲ)骨髓增生活跃或以上,或巨核细胞增多,体大,胞浆丰富;Ⅳ)白细胞计数和中性粒细胞增加;Ⅴ)血小板肾上腺素聚集反应可减低.
继发性血小板增多症是继发于多种疾病的反应性血小板增生性疾病,
临床上较为常见.
4)骨髓纤维化
①概念 骨髓纤维化(myelofibrosis,MF)是指骨髓造血组织被纤维组织所代替,而影响造血功能所产生的病理状态.
②诊断 目前国内诊断MF的标准如下:Ⅰ)脾明显肿大;Ⅱ)外周血象出现幼稚粒细胞和/或有核红细胞,有数量不一的泪滴状红细胞,病程中可有红细胞,白细胞及血小板的增多或减少;Ⅲ)骨髓穿刺多次\"干抽\"或呈\"增生低下\";Ⅳ)脾,肝,淋巴结病理检查示有造血灶;Ⅴ)骨髓活检病理切片显示纤维组织明显增生.上述第Ⅴ)项为必备条件,加其他任何两项,并能排除继发性MF及急性MF者,可诊断为慢性MF.
(3)多发性骨髓瘤
1)概念 多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是骨髓内单一浆细胞株异常增生的一种恶性肿瘤,属于成熟B细胞肿瘤.
2)骨髓象特点 骨髓有核细胞多呈增生活跃或明显活跃,浆细胞异常增生,并有质的异常.当浆细胞在10%以上,并伴有形态异常,应考虑骨髓瘤可能.瘤细胞在骨髓内可呈弥漫性分布,也可呈灶性,斑片状分布,故有时需多部位穿刺才能诊断.骨髓活检可提高检出率.瘤细胞的大小,形态和成熟程度有明显的异常,其形态特点与分型如下.
①形态特点 瘤细胞与浆细胞极为相似,但前者有下列特征:Ⅰ)瘤细胞大小不一,一般较大,形态呈明显的多变性,多呈堆集分布;Ⅱ)瘤细胞呈圆形,椭圆形或不规则形,胞核长圆形,偏位,核染色质疏松,排列紊乱,可有1～2个大而清楚的核仁;Ⅲ)胞质较为丰富呈中等量,染嗜碱性深蓝色,或呈火焰状不透明,常含有少量天青胺蓝颗粒和空泡;Ⅳ)有些瘤细胞含红色粗大的包涵体(Russel小体),大量空泡(桑椹细胞)及排列似葡萄状的浅蓝色空泡(葡萄状细胞);Ⅴ)骨髓瘤细胞过氧化物酶染色呈阴性反应.
②分型 1957年欧洲血液学会议将瘤细胞分为四型:Ⅰ)Ⅰ型 小浆细胞型 细胞较成熟,染色质致密,核偏位,胞质较丰富,此型分化良好的形态与正常成熟浆细胞相似;Ⅱ)Ⅱ型 幼稚浆细胞型 胞核染色质较疏松,细胞外形尚规整,核偏位,核/质比例1:1;Ⅲ)Ⅲ型 原始浆细胞型 核染色质疏松,如网状细胞,核可居中,有核仁,核/质比例显示核占优势;Ⅳ)Ⅳ型 网状细胞型 细胞形态非常多样化,核仁较大,较多,细胞分化不良者,则恶性程度高.
3)诊断 对本病的诊断,主要根据以下标准.
①骨髓中浆细胞>15%,并有异常浆细胞(骨髓瘤细胞)或组织活检证实为浆细胞瘤.
②血清中出现大量单克隆免疫球蛋白(M蛋白):IgG>35g/L;IgA>20g/L;IgD>2.0g/L;IgE>2.0g/L;IgM>15g/L或尿中单克隆免疫球蛋白轻链(本-周蛋白)>1.0g/24小时.少数病例可出现双克隆或三克隆性.
③无其他原因的溶骨病变或广泛性骨质疏松.
诊断IgM型MM时,除符合①项和②项外,尚须具备典型的MM临床表现和多部位溶骨病变.只有①和③项者属不分泌型MM,对仅有①和②项者(尤其骨髓中无原,幼浆细胞者),须除外反应性浆细胞增多和意义未明单克隆免疫球蛋白(MGUS).
(4)淋巴瘤
1)概念 淋巴瘤(lymphoma)是一组起源于淋巴结或其它淋巴组织的恶性肿瘤.
2)霍奇金病
①分类 恶性淋巴瘤的分类较为复杂,霍奇金病目前普遍采用1965年Rye会议的分类方法,表9-6.我国患者中混合细胞型最为常见,结节硬化型次之,其他各型较少见.
表9-6 霍奇金病组织学分型(Rye会议,1965)
类型
病理组织学特点
临床特点
1.淋巴细胞为主型
结节性浸润,主要为中小淋巴细胞,R-S细胞少见
病变局限,预后较好
2.结节硬化型
交织的胶原纤维,将浸润细胞分隔成明显结节,R-S细胞较大,呈腔隙型.淋巴细胞,浆细胞,中性及嗜酸性粒细胞多见
年轻发病,诊断时多为Ⅰ,Ⅱ期,预后相对较好
3.混合细胞型
纤维化伴局限性坏死,浸润细胞明显多形性,伴血管增生和纤维化.淋巴细胞,浆细胞,中性及嗜酸性粒细胞与较多的R-S细胞混同存在
有播散倾向,预后相对较差
4.淋巴细胞消减型
主要为组织细胞浸润,弥性纤维化及坏死,R-S细胞数量不等,多形性
多为老年,诊断时已达Ⅲ,Ⅳ期,预后极差
②分期 目前淋巴瘤的分期仍采用1971年Ann Arbor会议制定的分期法,此种方法主要运用HD,并于1989年在英国Colswolds召开会议上对原分期作了修改和补充,见表9-7.
表9-7 恶性淋巴瘤的分期(colswolds会议,1989)
分期
侵 犯 范 围
Ⅰ期
病变侵犯一个淋巴结区(Ⅰ)或一个淋巴组织(如脾,胸腺,咽淋巴环或一个淋巴结外部位ⅠE)
Ⅱ期
病变侵犯横膈同侧的2个或更多的淋巴结区(Ⅱ),(纵隔是一个部位;肺门淋巴结双侧受侵是2个部位),侵犯的解剖部位数目应标明(如Ⅱ2)
Ⅲ期
病变侵犯横膈两侧的淋巴结区,Ⅲ1:伴有或不伴有脾门,腹腔或门脉区淋巴结受浸;Ⅲ2:
伴有主动脉旁,髂窝,肠系膜淋巴结受侵
Ⅳ期
侵犯淋巴结(脾)以外的器官
A:无症状
B:发热,盗汗,体重减轻(6个月内下降10%以上)
X:巨块病变,纵隔肿物最大横径>胸廓内径1/3,淋巴结肿块最大直径>10cm
CS:临床分期 PS:病理分型
E:局限性孤立的结外病变,不包括肝和骨髓只有一个部位的病变(ⅠE),侵犯邻近的淋巴结
(ⅡE或ⅢE)
③诊断 本病的确诊依靠病理组织学检查.
3)非霍奇金淋巴瘤
①我国NHL工作分类 非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma,NHL)是恶性淋巴瘤的另一种类型.它包括多种形态,免疫表型,生物学规律.发展速度和治疗反应各不相同的类型.NHL分类甚为复杂,病理分类以1982年美国国立癌症研究所制定的\"国际工作分类\"(IWF)为基础,再加以免疫分型.我国目前采用的是1985年成都会议上拟定的NHL工作分类,表9-8.临床分期参照HD的分期方法.
表9-8 我国NHL工作分类方案(成都,1985)
低度恶性
中度恶性
高度恶性
1.小淋巴细胞性
2.淋巴浆细胞性
3.裂细胞性(滤泡型)
4.裂细胞性(弥漫型)
5.裂-无裂细胞性(滤泡型)
6.裂-无裂细胞性(弥漫型)
7.无裂细胞性(滤泡型)
8.无裂细胞性(弥漫型)
9.Burkitt淋巴瘤
10.免疫母细胞性
11.髓外浆细胞瘤(分化好)
12.髓外浆细胞瘤(分化差)
13.蕈样肉芽肿-Sezary综合征
14.透明细胞性
15.多形细胞性
16.淋巴母细胞性
17.组织细胞性
18.不能分类
②WHO 2000年对淋巴系统肿瘤分类 关于淋巴瘤的分类,WHO提出了新的分类方案,见表9-9.
表9-9 WHO 2000年对淋巴系统肿瘤新的分类
B细胞肿瘤
前B细胞肿瘤
成熟(外周)B细胞肿瘤
T和NK细胞肿瘤
前T细胞肿瘤
成熟(外周)T细胞肿瘤
霍奇金淋巴瘤
前B淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤(B-ALL)
慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤(B-CLL/SLL)
B细胞前淋巴细胞性白血病(B-PLL)
淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL)
脾边缘区B细胞淋巴瘤(±绒毛状淋巴细胞,SMZL)
毛细胞白血病(HCL)
浆细胞骨髓瘤/浆细胞瘤(PCM/PCL)
MALT型结外边缘区B细胞淋巴瘤(MALT-MZL)
淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤(±单核样B细胞瘤,MZL)
滤泡性淋巴瘤(FL)(分级Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ)
套细胞淋巴瘤(MCL)
弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBLc)
伯基特淋巴瘤/伯基特细胞白血病(BL/BCL)
前T淋巴母细胞淋巴瘤/白血病(T-LBL/ALL)
(前T急性淋巴母细胞性白血病,PTALL)
T细胞慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤(T-CLL/SLL)
T细胞前淋巴细胞性白血病(T-PLL)
T细胞颗粒淋巴细胞性白血病(T-LGL)
侵袭性NK细胞白血病(ANKCL)
成人T细胞淋巴瘤/白血病(ATCL/L)
结外NK/T细胞淋巴瘤,鼻型(NK/TCL)
肠病样T细胞淋巴瘤(ITCL)
肝脾γδT细胞淋巴瘤
皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤
蕈样霉菌病/Sezary综合征
间变性大细胞淋巴瘤(ALCL),T/裸细胞,原发皮肤型
外周T细胞淋巴瘤,无其他特征(PTCL)
血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤(AITCL)
间变性大细胞淋巴瘤(ALCL),T/裸细胞,原发全身型
A 结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤(NLPHL)
B 经典型霍奇金淋巴瘤
结节硬化型霍奇金淋巴瘤(NSHL)(1级和2级)
富含淋巴细胞的经典型霍奇金淋巴瘤(LRHL)
混合细胞型霍奇金淋巴瘤(MCHL)
淋巴细胞消减型霍奇金淋巴瘤(LDHL)
③诊断 病理组织学检查系确诊本病的依据.其特点为淋巴结正常结构消失,为肿瘤组织所取代;恶性增生的淋巴细胞形态呈异形性,无Reed-sternberg细胞;淋巴包膜被侵犯.
(5)慢性淋巴细胞性白血病
1)概念 慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia ,CLL)是一种恶性淋巴细胞增殖性疾病,以小淋巴细胞在血液,骨髓和淋巴组织中不断聚集为主要表现.
2)诊断 外周血淋巴细胞持续增高≥3个月,其淋巴细胞比例≥50%,绝对值≥5×109/L,骨髓中淋巴细胞≥40%,以成熟淋巴细胞为主,并排除病毒感染,结核,伤寒,传染性单核细胞增多症等其他引起淋巴细胞增多性疾病者,且在较长期连续观察下,仍无下降,结合临床,血象,骨髓象和免疫表型及遗传学改变,可诊断.
(6)恶性组织细胞病
1)概念 恶性组织细胞病(malignant histiocytosis,MH,简称恶组)是单核-吞噬细胞系统的恶性增生性疾病.
2)骨髓象 骨髓涂片中大多数仍可见各系正常造血细胞.其中可见到形态异常的组织细胞,这是本病最重要的特征.这类细胞呈多少不一的散在或成堆分布,由于病变分布不均,故多次多部位骨髓穿刺可提高阳性检出率.
根据恶性组织细胞形态学特征,可有以下五型,.
①异常组织细胞:细胞大小不等,形态畸异.核圆形,椭圆形,或不规则形,有时呈分支状,偶有双核者.染色质呈细致网状,核仁显隐不一,有的较大.胞浆较丰富,着色深蓝或浅蓝,深蓝者常无颗粒,浅蓝者可有数目不等的小颗粒,并可出现空泡.
②多核巨细胞 这类细胞与异常组织细胞基本相似,其不同点是体积巨大,直径50～95μm,外形极不规则.含有多个核或呈分叶状,核仁显隐不一,胞质浅蓝,无颗粒或有少数颗粒.
③淋巴样组织细胞 大小及外形类似淋巴细胞或内皮细胞.细胞呈椭圆形,圆形,不规则形或窄长弯曲如拖尾状.胞核常偏于一侧,染色质较细致,偶见核仁,胞质浅蓝色,有时可含细小颗粒.
④单核样组织细胞 形似单核细胞,但核染色质较粗或着色较深,胞质浅蓝色,有时含细小颗粒.
⑤吞噬性组织细胞 胞体很大,单个核或双核,核圆形或椭圆形,偏位,染色质疏松,核仁大而清晰.胞质中含有被吞噬的成熟红细胞,幼稚红细胞,血小板,中性粒细胞及血细胞残片,被吞噬红细胞可达20余个.
3)诊断
①临床表现 长期发热,以高热为主,伴进行性全身衰竭,淋巴结,脾,肝进行性肿大,还可有黄疸,出血,皮肤损害和浆膜腔积液等,病情凶险,预后不良.
②实验室检查
Ⅰ.全血细胞进行性减少,血片中可有少量异常组织细胞和有核红细胞;
Ⅱ.骨髓涂片发现数量不等的多种形态的不正常组织细胞,异常组织细胞及/或多核巨组织细胞是诊断本病的细胞学主要依据.
③骨髓或肝,脾,淋巴结及其他受累组织的病理切片中可见各种异常组织细胞浸润,这些细胞呈多样性,混杂存在,成灶性或片状,松散分布,极少形成团块,组织结构可部分或全部破坏.
凡具有上①加②或①加③,且能排除反应性组织细胞增多症者可诊断本病.
(7)其它少见的恶性血液病
1)急性混合型细胞白血病 急性混合型细胞白血病(acute mixed-linage leukemia,AMLL)是髓细胞和淋巴细胞系共同累及的具有独特的临床生物学持征的一类白血病,又名急性杂合性白血病(hybrid acute leukemia).
2)嗜酸性粒细胞白血病 嗜酸性粒细胞白血病(eosinophilic leukemia)是一种罕见的白血病,以嗜酸粒细胞恶性克隆性增生为特征.
3)嗜碱性粒细胞白血病 嗜碱性粒细胞白血病(basophilic leukemia)是一种罕见类型白血病,大多数病人来自慢性粒细胞白血病进展期,可有Ph染色体,t(9;22)(q34;q11)似慢粒急变期,为慢粒急变型.
4)浆细胞白血病 浆细胞白血病(plasma cell leukemia,PCL)是少见类型的白血病之一.临床上分为原发性浆细胞白血病和继发性浆细胞白血病.原发性浆细胞白血病是一种独立细胞类型的白血病,其特征为异常白细胞广泛浸润,可遍及全身各组织,并常伴有出血和淀粉样变,引起脏器肿大或功能障碍,临床表现有贫血,高热,皮肤及黏膜出血,多脏器浸润,肝,脾肿大,若病变侵犯胸膜,可有胸水,胸水内可见大量浆细胞,若侵犯心脏可发生心律紊乱,心力衰竭等.继发性浆细胞白血病主要来自多发性骨髓瘤,慢性淋巴细胞白血病,巨球蛋白血症等,其白血病病理改变和临床表现与原发性浆细胞白血病基本相似.
5)原发性巨球蛋白血症 原发性巨球蛋白血症(primary macroglobulinemia)是B淋巴细胞恶性增生性疾病,恶变细胞合成并分泌大量单克隆免疫球蛋白,血中IgM增高为特征的一种疾病.1944年Jan Waden strom首先描述本病特征,故称Waldenstrom巨球蛋白血病(WM).
6)重链病 重链病(heavy chain disease)是恶性浆细胞病的一种,其特征是产生球蛋白的B细胞-浆细胞恶性增生伴有单克隆不完整(仅有重链而无轻链)免疫球蛋白合成与分泌.
7)多毛细胞白血病 多毛细胞白血病(hairy cell leukemia,HCL)是一种慢性淋巴组织增殖性疾病,来源于B细胞系.
8)幼淋巴细胞白血病 幼淋巴细胞白血病(prolymphocytic leukemia,PLL)是一种特殊类型的淋巴细胞白血病,临床上很少见,其发病率约为CLL的10%,大部分的幼稚淋巴细胞来源于B细胞.
9)成人T细胞白血病 成人T细胞白血病(adult T-cell leukemia,ATL)是一种少见的特殊类型的T细胞受累的淋巴细胞白血病.本病有明显地区性,主要在日本西南部,加勒比海地区和非洲中部三大地区流行,我国于1985年首次报道在福建沿海地区流行.本病好发于成年人,以中,老年为主,男性多于女性.
第十章 非恶性白细胞疾病的检查
1.白细胞减少与粒细胞缺乏症
(1)白细胞减少症和粒细胞缺乏症的概念:白细胞减少症是由各种病因引起的外周血白细胞持续低于对应参考值(成人白细胞数低于4.0×109/L,小于10岁的儿童白细胞数低于5.0×109/L)的一组综合征.当中性粒细胞低于2.0×109/L时为粒细胞减少症;低于0.5×109/L时为粒细胞缺乏症.引起粒细胞减少的的病因和发病机制主要为:粒细胞的增殖或成熟障碍;粒细胞破坏和消耗过多以及粒细胞分布异常所至的假性粒细胞减少.
(2)白细胞减少症和粒细胞缺乏症的血象和骨髓象特征:白细胞减少症外周血白细胞计数小于4.0×109/L,粒细胞减少症时中性粒细胞绝对值小于2.0×109/L.同时,淋巴细胞相对增多,有时单核细胞也相对增多.粒细胞缺乏症时,粒细胞绝对值低于0.5×109/L.在粒细胞明显减低或缺乏时,粒细胞可出现中毒颗粒,空泡及细胞核固缩等形态学改变.而红细胞和血小板的数量和形态多正常.骨髓象中有核细胞多增生活跃,但粒细胞系细胞增生不良或成熟障碍,粒细胞数量明显减少,可见原粒及早幼粒细胞,缺乏成熟阶段的粒细胞,幼粒细胞可伴退行性变.红细胞系及巨核细胞系多正常.淋巴细胞,浆细胞可相对增加.
(3)白细胞减少症和粒细胞缺乏症的实验室诊断:白细胞减少症的诊断标准为外周血白细胞持续低于对应参考值低限时为白细胞减少症,成人白细胞数低于4.0×109/L,≥10岁的儿童白细胞数低于4.5×109/L,50×109/L 中幼粒,早幼粒甚至 各种感染,恶性肿瘤
原始细胞出现 严重外伤等
淋巴细胞型 常(20-30)×109/L 淋巴细胞>40% 某此病毒感染,
可见幼稚淋巴细胞和 粟粒性结核,猩红
异型淋巴细胞 热,胃癌等
嗜酸性粒细胞型 >20×109/L 嗜酸性粒细胞>20% 寄生虫病,过敏性疾
病,风湿病等
单核细胞型 常>30×109/L 单核细胞>30% 粟粒性结核,感染性
偶见幼单核细胞 心内膜炎,细菌性痢
疾,斑疹伤寒等
(2) 类白血病反应的实验室检查:①血象:白细胞常显著增多,但一般不超过120×109/L,不同类型的白细胞出现数量异常及形态异常(中毒颗粒,空泡,核固缩).红细胞和血小板无明显变化.②骨髓象:类白血病反应骨髓象改变不大,可与白血病进行行鉴别.③其他检查:可通过中性粒细胞碱性磷酸酶活性和积分(明显增高),Ph染色体(阴性)以及组织活检等检查排除白血病.
【本章节要点】掌握类白血病反应的特点对疾病进行诊断,并注意排除白血病及骨髓增生异常综合征.白血病及骨髓增生异常综合征除外白细胞系的改变外红细胞系和/或巨核细胞系常有异常.且通过细胞化学染色和染色体的检查可进一步进行鉴别.
3.传染性单核细胞增多症
(1)传染性单核细胞增多症的概念:传染性单核细胞增多症(传单)是一种由EB病毒引起的急性或亚急性的淋巴细胞增生性疾病.其典型的临床表现为不规则发热,咽峡炎和淋巴结肿大.
(2)传染性单核细胞增多症的实验室检查:传染性单核细胞增多症的血象检测是本病的初筛实验和诊断标准之一,而血清学检查是疾病的特异性诊断指标,骨髓象检查主要用于鉴别诊断.
血象中白细胞多增多或正常,淋巴细胞比例增高,异型淋巴细胞超过10%.异型淋巴细胞主要为T细胞,少数为B细胞,Downey将其分为三型:泡沫型或浆细胞型,不规则型号或单核细胞型,幼稚型或幼淋巴细胞样型.
骨髓象淋巴细胞增多或正常,可见异型淋巴细胞但不及外周血多,组织细胞可增生.骨髓象检测不作为诊断的标准,主要用于疾病的鉴别.
血清学检查应用嗜异性凝集实验检测传染性单核细胞增多症患者血清中存在的嗜异性抗体(该抗体属于IgM,能使绵羊和马红细胞凝集,故称嗜异性凝集素),本实验检测患者血清中绵羊红细胞凝集的滴定度大于1:224.抗EB病毒抗体测定对诊断具有特异性.抗体的测定方法多为间接免疫荧光法.抗体的血清学变化见表10-2.可见发病早期检测抗病毒壳蛋白抗体(VCA),病程后期可检测抗EB核抗原(EBNA)抗体或抗早期抗原(EA)抗体.
表10-2 抗EB病毒抗体的血清学变化
状态 VCA-IgM VCA-IgG EA-IgG EBNA-IgG
从未感染 — — — —
无症状感染 + + +/- +
急性期 + ++ + —
恢复期 +/- + +/- +
4.朗罕细胞组织细胞增生症
(1)朗罕细胞组织细胞增生症的定义:朗罕细胞组织细胞增生症(LCH)是一组原因未明的组织细胞增生性疾病.其同共特点为病变组织中朗罕细胞(LC)病理性增生.X线检查多见溶骨性骨质破坏.
(2)朗罕细胞组织细胞增生症的实验室诊断:本病的实验室诊断依据为病理活检,免疫组织化学检查可作为确诊条件.本病患者的血象和骨髓象无特殊异常.以不同程度贫血多见,而骨髓象大多增生正常,仅在外周血象异常时再做骨髓象检查.
此症确诊的关键在于病理活检发现朗罕细胞的组织浸润.可做皮疹,淋巴结或病灶局部穿刺物或刮出物病理检查.为确诊朗罕细胞可作免疫组织化学染色,此类细胞且有Cdla的免疫表型且对S-100神经蛋白,ATP酶,α-D-甘露糖酶和花生凝集素可呈阳性反应.
5.类脂质沉积病
类脂质沉积病是一组较罕见的遗传性类脂代谢紊乱性疾病.由溶酶体中参与类脂代谢的酶缺乏引起,不同酶的缺乏导致鞘脂类不能分解而以各种神经酰胺衍生物沉积于全身各组织而引起各种疾病.较常见的有戈谢病和尼曼-匹克病.
(1)戈谢病的特点及实验室诊断:戈谢病又称为葡萄糖脑苷脂病,为β-葡萄糖苷脂酶活力明显降低,导致葡萄糖脑苷脂在单核-吞噬细胞内大量蓄积所引起的常染色体隐性遗传性疾病.所累的器官有脾,肝,骨髓及淋巴结.
戈谢病的实验室检查主要为骨髓涂片镜检及淋巴结,脾,肝穿刺或印片镜检可见数量不等的形态特殊的戈谢细胞.此类细胞体大,形态为卵圆形或不规则形;胞核较不偏位,1-3个或更多,染色质粗糙,偶见核仁;胞质丰富,含有大量与细胞长轴平行的粗暗条纹样结构,交织成网,如洋葱皮样或蜘蛛网状.戈谢细胞的糖原,酸性磷酸酶及苏丹黑B染色阳性或强阳性,过氧化物酶和碱性磷酸酶染色阴性.而β-葡萄糖脑苷脂酶的活性测定对诊断有决定性意义.
(2)尼曼-匹克病的特点及实验室诊断:尼曼-匹克病又称为鞘磷脂病,为组织中鞘磷脂酶明显缺乏所致单核-吞噬细胞系统和其他组织的细胞中鞘磷脂积聚的常染色体隐性遗传性疾病.
尼曼-匹克病的实验室诊断主要是骨髓,肝,脾和淋巴组织中可见成堆的尼曼-匹克细胞.此类细胞胞体大,圆形,椭圆形或三角形;核较小偏位,1-2个;胞质丰富,内有大量泡沫状的颗粒,故又称\"泡沫细胞\".尼曼-匹克细胞PAS染色空泡壁呈弱阳性,脂类染色阳性,酸性磷酸酶,碱性磷酸酶染色为阴性.
戈谢细胞与尼曼-匹克细胞的比较:
表10-3 戈谢细胞与尼曼-匹克细胞的区别
戈谢细胞 尼曼-匹克细胞
胞体 大,直径20-100μm 大,直径20-90μm
胞核 可多个,染色质较致密 常1个,染色质较疏松
胞质 丰富,呈洋葱皮样或网状 丰富,呈空泡状或泡沫状
含葡萄糖脑苷脂 含神经鞘磷脂
吞噬现象 有 无
细胞化学染色
糖原 强阳性 仅空泡壁呈弱阳性
酸性磷酸酶 强阳性 阴性
6.脾功能亢进
(1)脾功能亢进的概念:脾功能亢进是指原因不明或继发于不同疾病的脾肿大和血细胞减少的综合征.其临床特点为脾大,血细胞减少而骨髓造血细胞相应增生,脾切除后血象有好转或恢复正常.
(2)脾亢的诊断依据:经查体及影像学检查证实的脾肿大;外周血至少有一类细胞减少;骨髓增生活跃或明显活跃,可出现轻度造血细胞成熟障碍;脾切除后可使外周血接近或恢复正常;51Cr标记红细胞或血小板注入体内后,检测提示血细胞在脾内过度破坏或滞留.
第十一章 血栓与止血疾病的检查
1.血管性紫癜的概述和检验
血管性紫癜是指血管壁通透性或脆性增加所引起的紫癜,包括过敏性紫癜,单纯性紫癜,老年性紫癜,遗传性出血性毛细血管扩张症等.
(1)过敏性紫癜
[概述] 过敏性紫癜(allergic purpura,AP)是一种常见的血管变态反应性出血性疾病,本病又称出血性毛细血管中毒症或许蓝-享诺(Schonlein-Henoch)综合征.由于机体对某些致敏原引起速发型变态反应和抗原-抗体复合物反应,损害了小血管,引起广泛的毛细血管炎,甚至出现坏死性小动脉炎,使血管壁通透性和脆性增高,导致皮下组织,黏膜下组织及内脏器官出血,水肿.
本病的致敏原种类有细菌,病毒,寄生虫,高蛋白质的食物,药物,寒冷,花粉等.多见于儿童及青少年多见,春秋季发病居多.起病前1～3周常有上呼吸道感染史,临床表现随着病变的部位不同而异,最常见的首发症状为皮肤紫癜,有的以关节肿胀,疼痛或腹痛或肾炎为主要临床表现,因此临床上根据病变累及部位分为五型:单纯紫癜型,关节型,腹型,肾型,混合型(指存在前四型中的两型或二型以上).
[检验] 本病实验室检查可由以下方面的异常,但缺乏特异性.外周血白细胞数可增加,嗜酸性粒细胞增加;束臂试验阳性;血清IgA和IgG常增高;血管免疫荧光检查可见IgA 或C3沉积,此对确诊本病较有价值.
(2)其他血管性紫癜
1)单纯性紫癜
单纯性紫癜(purpra simplex) 多见于青春期女性,自诉常无受外伤情况下而在大腿,臀部及上臂出现大片瘀斑,压之不痛或隐痛,一般无黏膜出血.瘀斑常反复发作,不经治疗可自行消退,预后良好,一般认为与血管脆性增高有关.
2)老年性紫癜
老年性紫癜见于老年人,尤其是伴有营养不良者为多见.本病是由于血管脆性增加,胶原组织和脂肪组织萎缩,松弛所致.在无外伤的情况下出现瘀斑,多见于面部,前臂,手背等部位,特别在阳光爆晒下尤其易发,瘀斑吸收慢,且反复发作.
3)遗传性出血性毛细血管扩张症
[概述] 遗传性出血性毛细血管扩张症(hereditary hemorrhagic telangiectasia,HHT)是一种少见的常染色体显性遗传性疾病.主要病理缺陷是部分毛细血管壁中层缺乏弹力纤维及或平滑肌.本病的主要临床表现为上半身皮肤,颜面及唇,舌,口腔,齿龈,鼻腔等黏膜毛细血管扩张,呈红色或暗红色,压之退色;而且反复同一部位的出血,病情随年龄增加加重,幼年时多见鼻衄,齿龈出血,成年后有消化道,泌尿道,呼吸道出血.
[检验] 血液学检查无特异性异常.初期止血检查可异常(CFT阳性,甲皱毛细血管镜检查异常BT延长);病变部位组织病理学检查可见毛细血管壁缺乏弹力纤维和或平滑肌是确诊的佐证.
2.血小板减少症的概述和检验
血小板减少症是指血小板数量减少所引起的疾病,包括特发性血小板减少性紫癜,新生儿同种免疫性血小板减少性紫癜,输血后紫癜,血栓性血小板减少性紫癜-溶血性尿毒症综合症等.
(1)特发性血小板减少性紫癜
[概述] 特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP)是一种常见的疾病,由于存在抗血小板抗体导致血小板破坏增加,使血小板减少的疾病. 目前多数认为与自身免疫有关,所以又称为自身免疫性血小板减少性紫癜,以前由于病因不明称为原发性血小板减少性紫癜,少数病人合并自身免疫性溶血性贫血,即成为伊文氏综合征(Evans syndrome).
根据起病情况及病程长短分为急性型ITP和慢性型ITP.急性型ITP病因为风疹,水痘,麻疹,流行性腮腺炎,传染性单核细胞增多症等.
急性型多见于3～7岁婴幼儿,男女发病率相近.起病前l一3周常有呼吸道感染史,因此秋冬季发病最多.起病急骤,可有发热,皮肤紫癜,黏膜和内脏出血等,少数有颅内出血,脾脏常不肿大.病程多为自限性,多数在半年内自愈,少数迁延而转为慢性.
慢性型多见于青壮年,以女性为多见,男,女发病率为1:3～4.起病隐匿,症状较轻,主要表现为皮肤紫癜,黏膜出血及月经量增多,脾脏不肿大或轻度肿大.
[检验]
1)血象 血小板数持续下降或明显下降,急性ITP在20×109/L以下,慢性ITP为(30～80)×109/L,平均血小板体积(MPV)及血小板分布宽度(PDW)增加.血液涂片上可见大血小板,巨大血小板,畸形血小板,胞质中颗粒减少及幼稚血小板.
2)骨髓象 骨髓增生活跃至明显活跃,巨核细胞系统增生或明显增生伴成熟障碍(即产血小板型巨核细胞明显减少或缺如,而且血小板也明显减少).有时巨核细胞可见胞体小,核不分叶等形态改变,粒细胞系统,红细胞系统一般无明显异常.
3)血小板相关抗体,补体检测 急性ITP患者血小板相关抗体(PAIgG,PAIgM,PAIgA)均可增高,其中PAIgG增高者占95%.慢性型可伴有血小板相关补体(PAC3,PAC4)的增高.
4)其它检查 血小板寿命缩短(急性型为1～6小时,慢性型为12～48小时),血小板对ADP增强或下降,出血时间可延长,血块收缩不良,束臂试验阳性等.
(2)同种免疫性血小板减少性紫癜
1)新生儿同种免疫性血小板减少性紫癜
[概述] 新生儿同种免疫性血小板减少性紫癜(neonatal alloimmune thrombocytopenia,NAT)是由于孕妇与胎儿的血小板同种抗原不合所致的血小板减少性疾病.胎儿血小板膜上有来自父亲的某一抗原,但孕妇无此抗原,当胎儿血小板通过胎盘进入母体后,母体即可能产生该抗原的抗体使血小板减少.新生儿在出生时通常正常,但产后数小时后开始出现全身散在的出血点和紫癜,并常有消化道或泌尿道出血.
[检验] 外周血血小板数量明显减少(常低于30×109/L以下);新生儿的母亲血中可检测到抗新生儿的血小板抗体.
2)输血后紫癜
[概述] 输血后紫癜(post-transfusion purpura,PTP) 是指输血后引起的急性免疫性血小板减少性紫癜.患者输注含血小板成份的血液后,患者突然出现血小板减少,可能是缺乏某种血小板特异抗原的受者接受了该抗原阳性的血液后产生的同种免疫反应,导致本病的致敏抗原90%以上为PLA1.病人有不同程度皮肤,黏膜出血.
[检验] 外周血血小板数常小于10×109/L;用经氯喹处理的血小板免疫荧光试验等方法可检测到特异的血小板同种抗体.
(3)血栓性血小板减少性紫癜-溶血性尿毒症综合征
[概述] 血栓性血小板减少性紫癜-溶血性尿毒症综合征(thrombotic thrombocytopenic purpura-hemolytic uremic syndrome,TTP-HUS)是一种临床上较少见且病因,机理不明的血栓性微血管病(thrombotic microangiopathies,TMA).以前认为TTP和HUS是两种不同的疾病,但大量研究表明两者发病机理相似,不能绝对分开,而是同一疾病的不同临床表现,因此称为TTP-HUS.本病的典型病理改变为微动脉和毛细血管透明血栓形成(主要由血小板和少量纤维蛋白组成), TTP病变累及全身所有器官, HUS病变主要累及肾脏.
典型者的临床表现为TTP五联症和HUS三联症.TTP五联症是指发热,中枢神经系统损害症状,微血管病性溶血性贫血,出血及肾功能损害,HUS三联症即TTP五联症中的后三者.根据临床表现的不同可将本病分为三型:①腹泻型HUS:多数是由于感染大肠杆菌O127 ,H7等所致,常以血性腹泻为前驱症状,好发于婴幼儿;②非腹泻型HUS:多数为原发性的,常有轻度病毒感染的前驱症状,多见于成年人;③TTP:常具有TTP五联症,以神经系统症状最为明显,多见于成年人.
[检验] 外周血血小板数多数在20×109/L以下,白细胞数正常或增加,Hb常降低,血涂片中见碎裂的红细胞和网织红细胞数明显增高;血小板寿命及红细胞寿命缩短等.
(4)继发性血小板减少性紫癜
继发性血小板减少性紫癜(secondary thrombocytopenic purpura)又称获得性血小板减少症,是指继发于全身性疾病引起血小板破坏增加或消耗增加或生成障碍所致的血小板减少紫癜,涉及的病种相当多.
1)药物性免疫性血小板减少性紫癜
临床上有数百种药物可引起血小板减少,常见的有肝素,奎宁,喹尼丁,利福平,青霉素,头孢菌素,磺胺类,阿司匹林,消炎痛,保泰松,扑热息痛,安定,苯妥英钠,卡马西平,速尿,甲基多巴,磺脲类等.
2)感染性血小板减少性紫癜
EB病毒,微小病毒B19,流行性腮腺炎病毒,麻疹病毒,巨细胞病毒HIV-1及某些细菌等感染可引起血小板减少,感染引起的血小板减少机制包括血小板直接被破坏,骨髓造血功能抑制,免疫反应等.
3)其他继发性血小板减少性紫癜
多种疾病可导致血小板减少,如白血病,恶性淋巴瘤,多发性骨髓瘤,恶性组织细胞病,骨髓增生异常综合征,骨髓纤维化,巨幼细胞性贫血,再生障碍性贫血,阵发性睡眠性血红蛋白尿症,脾功能亢进,弥散性血管内凝血,免疫性疾病,射线,苯中毒,某些药物等.
3.血小板功能异常疾病的概述和检验
血小板功能异常疾病是一组由于血小板功能异常所引起的出血性疾病,根据病因分为遗传性和继发性.
(1)遗传性血小板功能异常疾病
1)血小板无力症(thrombosthenia):也称为Glanzmann病,是一种常染色体隐性遗传的出血性疾病,本病主要缺陷是GPⅡb/Ⅲa量或质的异常.此病仅纯合子才有症状,多见于新生儿,主要临床表现为皮肤,黏膜出血为主.患者未抗凝血的血涂片中血小板呈散在分布;血小板GPⅡb/Ⅲa(CD41b/CD61)减少,缺乏或质量异常;在血小板聚集试验中,血小板对瑞斯托霉素有聚集反应,而对其他无聚集反应或聚集反应明显减低;出血时间延长,PF3有效性下降.
2)巨大血小板综合征(Bernard-Soulier syndrome,BSS) 是一种常染色体隐性遗传的出血性疾病.本病主要缺陷是GPⅠb/Ⅸ复合物量或质的异常,该复合物由GPⅠbα,GPⅠbβ,GPⅨ,GPⅤ四种多肽按2:2:2:1的比例组成,前三者为该复合物表达所必须的成份.由于患者血浆中高分子量的vWF多聚体减少,故本病又称为假性vWD或血小板型vWD.本病主要表现为轻度至中度皮肤和黏膜出血.患者外周血血小板数减少,血小板增大增加;出血时间延长;在血小板聚集试验中,瑞斯托霉素不能诱导血小板聚集反应;血小板黏附试验可减低;血小板GPⅠb/Ⅸ复合物(CD42b,CD42c/CD42a)减少,缺乏或质量异常.
3)贮存池病(storage pool disease) 是指血小板中颗粒缺乏或其内容物释放障碍.根据缺陷的颗粒种类分为①α-贮存池病:又称为灰色血小板综合征(gray platelet sydrome,GPS),为常染色体显性遗传.患者外周血血小板减少,外周血涂片中有颗粒缺少的大型灰色血小板,血小板对胶原,凝血酶诱导的聚集反应常降低;②δ-贮存池病:多数患者出血时间延长,ADP和肾上腺素诱导的血小板第一相聚集波正常,但第二相聚集波异常;③α,δ贮存池病:指同时有α血小板第3因子缺乏症 又称为Scott综合征或血小板病(thrombopathia),为常染色体隐性遗传,患者血小板膜磷脂的结构或成份有缺陷,致使血小板不能有效地提供凝血催化表面.α颗粒,δ颗粒缺乏,但以后者为主.
4)实验室检查患者凝血酶原消耗不佳,PF3有效性减低,其它血小板功能正常.
(2)继发性血小板功能异常
继发性血小板功能异常又称为获得性血小板功能异常,是指某些疾病或药物通过不同机制导致血小板功能异常的一组疾病的总称.临床上导致血小板功能异常的有骨髓增殖性疾病,骨髓增生异常综合征,白血病,多发性骨髓瘤,恶性淋巴瘤,尿毒症,肝脏疾病,糖尿病,弥散性血管内凝血,某些药物等.此类疾病表现为皮肤,黏膜出血或无出血症状,实验室检查血小板计数常正常,但有血小板功能异常.
4.遗传性血液凝固缺陷
(1)血友病
1)血友病的定义,分类:血友病是一组遗传性因子VIII和IX 基因缺陷,基因突变,基因缺失,基因插入等导致激活凝血酶原酶的功能发生障碍所引起的出血性疾病.包括血友病A或称血友病甲,因子VIII缺乏症;血友病B或称血友病乙,因子IX缺乏症.
2)血友病的诊断:A型和B型血友病为性连锁(伴性)隐性遗传.其临床特点是:自发性或轻微外伤后出血难止;出血常发生于负重的大关节腔内(膝,踝,肘,腕,髋,肩关节)和负重的肌肉群内(肱三头肌,股四头肌,腓肠肌,腰大肌).
凝血试验是诊断和鉴别本类疾病的重要方法,可按照下列检验程序,作一个完整的血友病检测,表11-1.
表11-1 血友病和因子XI缺乏症的检验和鉴别
血友病A 血友病B 因子XI缺乏症
重型 中型 轻型 亚临床型 重型 中型 轻型 亚临床型 纯合子型 杂合子型
筛检试验
CT普通试管法 ↑ N N N ↑ N N N N/↑ N
涂硅试管法 ↑ ↑ ↑ ↑/N ↑ ↑ ↑ ↑/N ↑ N
ACT ↑ ↑ ↑ ↑/N ↑ ↑ ↑ ↑/N ↑ N
APTT ↑ ↑ ↑ ↑/N ↑ ↑ ↑ ↑/N ↑ N
纠正试验
STGT和TGT ↑ ↑ ↑ N/↑ ↑ ↑ ↑ N /↑ ↑ N
加正常新鲜血浆(+)(+)(+)(+) (+)(+)(+)(+) (+)
加正常吸附血浆(+)(+)(+)(+) (一)(一)(一)(一) (+)
加正常新鲜血清(一)(一)(一)(一) (+)(+)(+)(十) (+)
因子促凝活性和抗原含量
FVIII:C(%) <1 2～5 6～25 26<45 N N N N N N
FVIII:Ag ↓/N ↓/N ↓/N ↓/N N N N N N N
FIX:C(%) N N N N 3%,但其百分率与DIC严重程度无相关性.
2)血小板计数 DIC时,一般为50~100×109/L;处于代偿时,可大于100×109/L,但不会超过150×109/L;在革兰纸阴性细菌所致DIC,PLT早期就可明显下降;革兰氏阳性菌败血症和其它疾病引起的DIC,PLT和Fg往往同步下降.
3)血浆纤维蛋白原含量 DIC明显降低,一般小于1.5g/L,或呈进行性下降(由于部分病人基础Fg含量较高).亦有少数因代偿过度而>4g/L.
4)血浆凝血酶原时间,活化的部分凝血活酶时间和凝血酶时间测定 DIC时均可延长,但DIC早期和慢性DIC时可以正常范围.
5)优球蛋白溶解时间(ELT)测定 DIC时因纤溶活性增高,ELT缩短,常小于70min.但在纤溶酶原代偿,尤其是外源性纤溶酶原和纤维蛋白原补充时,纠正了纤溶激活物在受检样本中的亢进作用,使ELT恢复正常,甚至超过4h,可导致判断困难.故在DIC诊断中,对ELT这一指标要综合分析.
6)血鱼精蛋白副凝固(3P)试验 在DIC失代偿时为阳性,但敏感性不佳,假阴性结果较多.
7)血清FDP测定 DIC时明显高于正常值,一般大于40mg/L.本试验被认为是DIC诊断中最敏感的指标之一.
8)其他 DIC的实验诊断指标还很多,例如血小板活化指标:血浆β-TG,颗粒膜蛋白140(GMP-140)增高;凝血指标:VIII:C降低,凝血酶原片段F1+2,纤维蛋白肽A(FPA)增高;抗凝指标:AT-III降低,凝血酶-抗凝血酶复合物(TAT)增高;纤溶指标D二聚体增高等.这些分子标志物的检测,如有条件开展,通常也只用于疑难病例的诊断.
[诊断标准]
临床表现:
①存在易致DIC的基础疾病,如感染,恶性肿瘤,病理产科,大型手术及创伤.
②有下列二项以上临床表现:Ⅰ)严重或多发性出血倾向;Ⅱ)不能用原发病解释的微循环障碍或休克;Ⅲ)广泛性皮肤,黏膜栓塞,灶性缺血性坏死,脱落及溃疡形成,或不明原因的肺,肾,脑等脏器功能衰竭;Ⅳ)抗凝治疗有效.
实验室检查符合下列条件:同时有下列三项以上异常.① 血小板计数小于100×109/L(肝病,白血病小于50×109/L)或呈进行性下降,或下列二项以上血小板活化分子标志物血浆水平升高:β-TG,PF4,TXB2,GMP-140;② 血浆纤维蛋白原含量小于1.5g/L(白血病小于1.8g/L,肝病小于1.0g/L)或呈进行性下降,或大于4.0g/L;③ 3P试验阳性或血浆FDP大于20mg/L(肝病大于60mg/L),或血浆D-二聚体水平较正常增高4倍以上(阳性);④ PT延长或缩短3s以上(肝病大于5s),APTT延长或缩短10s以上;⑤ AT-III活性<60%(不适用于肝病)或蛋白C(PC)活性降低;⑥ 血浆纤溶酶原抗原<200mg/L;⑦ 血浆因子VIII:C活性8ng/ml或凝血酶调节蛋白(Tm)较正常值高2倍以上.
疑难或特殊病例应有下列二项以上异常.① 血浆凝血酶原碎片(F1+2),凝血酶抗凝血酶III复合物(TAT)或FPA水平增高;② 血浆可溶性纤维蛋白单体复合物(SFMC)水平增高;③ 血浆纤溶酶,纤溶酶抑制复合物(PLC)水平增高;④ 血浆组织因子(TF)水平增高或组织因子途径抑制物(TFPI)水平下降.
6.血栓性疾病和抗栓治疗的监测
(1)心肌梗死的血栓止血学变化:较有价值的观察指标是分子标志物检测,见表11-4.
(2)脑梗死的血栓止血学变化:较有价值的诊断,观察指标是分子标志物检测.见表11-4.
(3)肺梗死的血栓止血学变化:血浆D-二聚体水平超过500mg/L(ELISA法)是90%以上肺栓塞和肺梗死患者的共同特点.其他有关分子标志物的检测,如ET-1,TM,vWF:Ag,TXB2,P选择素,b-TG和PF4等也已广泛应用于临床.但是血栓止血检查对于肺梗死的诊断并不重要.
(4)深静脉血栓形成(deep vein thrombosis,DVT)的血栓止血学变化:较有价值的诊断,观察指标是分子标志物检测.见表11-4.
(5)血栓前状态的概念和血栓止血学变化:也称血栓前期,是指血液有形成分和无形成分的生化学和流变学发生某些变化,这些变化可以反映:①血管内皮细胞受损或受刺激;②血小板和白细胞被激活或功能亢进:③凝血因子含量增高或被活化;④血液凝固调节蛋白含量减少或结构异常;⑤纤溶成分含量减低或活性减弱;⑥血液黏度增高和血流减慢等.在这一病理状态下,血液有可能发生血栓形成或血栓塞性疾病.而一般所指的高凝状态是仅限于体内凝血因子的血浆水平升高,及(或)凝血因子被激活,从而引起血液凝固性增强的一种病理过程.高凝状态实际上也包括在血栓前状态之内.血栓前状态仅仅是一种血栓与止血的病理状态,可以长时期存在,故临床上常无特异的症状和体征.
目前国内外都开始利用敏感和特异的分子标志物对血栓前状态和血栓性疾病进行检测,见表11-4.
表11-4血栓前状态和血栓性疾病分子标志物检测的结果
分子标志物 化学性质 病理生理过程 检测方法 心肌 脑梗死 深静脉 DIC 血栓
梗死 血栓形成 前状态
血管损伤标志物
vWF 蛋白质 各种血栓病均增高 火箭电泳或ELBA ↑ ↑ ↑ ↑ ↑/N
ET-1 蛋白肽 血管损伤时增高 ELISA或RIA ↑ ↑ ↓ ↑/↓ N
TM 蛋白质 血管损伤时增高 ELISA ↑ ↑ ↑/N
6-酮-PGF1α 蛋白质 血管损伤时降低 ELISA或RIA ↓/N ↓/N ↓ ↓/N N
血小板活化标志物
β-TG 蛋白质 α颗粒释放增多 ELISA或RIA ↑ ↑ ↑/N ↑ ↑
PF4 碱性蛋白 α颗粒释放增多 ELISA或RIA ↑ ↑ ↑/N ↑ ↑
5HT 吲哚胺 致密体释放增多 ELISA或RIA ↑ ↑ ↑/N ↑ ↑
TXB2 花生四烯酸衍生物 血小板活化增多 ELISA或RIA ↑ ↑ ↑/N ↑/N ↑
GMP-140 蛋白肽 α颗粒释放增多 ELISA或RIA ↑ ↑ ↑ ↑ ↑
凝血因子活化标志物
TF 脂蛋白 组织和血管损伤增高 ELISA ↑ ↑ ↑/↓ ↑/N
TFPI 蛋白质 由于消耗而减低 ELISA ↓ ↑/↓ ↑/↓
F1+2 蛋白肽 随凝血酶生成而增多 ELISA ↑ ↑/N ↑ ↑ ↑
FPA 蛋白肽 随纤维蛋白生成而增多 ELISA ↑ ↑/N ↑ ↑ ↑
抗凝蛋白活性标志物
TAT 蛋白质 随凝血酶生成而增高 ELISA或RIA ↑ ↑/N ↑ ↑ ↑
PCP 蛋白肽 随蛋白c活化而增高 ELISA或RIA ↑ ↑/N ↑
纤溶活化标志物
t-PA 蛋白质 血管调节时增高或降低 ELISA ↓ ↓ ↓/N ↓/↑ ↓/N
PAI 蛋白质 血管调节时增加 ELISA或RIA ↑ ↑ ↑ ↑/↓ ↑
PAP 蛋白质 随纤溶酶增加而增多 ELISA或RIA ↑ ↑/N ↑ ↑ N
Bβ15-42 蛋白肽 随纤溶激活而增多 ELISA或RIA ↑ ↑/N ↑ ↑ N
FDP 蛋白肽 随纤溶激活而增多 ELISA ↑ ↑ ↑ ↑ ↑
D-D 蛋白肽 随纤溶激活而增多 ELISA或RIA ↑ ↑ ↑ ↑ ↑
注:↑,增高;↓,降低;N,正常
(6)易栓症的定义,分类和血栓止血学变化:易栓症包括有血栓栓塞的遗传性血液凝固调节蛋白缺陷,凝血因子异常和纤溶成分缺陷或代谢障碍等疾病.本症患者临床上以反复发作性静脉或动脉血栓塞为主要表现,血栓形成或栓塞可以自发发生或诱发发生,其诱因常是妊娠,产后,手术,创伤和药物等.其分类及特征见表11-5.
表11-5易栓症的分类及其特征
发生率 遗传 血栓特征 血栓形成机制
(%)* 方式
抗凝活性缺陷
ATIII缺陷 2.6～2.8 AD 静脉血栓 不能抑制凝血磷和因子Xa
HC-II缺陷 0.75
II型 IIa ↓ N <0.75
IIb N N <0.75
蛋白S缺陷
PS:A TPS:Ag FPS:Ag
I型 ↓ ↓ ↓
II型 IIa ↓ N N
IIb ↓ N ↓
APC抵抗(FVa缺陷)
APC-SR 诊断值 参考值
纯合子型 <0.45 0.84
杂合子型 0.45～0.70 0.84
HC-II缺陷
HC-II:A HC-II:Ag
I型 ↓ ↓
II型 ↓ N
纤溶酶原缺乏
PLG:A PLG:Ag
I型 ↓ N
II型 ↓ ↓
PAI-1过多
束臂试验 PAI:A PAI:Ag t-PA
前 ↑ ↑ N
后 ↑↑ ↑↑ N/↑
注:↓,减低;↓↓,明显减低;↑,增高;↑↑,明显增高;APC-SR,活化蛋白C敏感比值;N,正常
(7)抗凝治疗的监测
抗凝治疗常用的药物是肝素和口服抗凝剂.
1)肝素监测
①APTT:是监测普通肝素的首选指标.应用小剂量肝素(5000～10000U/24h),可以不作监测.应用10000U/24h者,APTT可延长至正常值(31～43s)的1.5～1.7倍,也不至于引起出血并发症.但是在应用中等剂量(10000～20000U/24h)和大剂量(20000～30000U/24h),必需作监测试验,使APTT较正常对照值延长1.5～2.5倍.
②血浆肝素浓度监测:是肝素监测的又一较为理想的指标.在APTT为正常对照值的1.5～2.5倍时,血浆肝浓度为0.2～0.5U/ml.这种浓度的肝素是治疗的最佳选择.
③低相对分子质量肝素(LMWH)监测:目前多用抗因子Xa活性作为监测LMWH的指标.一般认为, LMWH的抗因子Xa活性维持在0.5～4.0个抗因子Xa单位/ml为佳.
④血小板计数:在应用肝素的过程中,需监测PLT使其维持在(5O～60)×109/L以上为宜.
2)口服抗凝剂监测
①PT:是监测口服抗凝剂的首选指标.在应用口服抗凝剂的过程中,使PT维持在正常对照值(12.0±1.0s)的1.5～2.0倍,使凝血酶原时间比率(prethrombin time ratio,PTR)维持在1.5～2.0为佳.目前推荐应用国际标准化比值(internationa1 normolized rotio,INR)作为监测口服抗凝剂的可靠指标.
②F1+2监测:在(0.10～1.5)nmo1/L之间对监测口服抗凝剂较为理想[参考值为(0.40±0.23)nmo1/L].
(8)抗血小板治疗的监测:应用小剂量阿司匹林(80～325mg/d),勿需作监测试验.噻氯吡啶(ticlopidine),在口服250～50Omg/d时,在开始用药的l～2周内,需每周检测血小板聚集试验1～2次,使PAgT抑制率维持在参考值的30%～50%,BT(国际标准化出血时间测定器法)延长是参考值上限(≤8min)的1.5～2.0倍,PLT减低是参考值低限(100×109/L)的50%～60%为宜.
(9)抗栓酶治疗的监测:最常用的是精制蝮蛇抗栓酶(Svate-3)和去纤酶.以Fg和PLT作为监测指标,使Fg和PLT分别维持在1.2～1.5g/L和(50～60)×109/L为宜.用APTT,PT或TT作为监测指标,依次维持在正常对照值的1.5～2.5倍,1.5～2.0倍或2.0～2.5倍为宜.
(10)溶栓治疗监测
1)Fg,TT,D-Dimer和FDP检测的应用监测:持续应用溶栓药物,如链激酶(SK),尿激酶(UK)和组织型纤溶酶原激活剂(tPA)等,可致机体处于高纤溶状态.应维持Fg在1.2～1.5g/L,TT在正常对照的1.5～3.5倍,FDP在(300～400)mg/L最为合适.D-Dimer在大剂量或持续溶栓的前三天可能单独高达4000μg/L以上,但出血的几率并不高,可作为溶栓剂量达标的指标.
2)TAT监测:TAT也可以作为观察溶栓治疗疗效的指标.当TAT>20～40μg/L时,显示发生溶栓后再栓塞.
·上一篇：于脑病造血细胞包括:红细胞系统,粒细胞系统,巨核细胞系统的细胞,还包括淋巴细胞系统(浆细胞系统)及单核细胞系统等细胞.造血器官是能够生成并支持造血细胞分化,发育,成熟的组织.造血器官生成各种血细胞的过程称为造血.
在人体发育的胚胎期和出生后,其主要的造血器官是不相同的.
1. 造血器官
(1)胚胎期造血的基本概况
1)中胚叶造血期:
中胚叶造血大约在胚胎发育第2周末开始,其时卵黄囊壁上的胚外中胚层细胞聚集成簇形成血岛.第3周,卵黄囊血岛内层的细胞演变成为原始血细胞,即最早的造血干细胞.此时仅产生形态上类似巨幼样的原始红细胞,不产生粒细胞和巨核细胞.随着胚胎的发育,胚内细胞团出现胚胎干细胞及胚胎内血液循环的建立,胚胎干细胞随血流迁移到最适宜的微环境中增殖,分化,在胚胎第9周时,卵黄囊造血停止.
2)肝造血期:
始于胚胎第6周,停止于胚胎第7个月.胚胎干细胞(造血干细胞)随着血流迁入肝内增殖,胚胎3-6个月,肝是主要的造血场所,主要产生有核红细胞,以合成胎儿血红蛋白F(HbF)为主.胚胎第4个月以后,胎肝才产生粒细胞及少量的巨核细胞,在胚胎第5个月后,胎肝造血逐渐减少,至出生后停止.
胚胎6-7周时, 胸腺产生淋巴细胞及少量的红细胞和粒细胞,在胚胎后期,经血流来自胎肝的造血干细胞在胸腺内经诱导和分化为前T细胞.
脾在胚胎第3个月时首先以产生红细胞为主,以后产生粒细胞,第5个月后,产生淋巴细胞和单核细胞,出生后成为产生淋巴细胞的器官.
淋巴结短暂产生红细胞,胚胎第4个月后至终身只产生淋巴细胞和浆细胞.
3)骨髓造血期:
骨髓在胚胎第3个月时,在长管骨骨髓中已开始造血.胚胎第8个月时,骨髓造血高度发育,产生红细胞,粒细胞,巨核细胞,淋巴细胞和单核细胞.红细胞的血红蛋白除血红蛋白F(HbF)外,已产生了少量的血红蛋白A(HbA)和少量的血红蛋白A2(HbA2).在骨髓造血旺盛时,肝,脾等造血功能逐渐减退.
胚胎期各类血细胞形成的顺序是:红细胞,粒细胞,巨核细胞,淋巴细胞和单核细胞.红细胞的形态由巨型逐渐向正常形态演变.
(2)出生后造血概况
出生后在生理情况下,人体主要的造血器官是骨髓.骨髓是唯一产生粒细胞,红细胞,巨核细胞的造血器官,同时也产生淋巴细胞及单核细胞.此外,胸腺,脾,淋巴结等也参与造血,终身产生淋巴细胞.
骨髓是一种海绵状,胶状或脂肪性组织,封闭在坚硬的骨髓腔内.其由神经,血管,基质细胞,细胞外基质及各类造血实质细胞共同组成,呈现为红色.健康成人骨髓组织重量为1600～3700g,平均2800g ;约占体重的3.4%～5.9%,平均4.6% .
红骨髓:红骨髓主要由结缔组织,血管,神经及造血实质细胞组成,造血功能十分活跃.在红骨髓内有红细胞造血岛,粒细胞造血岛,巨核细胞,单核细胞和淋巴细胞等,它们按一定的区域分布进行造血活动.如果血细胞分布的特定区域发生改变,则可出现病理状况.
5岁以下的儿童,全身骨髓腔内都充满红骨髓;5-7岁以后,骨髓逐渐开始脂肪化,由远心端向近心端扩展.18岁时,红骨髓仅存在于扁骨,短骨及长管骨的近心端,如颅骨,胸骨,脊椎骨,肋骨,髂骨及肱骨和股骨的近心端.
骨髓中的血管系统,血窦是最突出的结构.
黄骨髓:造血细胞被脂肪细胞替代,呈现为黄色,成为脂肪化的无造血功能的骨髓,但仍保留有极少的造血细胞,是潜在性的造血组织.
(3)淋巴器官造血概况
骨髓是B淋巴细胞发育成熟的场所,成熟的B淋巴细胞可随血流迁至周围淋巴器官,因此,骨髓是中枢淋巴器官.
胸腺: 胸腺的主要功能是产生淋巴细胞和分泌胸腺素,是T细胞发育成熟的器官.
脾:脾的胸腺依赖区,主要是T细胞存在.脾小体由大量的B细胞构成.主要产生T,B淋巴细胞.
淋巴结:淋巴小结的生发中心,主要是B细胞定居;付皮质区主要是T细胞聚集.髓索主要含B细胞和浆细胞,以及吞噬细胞,肥大细胞,嗜酸性粒细胞等.出生后淋巴结只产生淋巴细胞和浆细胞.淋巴细胞可以不断地进行再循环,这主要是促进T,B记忆细胞与抗原递呈细胞的接触,更好地进行免疫监控和发挥免疫功能.
(4) 髓外造血
在某些病理情况下,使骨髓的造血组织受到破坏,肝,脾,淋巴结等组织重新恢复其造血功能,以此部分代偿骨髓的造血功能,称为髓外造血.髓外造血有很大的局限性,在外周血中可出现幼稚细胞,如:有核红细胞,晚幼粒细胞,中幼粒细胞甚至早幼粒细胞及原粒细胞.
2.造血微环境
(1)造血微环境概念
造血微环境是由除造血细胞以外的所有参加调控造血的间质成分,包括微血管系统,神经成分,网状细胞,基质细胞(成纤维细胞,内皮细胞,吞噬细胞,脂肪细胞),细胞外基质及其它结缔组织等组成,统称为造血微环境.是造血干细胞赖以生成的场所,造血细胞在微环境各种因素的调控下增殖,分化,发育及成熟.
(2)造血微环境的组成
造血微环境主要有神经,微血管,基质细胞及其分泌的细胞因子和细胞外基质.
1)骨髓神经来自脊神经,其神经束分支呈网状分布于骨髓动脉;神经纤维终止于动脉平滑肌.也有很细的无鞘神经纤维在造血细胞之间终止或分布在骨髓表面或骨内膜.神经调节对造血的作用是:影响血管的扩展或收缩,从而影响血流速度和压力,调节着血细胞的释放等.
2)骨髓-血屏障: 血窦是骨髓内重要的组织结构,它是动脉毛细血管末端分支形成的放射状窦状腔隙,密布于整个骨髓腔内.造血细胞是处于血窦外的窦间区(造血索).骨髓内成熟血细胞要进入外周血循环必须穿过血窦壁,所以,血窦壁组成了骨髓-血屏障.
大部分的血窦壁只有一层内皮细胞或两层胞膜.内皮细胞转运细胞的孔道常达2-3nm,因此,穿越的细胞必须具有变形性.成熟的有核白细胞穿过时核必须重排成线状而进入血窦内;而幼稚红细胞的核坚固不能变形被阻挡在血窦壁外,在正常情况下,红细胞系只有网织红细胞和成熟红细胞才能进入血循环.巨核细胞只有胞浆穿过向血窦内释放血小板.造血旺盛的骨髓血窦丰富,造血功能低下的骨髓血窦减少.
3)基质细胞:骨髓基质细胞主要包括内皮样细胞,纤维母细胞,脂肪细胞,吞噬细胞,骨细胞,基质干细胞等.基质细胞能分泌许多细胞因子及细胞外基质.细胞因子如GM-CSF,干细胞因子(SCF)白血病抑制因子(LIF),细胞黏附分子(CAMs)等,这些细胞因子影响着血细胞的生成和发育.基质细胞表面也有许多细胞因子受体,能接受外源信息影响其细胞因子分泌的程度及种类.
4)细胞外基质:细胞外基质由基质细胞分泌到细胞外的区域,主要由分泌蛋白和多糖组成,包括三类大分子物质:糖蛋白,蛋白多糖和胶原.糖蛋白中主要有纤维连接蛋白,层黏连蛋白和血细胞黏连蛋白.蛋白多糖有硫酸软骨素,硫酸肝素和透明质酸等.胶原中主要是Ⅰ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅵ型胶原.
这些物质都与造血细胞的黏附有关.细胞黏附分子是造血干,祖细胞和骨髓基质细胞之间重要的桥梁,是细胞之间信息传递的分子基础.所以,基质细胞分泌的多种细胞因子及细胞外基质对造血干,祖细胞的增殖,分化和发育起正,负调控作用.
3.造血干(祖)细胞
现已公认,造血干细胞来源于胚胎干细胞.
(1)造血干细胞
造血干细胞的基本特征是
1)自我更新和自我维持:
造血干细胞在骨髓中仅约占有核细胞的0.1%～0.5%.正常情况下其95%以上又处于G0静止期.在分化后自身的数量和特征保持不变,这一特征持续终身.
造血干细胞以不对称性的有丝分裂方式产生两个子细胞;其中一个立即分化为早期祖细胞;但另一个子细胞则保持原有全部特性不变.这样,造血干细胞在骨髓中达到了自我更新而数量又保持不变.
2)多向分化性:
造血干细胞能够分化为髓系和淋巴系祖细胞,祖细胞再定向分化发育为相应的各系原始,幼稚及成熟细胞.故可以称其为全能干细胞.
3)多态性:
即造血干细胞的不均一性.造血干细胞的群体在形态和生物物理特征及表面标志都不同,具有\"异质性\"和\"等级性\".
造血干细胞缺乏形态特征,难以辨认,相似小淋巴细胞,常只能依据其表面标志特征来识别.目前,通常认为造血干细胞绝大多数表达的是:CD34+,Thy-1+(CD90+),低表达和不表达 CD38和HLA-DR,缺乏系特异系列抗原表面标志( Lin-)等,其中最重要的是CD34抗原.CD34抗原在干细胞为强阳性,到晚期祖细胞直到分化为各系原,幼细胞时,CD34抗原消失.
(2)造血祖细胞
造血祖细胞由造血干细胞分化而来,是(早期)已部分或(晚期)全部失去了自我更新能力的过渡性,增殖性细胞群.造血祖细胞全部是以对称性有丝分裂方式进行增殖,一边增殖一边分化,祖细胞阶段也存在着不同的亚群.在骨髓中的单向祖细胞是:淋巴系祖细胞(CFU-L),其可分化为T细胞祖细胞(CFU-TL)和B细胞祖细胞(BL-CFU).髓细胞系的粒,单系祖细胞(GM-CFU),其可分化为粒细胞系祖细胞(CFU-G)和单核细胞系祖细胞(CFU-M).红系中有红细胞早期(或爆式)集落形成单位(BFU-E)和红细胞系祖细胞(CFU-E).巨核细胞系祖细胞(CFU-Meg);嗜酸粒细胞祖细胞(CFU-Eo);嗜碱粒细胞祖细胞(CFU-Bas ).它们只能定向分化为各系原,幼细胞,至到发育成熟为终末细胞.
造血祖细胞表面标志是:早期CD34+逐渐到晚期CD34-,CD38+,CD71- ,Lin+ 等.
目前,常采用流式细胞术运用多参数分析来分选造血干细胞和造血祖细胞.
(3)造血干,祖细胞的临床应用
造血干,祖细胞的临床应用主要是造血干细胞移植.基本原理是以正常造血干细胞替代异常造血干细胞,使患者的造血功能和免疫功能重建.
造血干细胞移植有:骨髓移植,外周血干细胞移植,脐血干细胞移植,胎肝干细胞移植等.近年发展较快的是外周血干细胞移植.CD34+细胞是公认的理想造血干细胞移植物,在基因治疗中造血干细胞也是公认的理想靶细胞.造血干,祖细胞临床用于治疗恶性血液病,实体瘤,某些遗传性疾病,自身免疫性疾病能达到较好的效果.
4.血细胞的增殖和成熟
\"增殖\"是细胞通过有丝分裂进行复制的过程. \"分化\"是细胞在基因的调控下,从一般向特殊演变,在此过程中失去某些潜力但同时又获得新的功能.\"成熟\"是包含在整个发育过程中,其形态特征逐渐明确.\"释放\"是终末细胞通过骨髓-血屏障进入血循环的过程.有丝分裂是血细胞增殖的主要形式.
(1)血细胞的增殖
原,幼细胞的增殖都是对称性的,但巨核细胞则不同,巨核细胞的增殖全部在祖细胞阶段.从原始巨核细胞起,不再进行细胞分裂.细胞中DNA可以连续成倍增殖,细胞核也成倍增加,每增殖一次,核就增大一倍,但细胞浆并不分裂,故细胞体积逐渐增大,属多倍体细胞.
(2)血细胞的发育和成熟
血细胞的发育是连续性的,成熟是指由原始细胞经幼稚细胞到成熟细胞的过程.血细胞分化,发育和成熟的程序是:
造血干细胞经由多能干细胞(包括髓系和淋巴干细胞),各系祖细胞阶段而定向发育为原始细胞;此时其形态特征已可辨认.各系原始细胞进一步发育成熟为具有特定功能的终末细胞.
血细胞的命名 骨髓造血细胞按所属系列分为五大系统,各系依其发育水平分为原始,幼稚及成熟三个阶段;红系和粒系的幼稚阶段又分为早幼,中幼和晚幼三个时期.各系的发育顺序是:
红细胞系:原红细胞,早幼红细胞,中幼红细胞,晚幼红细胞,网织红细胞,成熟红细胞.
粒细胞系:原粒细胞,早幼粒细胞,中幼粒细胞,晚幼粒细胞,杆状核粒细胞,分叶核粒细胞.粒细胞系也包括嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞.
淋巴细胞系(浆细胞系):原淋巴细胞,幼淋巴细胞,淋巴细胞(原浆细胞,幼浆细胞,浆细胞).
单核细胞系:原单核细胞,幼单核细胞,单核细胞.
巨核细胞系:原巨核细胞,幼巨核细胞,颗粒型巨核细胞,产板型巨核细胞,血小板.
(3)血细胞发育成熟的一般规律 血细胞发育过程中有共同的形态学特点
(表1-1).
表1-1 血细胞发育过程中形态演变一般规律
项 目 幼稚 备 注
原始 成熟
细胞大小 大 小 原始粒细胞比早幼粒细胞小,巨核细胞由小变大
核质比例 大 小
核大小 大 小 成熟红细胞核消失
核形态 圆 凹陷 分叶 有的细胞不分叶
核染色质 细致 粗糙
疏松 致密
核染色受色 淡紫色 深紫色
核膜 不明显 明显 淋巴细胞核膜较明显
核仁 有 无
胞质量 少 多 小淋巴细胞较少
胞质颜色 蓝(嗜碱) 红(嗜酸)或天蓝 浅蓝
胞质颗粒 无 少 多 粒细胞分为三种颗粒 小淋巴细胞无颗粒
5.造血调控
(1)造血的基因调控
基因调控主要是原癌基因和抑癌基因的表达产物及信号转导参与对细胞增殖和分化的调控.
1) 原癌基因:如:c-myc基因,ras相关基因,c-abl基因,bcl-2 基因,c-kit 基因等.原癌基因编码的产物可为:细胞因子,细胞因子受体,细胞内蛋白激酶,细胞内信号传递分子及转录因子等.它们促进造血干细胞的增殖及分化.原癌基因在化学,物理,生物等因素作用下,通过点突变,染色体重排,基因扩增等途径引起结构改变可转化为癌基因,导致细胞增殖失控和分化停滞.
2)抑制癌基因: 如:P53基因,,WT1基因,NF1基因,PRB基因,DCC,Rb基因等.抑癌基因编码的蛋白质产物可以是正常细胞增殖的负调节因子,抑制细胞增殖,诱导终末分化,维持基因稳定,调节生长,负性生长因子的信号传导,诱导细胞凋亡等.
3)信号转导的调控:基因转录由称为转录因子的蛋白控制.转录因子参与信号转导途径.信号转导通路形成复杂的信号网络,并与转录因子相互作用,相互协调,使细胞在特定信号作用下基因转导作出专一性表达来诱导或抑制细胞增殖与分化.
(2)造血细胞因子的调控(体液调控)
细胞因子是由基因编码的细胞外信号分子,主要功能是在细胞之间传递信息以调节细胞增殖及分化.细胞因子由骨髓基质细胞产生的,称为近程因子,如:CSFs ,IL-3等,由内分泌器产生经血液循环达到造血组织起作用的,称为远程因子,如:红细胞生成素及血小板生成素.近程因子用四种方式发挥作用:旁分泌(邻近),自分泌(自身调节),内分泌,并置分泌(相邻). 近程因子和远程因子可共同发挥作用(表1-2).
表1-2 造血正,负调控的细胞因子
正向调控 负向调控
SCF,FL 肿瘤坏死因子-α,β
白细胞介素类 转化生长因子-β
集落刺激因子 白血病抑制因子
红细胞生成素 干扰素α,β,γ
血小板生成素 趋化因子
白血病抑制因子
1) 造血正向调控的细胞因子:
造血正向调控主要是通过促进造血的细胞因子来完成的.包括:
主要作用于早期造血细胞的细胞因子:SCF,FL及白细胞介素类.这些因子多是协同作用.
集落刺激因子(CSF),其有四种主要的类型:
粒-单细胞集落刺激因子(CSF-GM)是一种多系集落刺激因子.能够刺激红系,粒系,单核系,巨核系等集落形成.
粒细胞集落刺激因子(CSF-G)主要是粒细胞系特异的集落刺激因子.
单核细胞集落刺激因子(CSF-M)促进单核细胞,吞噬细胞集落形成.
巨核细胞集落刺激因子(CSF-Meg)促进巨核细胞的增殖和分化,促进血小板产生.
多系集落刺激因子(CSF- Multi)即是白细胞介素3(IL-3),刺激多系集落生长.
白细胞介素(ILs):是一类由活化白细胞产生的信号分子,目前已正式命名IL1～IL20.IL1,IL3和IL6作用于造血干细胞分化出髓系干细胞,IL3主要对造血干细胞及早,晚期造血祖细胞和对粒系,红系,巨核各系都有促生长作用;IL1 和IL6作用于造血干细胞分化出淋巴系干细胞,此后,淋巴系干细胞再分化出前T,前B细胞的过程中也有IL1 和IL6的作用.IL11,其有多方面功能,能促进巨核细胞产生血小板,目前在临床上,它是唯一能提高外周血血小板数的细胞因子.
红细胞生成素(EPO) 由肾,胎肝产生,促进红系集落形成,促进幼红细胞分化及血红蛋白合成及减少红系祖细胞的凋亡等.重组人EPO临床应用治疗各种贫血.
血小板生成素(TPO) 是生理性调节血小板生成最重要的因子,具有对巨核系的特异性,促进巨核细胞的增殖,分化与血小板的产生.
白血病抑制因子(LIF) 促进胚胎干细胞的增值,促巨核祖细胞的增殖与分化.
2)造血负向调控的细胞因子 :
抑制造血生长因子的称为负调节因子.包括:
转化生长因子-β(TGF-β) 是主要的抑制因子,其作用是抑制细胞周期及抑制早期祖细胞的增殖.
肿瘤坏死因子-α,β(TNF-α,β) 其对造血的调控作用是:能抑制CSF-GEMM,CSF-GM,CSF-Meg,BFU-E,CFU-E等的生长,抑制细胞周期,
白血病抑制因子(LIF) 具有双向作用,但对造血更多的是负调节,主要是抑制胚胎干细胞和造血干细胞的分化.
干扰素α,β,γ(IFN-α,β,γ) 其具有增强和调节免疫,抗病毒,抗肿瘤,抑制细胞增殖作用.
趋化因子(CK) 参与造血调控的有血小板第4因子,IL-8,MIP-1α.PF4抑制巨核细胞的增殖;MIP-1α又称为吞噬细胞炎性蛋白,在体内,外均可抑制造血细胞集落的形成.
(3)细胞外基质对造血的调控
造血调控中细胞因子外基质也起重要作用,细胞外基质对造血细胞的黏附,定位,迁移等有支持生存的作用,同时也介导细胞与细胞,细胞与基质的各种物理,化学信号传递.影响细胞因子,生长因子,转移因子的能力及抑制诱导凋亡基因的表达,从而调控造血.
细胞凋亡
(1)细胞凋亡基本概念
细胞死亡有两种方式.一种是细胞坏死,另一种死亡方式称细胞凋亡(apoptosis),这是细胞死亡的一种生理形式,是在基因调控下细胞主动死亡过程.也可称为程序性细胞死亡.
(2)细胞凋亡的形态学变化及主要生物化学特征
细胞凋亡不伴细胞溶酶体及胞膜破裂,没有细胞内容物的外溢,故不引起组织的炎症反应(表1-3).
1) 细胞膜的变化 细胞脱水,胞体变小,变圆,然后与邻近细胞脱离.膜出现发泡状并有不规则的突起,但胞膜并不破坏而是完整的.
2) 细胞核的变化 染色质凝集(核固缩)呈月牙状聚向核膜周边或凝集在核中央,染色质可啐裂成多个大小不等的小块.
3) 细胞质的变化 线粒体呈空泡状,内质网扩大疏松并逐渐与细胞膜融合.
4) 凋亡小体形成 细胞膜逐渐内陷,包裹着核啐片,胞质,细胞器形成一些大小不一的球状小体脱落,即凋亡小体.该凋亡小体很快被吞噬细胞识别而吞噬.
5) 细胞凋亡的主要生物化学特征 内源性核酸内切酶激活,DNA被其在核小体间的连接处切断,染色质DNA降解为长度180～200bp整倍的寡聚核苷酸片断,其琼脂糖凝胶电泳图呈特殊的梯状条带图形.另外,胞内Ca2+浓度增高,引起众多靶酶的活化,触发细胞凋亡.并有RNA和蛋白质大分子的合成来抵御细胞凋亡发生.
表1-3 细胞凋亡和细胞坏死的区别
特征 细胞凋亡 细胞坏死
诱发因素 特定的或生理性 各种病理性
细胞数量 单个细胞丢失 成群细胞死亡
质膜 完整保持 肿胀溶解破坏
细胞核 固缩啐裂为片断 溶解 破碎
染色质 凝集呈半月状 模糊 疏松
线粒体 肿胀通透性增加 细胞色素c释放 肿胀 破裂
细胞器 完整 损伤
内容物释放 无 有
炎症反应 无 有
核DNA 降解为完整倍数大小的片段 随机不规则断裂
凝胶电泳 梯状条带形 分散形态
(3)细胞凋亡的基因调控
细胞凋亡的调控基因按其功能分为两类, 一类是促进细胞增殖和存活的基因如:C-myc,c-abl,ras,Bcl-2,c-kit等,另一种是细胞死亡的基因如:P53基因,RB基因及WT-1基因等.
Bcl-2基因 是凋亡的重要调节因子,其家族有较多成员,在功能上有促进凋亡和抗凋亡的作用.Bcl-2抗凋亡机制主要体现在:能抑制氧化物诱导的细胞凋亡,抑制细胞周期动力学,促进对损伤染色体DNA的修复,抑制其它促凋亡蛋白的活性,能够阻断由多种信号诱导的细胞凋亡.
P53基因 是重要的抑癌基因,它能够保护细胞DNA 的完整性.当DNA损伤而不能修复时,P53基因诱导细胞凋亡.P53基因分野生型和突变型两种,突变型P53基因能够抑制野生型P53基因的功能使细胞转化,抑制细胞凋亡,并可导致肿瘤发生.
(4)细胞凋亡的常用检测方法
1)形态学观察: 包括普通显微镜检查法,倒置显微镜检查法,萤光显微镜检查法及电子显微镜检查法.
2)生物化学检测: 琼脂糖凝胶电泳见特征性梯形电泳图.
3)原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶标记技术
4)ELISA法
5)流式细胞仪检测
(5)细胞凋亡的生物学意义
1)细胞凋亡普遍的生物学意义:细胞凋亡清除了无用的细胞,多余的细胞,发育不正常的细胞,已完成了功能的细胞及有害的细胞.在生命活动中细胞凋亡与细胞增殖是矛盾的统一,在其相互制约,相互协调下保证了机体正常的生长和发育.
2)在血液系统中,活跃的细胞凋亡机制,才能维持造血干细胞的自我更新,分化和血细胞消亡的平衡,保持血细胞数量和功能的恒定.对细胞凋亡机制的研究必将深入地探讨恶性血液肿瘤的发病机制及治疗的新方法,最终达到控制和战胜控制疾病的目的.
第二章 骨髓检查
1.骨髓穿刺技术
(1)骨髓穿刺部位,方法及注意事项
1)骨髓穿刺部位
骨髓标本大部分采用穿刺法吸取.常用骨髓穿刺部位一般为:
①髂骨后上棘 ,为临床上首选的穿刺部位;②髂骨前上棘;③胸骨穿刺;④其他部位 三岁以下的小儿还可选择胫骨头内侧.⑤局部有症状者,可直接穿刺有症状的部位(即定位穿刺),骨髓穿刺部位的不同,细胞的数量和组成可能有一定的差异,尤其是病变呈局灶性分布的疾病,差异可能会更明显,因此必要时应多部位取材,以便全面了解骨髓的造血情况.
2)穿刺方法及注意事项
常规的骨髓穿刺方法主要包括以下步骤: ①选择体位,常采用侧卧位或俯卧位;②定位;③常规消毒 ;④局部麻醉 ;⑤进骨髓穿刺针;⑥抽吸骨髓液.
穿刺注意事项:
穿刺过程中应注意:①严格遵守无菌操作,防止骨髓感染;②初诊病人治疗前进行;③死亡病例需要作骨髓检查时一般要在半小时内进行;④抽取骨髓液时,量不宜过多,一般以小于0.2毫升为宜;⑤某些疾病须进行多部位穿刺和特定部位穿刺,以提高诊断率.
(2)骨髓\"干抽\"概念和发生\"干抽\"的原因
干抽(dry tap)是指非技术原因或穿刺位置不当,多次,多部位穿刺抽不出骨髓液的现象.常见于:①原发性和继发性骨髓纤维化;②骨髓极度增生,细胞排列过于密集;③骨髓增生减低;④肿瘤骨髓浸润等.
(3)骨髓取材满意的指标
①抽吸骨髓液时病人有特殊的痛感.②抽出的骨髓液中有较多的骨髓小粒和脂肪滴.③显微镜下涂片有骨髓特有的细胞如:巨核细胞,浆细胞,组织嗜碱细胞,成骨细胞,破骨细胞,肥大细胞,网状细胞,网状纤维等.④骨髓中中性杆状核粒细胞/中性分叶核粒细胞比值大于外周血中性杆状核粒细胞/中性分叶核粒细胞比值.
2.骨髓涂片检查
(1)骨髓涂片制作,染色方法
1)制片
骨髓涂片制作方法与血片制作方法基本相同,但因有骨髓小粒和脂肪滴,有核细胞较多,因此较血液黏稠,推片略难于血片,推片时角度要小一些,速度要慢一些,避免骨髓片过厚.
2)染色
临床常用的染色方法主要有:
①瑞氏(Wright)染色
②吉姆萨(Giemsa)染色
③Marshall提出的标准化的Romanowsky染色
④R-G(Romanowsky- Giemsa)染色
⑤wittekind1987年介绍的R-G染色
(2)骨髓片检查的程序及方法
1)检查步骤
[骨髓涂片检查]
①低倍镜
Ⅰ.观察取材,涂片,染色是否满意等.
Ⅱ.判断有核细胞增生程度 低倍镜下选择细胞分布均匀部位观察骨髓片有核细胞增生情况,根据骨髓片中有核细胞的密度或有核细胞与成熟红细胞的比例来估计有核细胞的增生程度.骨髓有核细胞增生程度通常分为五级,如表2-1.
表2-1骨髓有核细胞增生程度五级估计标准
增生程度
成熟红细胞:
有核细胞
有核细胞均数
(高倍镜视野)
常见病例
增生极度活跃
1:1
>100
各种白血病
增生明显活跃
10:1
50-100
各种白血病,增生性贫血
增生活跃
20:1
20-50
正常骨髓象,某些贫血
增生减低
50:1
5-10
造血功能低下
增生极度减低
200:1
<5
再生障碍性贫血
Ⅲ.观察全片巨核细胞的数量 巨核细胞数量变化较大,如将骨髓膜标准化为1.5cm×3.0cm(4.5cm2),则参考值为7-35个.
Ⅳ.观察骨髓片边缘和尾部有无体积较大的或成堆的特殊病理细胞.
②油镜
分类计数200或500个有核细胞(不包括分裂型细胞和破碎细胞).按各细胞的种类,发育阶段分别记录,并计算出百分比.同时仔细观察各系,各阶段细胞的形态是否正常.
[血涂片检查]
分类记数100-200个白细胞,计算各类白细胞的百分率,描述红细胞形态,血小板数量和分布情况.如见到幼红细胞按分类100个白细胞中幼红细胞的数量来报告,并说明其阶段性.
(3)骨髓报告
1) 结果计算
计算出各系和各阶段细胞占有核细胞总数的百分数;再算出各阶段粒细胞百分数的总和与各阶段幼红细胞百分数之总和,将前者除以后者即得出粒:红比值(G:E).粒红比值代表粒系和红系的相对数量关系,正常人约为2-4:1.如有核细胞增生亢进,G:E增大,则为粒系增多;如有核细胞增生低下,G:E增大,则为红系减少.
2) 骨髓象报告单的填写
应用简明扼要的语言,突出重点,填写骨髓检查报告单.
①\"骨髓特征\"一栏主要内容为Ⅰ.对取材,涂片,染色的评价;Ⅱ.骨髓有核细胞的增生程度和粒红比值;Ⅲ.分别叙述各系细胞的情况.Ⅳ.巨核细胞和血小板的数量,形态由全片来评估;Ⅴ.是否见到特殊的病理细胞和寄生虫.
②报告血涂片检查结果
③报告细胞化学染色结果.
④填写诊断意见 综合骨髓象,血象,结合临床资料,客观地向临床提出细胞学诊断意见或可供临床参考的意见,一般诊断意见有以下五种:
Ⅰ.肯定性诊断;Ⅱ.符合性诊断;Ⅲ.疑似性诊断;Ⅳ.阴性(或排出性)诊断,这种情况一般报告\"大致正常骨髓象\";Ⅴ.若骨髓象有某些特征性改变但并非特异性的改变,对临床诊断提不出具体支持和反对意见,也不能用临床表现加以解释者,可直接扼要地描述骨髓象特征,继续观察和随访.
3.常用血细胞化学染色
(1)过氧化物酶染色的原理和临床意义
[原理] 粒细胞和单核细胞胞浆中含有的过氧化物酶(peroxidase,POX)能将底物过氧化氢分解,产生新生态氧,它将四甲基联苯胺氧化为联苯胺蓝.联苯胺蓝自我脱氢氧化,显棕色四甲基苯醌二胺,再加入亚硝基铁氰化钠与联苯胺蓝结合,可形成稳定的蓝色颗粒,定位于细胞浆内酶所在的部位.
[临床意义]
临床上主要用于急性白血病类型的鉴别:急性淋巴细胞白血病原,幼淋巴细胞POX染色均呈阴性反应;急性粒细胞白血病 原粒细胞POX染色呈局灶分布的阳性反应;急性早幼粒细胞白血病 颗粒增多的早幼粒细胞POX染色呈强阳性反应;急性单核细胞白血病原,幼单核细胞POX染色多呈细小颗粒弱阳性反应.
(2)过碘酸-雪夫染色的原理和临床意义
[原理] 过碘酸-雪夫(Pexiodic acid-schiff,PAS)染色又称糖原染色.胞浆内存在的糖原或多糖类物质(如黏多糖,黏蛋白,糖蛋白,糖酯等)中的乙二醇基(CHOH-CHOH)经过碘酸(Periodic acid)氧化,转变为二醛基(CHO-CHO),与雪夫(Schiff)试剂中的无色品红结合,形成紫红色化合物而沉积于胞浆中糖原类物质所存在的部位.该反应称为过碘酸-雪夫(PAS)阳性反应.
[临床意义]
1)急性白血病类型的鉴别 红白血病的幼红细胞PAS染色多呈阳性反应,阳性率高,反应强;成熟红细胞有时亦可为阳性;急性淋巴细胞白血病的原,幼淋巴细胞PAS染色多为红色颗粒或块状阳性反应; 急性粒细胞白血病的原粒细胞呈阴性或胞质呈弥漫淡色阳性反应;急性早幼粒细胞白血病 异常早幼粒细胞的PAS染色为阳性反应;急性单核细胞白血病原,幼单核细胞PAS染色阳性反应呈弥漫分布的红色细颗粒,巨核细胞白血病原巨核细胞PAS染色呈阳性或强阳性反应,表现为红色颗粒或块状.
2)各类贫血的鉴别 MDS,缺铁性贫血,珠蛋白生成障碍性贫血(曾称地中海贫血)的幼红细胞PAS染色多为阴性反应,有时可出现阳性反应;巨幼红细胞贫血,溶血性贫血,再障的幼红细胞PAS染色为阴性.
3)其他细胞类型的鉴别 戈谢细胞呈强阳性反应;尼曼-匹克细胞PAS染色为弱阳性,空泡中心阴性.非霍奇金淋巴细胞PAS染色呈阳性反应;R-S细胞则为弱阳性或阴性反应.骨髓内转移的腺癌细胞PAS染色呈强阳性反应,表现为红色颗粒或块状.
(3)中性粒细胞碱性磷酸酶染色的原理和临床意义(偶氮耦联法,Kaplow)
[原理] 中性粒细胞内碱性磷酸酶(neutrophile alkaline phosphatese, NAP)在pH9.2-9.8时,能水解磷酸萘酚钠,释放出磷酸与萘酚,再以重氮盐与萘酚耦联成不溶性有色沉淀于胞质内酶所存在的部位.
[临床意义]
1)白血病 急性粒细胞白血病NAP阳性率及积分值均降低,急性淋巴细胞白血病NAP积分值明显增高;慢性粒细胞白血病(无继发感染时)NAP积分值显著降低,甚至为\"0\",类白血病反应NAP积分值明显增高,是两者鉴别的重要检测项目;慢性中性粒细胞白血病NAP积分值显著增高,常在200分/100NC以上,也有利于与慢性粒细胞白血病鉴别.
2)其他血液病
各类贫血 再障时NAP积分值增高,阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)和MDS时NAP积分值一般减低.因此NAP检测有助于与PNH,MDS等疾病的鉴别.
真性红细胞增多症时NAP积分值显著增高,继发性红细胞增多症NAP积分正常或降低,这是两者的鉴别方法之一.其他慢性骨髓增生性疾病,如骨髓纤维化,原发性血小板增多症等,NAP积分值增高.
恶性组织细胞病时NAP积分值明显减低,而反应性组织细胞增多时NAP积分值往往增高,有助于两者鉴别.
细菌性感染时NAP积分值增高,病毒感染或寄生虫,立克次体感染时NAP积分值一般正常或降低.该检测对鉴别细菌感染与其他感染有一定价值.
(4)氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色的原理和临床意义
[原理] 细胞内的氯乙酸AS-D萘酚酯酶(naphythol AS-D chloroacetate esterase,NAS-DCE)水解基质液中的氯乙酸AS-D萘酚,产生AS-D萘酚,进而与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀,定位于细胞质内酶所存在的部位.本试验常用的重氮盐为坚牢紫酱GBC,形成的有色沉淀为红色.NAS-DCE几乎仅出现在粒细胞,其特异性高,因此又称为\"粒细胞酯酶\",\"特异性酯酶\".
[临床意义] 临床上主要用于急性白血病类型的鉴别 急性粒细胞白血病和急性早幼粒细胞白血病原粒细胞NAS-DCE染色多呈(+)-(++),白血病性早幼粒细胞呈(++)-(+++);急性单核细胞白血病 原,幼单核细胞多呈阴性反应;急性淋巴细胞白血病 原,幼淋巴细胞呈阴性反应.
(5)中性非特异性酯酶染色的原理和临床意义
[原理] 中性非特异性酯酶包括醋酸AS-D萘酚酯酶(naphytholAS-D acetate esterase,NAS-DAE)染色和α-醋酸萘酚酯酶(α-naphythyol acetate esterase , α-NAE)染色.细胞内的α-醋酸萘酚酯酶(α-naphythyol acetate esterase , α-NAE)在pH中性的条件下水解基质液中的α-醋酸萘酚,释放出α-萘酚,进而与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀,定位于细胞质内酶所在的部位.
[临床意义] 主要用于急性白血病类型的鉴别.NAS-DAE染色属于中性非特异性酯酶染色,在鉴别白血病类型时需同时做NaF抑制试验.急性粒细胞白血病的原粒细胞NAS-DAE染色可呈阳性反应,且不被氟化钠抑制;急性早幼粒细胞白血病的白血病性早幼粒细胞NAS-DAE染色为阳性或强阳性反应,亦不被氟化钠所抑制;急性单核细胞白血病的原,幼单核细胞NAS-DAE染色多呈阳性或强阳性反应,但能被氟化钠抑制;急性粒-单核细胞白血病的阳性反应的单核细胞系白血病细胞能被氟化钠抑制,而粒系白血病细胞则不被抑制;急性淋巴细胞白血病的原,幼淋巴细胞呈阴性或弱阳性反应,且不被氟化钠抑制.
(6)碱性α-丁酸萘酚酯酶染色的原理和临床意义
[原理] 细胞内的α-丁酸萘酚酯酶(α-naphythyol butyrate esterase, α-NBE)在pH碱性条件下水解基质液中的α-丁酸萘酚,释放出α-萘酚,后者与基质液中的重氮盐耦联形成不溶性的有色沉淀,定位于细胞质内酶所存在的部位.本试验常用的重氮盐为坚牢紫酱GBC,形成的有色沉淀为红色.α-NBE主要存在于单核细胞中,其阳性产物能被氟化钠抑制,而其他细胞系列的阳性产物不能被氟化钠抑制.
[临床意义] 常用于急性白血病类型的鉴别.急性粒细胞白血病的原粒细胞和早幼粒细胞呈阴性反应,少数为弱阳性反应;急性单核细胞白血病的 原,幼单核细胞多呈阳性反应,能被氟化钠抑制;急性淋巴细胞白血病的原,幼淋巴细胞常呈阴性反应;多毛细胞白血病的多毛细胞呈弥散分布,颗粒细小的阳性反应,亦可见聚成半月形的粗颗粒,不被氟化钠抑制;恶性组织细胞病的异常组织细胞可呈阳性,但不被氟化钠抑制.
(7)酸性磷酸酶染色的原理和临床意义
[原理] 细胞内的酸性磷酸酶在酸性条件下,将基质中的磷酸萘酚AS-BI水解,释出萘酚AS-BI,再与重氮盐耦联,形成不溶性有色沉淀,定位于胞浆中.
[临床意义]
1)白血病类型鉴别 多毛细胞白血病的多毛细胞ACP染色呈强阳性或中度阳性反应,并耐L-酒石酸抑制作用;急性单核细胞白血病的原,幼单核细胞ACP染色为强阳性反应;急性淋巴细胞白血病的原淋巴细胞ACP染色常呈弱阳性反应;急性粒细胞白血病的原粒细胞对ACP染色反应不一;慢性淋巴细胞白血病和淋巴瘤的淋巴细胞ACP染色也可阳性,但可被L-酒石酸抑制,有助于与多毛细胞鉴别.
2)鉴别T淋巴细胞和B淋巴细胞 T淋巴细胞ACP染色呈阳性反应,颗粒粗大,密集,局限性块状;B淋巴细胞ACP染色呈阴性反应,或为颗粒稀疏,细小的弱阳性反应.
3)戈谢细胞和尼曼-匹克细胞的鉴别
戈谢细胞ACP染色呈强阳性反应;尼曼-匹克细胞呈阴性或弱阳性反应.
(8)酯酶双染色的原理和临床意义
[原理] 在同一张涂片上进行两种酯酶染色的方法称为酯酶双染色.多数采用一种特异性酯酶加一种非特异性酯酶染色,常用的有α-醋酸萘酚酯酶与氯乙酸AS-D萘酚酯酶双染色,α-丁酸萘酚酯酶与氯乙酸AS-D萘酚酯酶双染色等.反应的原理基本上同各自的染色原理,同一张涂片上的细胞要分别在两种不同的基质液中作用一定时间,最后复染,显微镜观察.
[临床意义]
酯酶双染色可同时观察两种不同的白血病细胞,因此在鉴别白血病类型方面明显优于单项染色.
1)急性粒-单核细胞白血病 该染色法在急性粒-单核细胞白血病的同一张涂片上可分别出现α-NBE染色和NAS-DCE染色阳性反应的细胞,甚至少数病例在单个细胞内同时出现以上两种酯酶染色的双重阳性反应,因此酯酶双染色反应在急性粒-单核细胞白血病的诊断上具有独特价值.
2)急性粒细胞白血病 粒细胞白血病NAS-DCE染色可出现不同程度的阳性反应,α-NBE染色则为阴性.
3)急性单核细胞白血病 α-NBE染色为阳性或强阳性反应,NAS-DCE染色为阴性,有助于与急性粒细胞白血病的鉴别.
4)急性淋巴细胞白血病 NAS-DCE染色及α-NBE染色在淋巴细胞均呈阴性反应.
(9)骨髓铁染色的原理和临床意义
[原理] 骨髓中的含铁血黄素(细胞外铁)和中,晚幼红细胞胞浆中的铁蛋白聚合物(细胞内铁)经普鲁士蓝反应形成蓝色的亚铁氰化铁沉淀,定位于细胞内外铁存在的部位.正常人骨髓细胞外铁为+-++.铁粒幼细胞阳性率为19%-44%.铁染色(iron stain;IS)中的细胞外铁反映骨髓中铁的储存量,细胞内铁反映骨髓中可利用铁的量.
[临床意义]
1)鉴别缺铁性贫血与非缺铁性贫血,前者细胞外铁减少甚至消失,铁粒幼细胞的阳性率明显减低,铁颗粒着色浅淡.
2)有助于铁粒幼细胞贫血的诊断和鉴别诊断.铁粒幼细胞贫血时铁粒幼细胞增多,且可见环形铁粒幼细胞,比例可达30%-90%.MDS的RAS型也可见环形铁粒幼细胞增多(占幼红细胞的15%或更多),借此可与再生障碍性贫血鉴别.
4.骨髓活检
骨髓活体组织检查(bone marrow biopsy, BMB)简称骨髓活检.是观察骨髓组织结构,补充骨髓涂片检查的一种方法.
(1)骨髓活检与骨髓穿刺的区别
骨髓活检和骨髓穿刺在临床的应用各有优势,骨髓穿刺比较常用,两种检查的优缺点见表(表2-2).
表2-2 骨髓穿刺及骨髓活检比较
骨髓穿刺
骨髓活检
取材方式
用骨髓穿刺针抽骨髓液后涂片瑞-姬染色后备检
用骨髓活检针取得一条骨髓组织,固定包埋切片后行姬姆萨等染色后备检
优点
1.操作较简便
2.涂片中细胞分布均匀,胞体舒展,染色良好,较易分辨各系原,幼细胞及其微细结构
3.易于识别巨型变,巨幼样变和小巨核细胞
4.细胞化学染色效果好,结果可量化
1.保持造血组织的天然结构,便于判断红髓和脂肪组织的比例
2.较全面了解骨髓增生程度,有核细胞密度及其布局
3.可避免血窦血的稀释
4.对骨髓纤维化,毛细胞白血病有确诊作用,能提示骨髓增生异常综合征向急性粒细胞白血病的转化,对\"干抽\"有鉴别作用
缺点
1.造血组织的天然结构已遭破坏,无法判断红髓,黄髓比例
2.若抽吸过猛,导致血窦血的稀释
3.若遇\"干抽\"不能分析
1.有核细胞群集,不易区分原,幼细胞的类型
2.难以观察细胞内的微细结构
3.细胞化学染色结果难以量化
(2)骨髓活检的临床应用
1) 可较全面而准确地了解骨髓增生程度,造血组织,脂肪细胞或纤维组织所占的容积比例;了解粒/红比值及骨髓内铁储存情况,对于某些疾病(如再生障碍性贫血,缺铁性贫血及骨髓增生异常综合征)及化疗后骨髓抑制程度有明确的诊断价值.
2)可以发现骨髓穿刺涂片检查不易发现的病理变化,对相关疾病的诊断,骨髓造血微环境及骨髓移植的研究有重要意义.
3) 活检比涂片能较早地预测疾病的预后.
4)可协助诊断慢性骨髓增生性疾病,如真性红细胞增多症,原发性血小板增多症,骨髓纤维化等.
5.血细胞免疫标记技术
(1)流式细胞仪的构造,原理,主要技术指标和临床应用
1)流式细胞术和流式细胞仪
流式细胞术(Flow cytometry; FCM)是集计算机技术,激光技术,电子技术,流体力学,细胞化学,细胞免疫学等多种高新技术与方法为一体的现代细胞分析技术.它以流式细胞仪(Flow cytometer)为工具,在单细胞水平上对大量细胞进行快速,准确,多参数的定量分析或分选,是现代血细胞学研究中较先进的分析技术.
流式细胞仪(flow cytometer,FCM)是流式细胞分析和分选所必需的仪器. FCM的主要构造可分为:①流动室与液流驱动系统;②激光光源及光束成形系统;③光学系统;④信号检测,储存,显示,分析系统;⑤细胞分选系统.
2)流式细胞仪工作原理
待测标本与荧光素标记的单克隆抗体(McAb)或与某些荧光染料结合后形成一定浓度的细胞悬液并放入流式细胞仪的样品管中,细胞在气体的压力下进入流动室.在流动室内鞘液的约束下,细胞排成单列从流动室的喷嘴高速喷出成为细胞液柱.细胞液柱与入射激光束垂直相交,相交点为测量区.通过测量区的细胞被激光照射后产生光散射并发出荧光,散射光与荧光穿过滤光片,被光电倍增管或光电二极管接收并转变为电信号,这些信号经加工处理储存于计算机中,用计算机软件对储存数据进行图像显示,运算,分析等,即可特异地获得血细胞的一系列重要的物理,生化,免疫学特征和功能状态等参数.
3)流式细胞技术在血液系统疾病中的应用
①白血病免疫分型
FCM免疫分型较多用于以下几种情况:Ⅰ用形态学,细胞化学染色不能确定细胞来源的白血病;Ⅱ形态学类似急性淋巴细胞白血病(ALL)或急性未分化白血病(AUL);Ⅲ混合性白血病.白血病的免疫分型对急性髓系细胞白血病(M0,M1,M2,M3,M6,M7)的分型诊断有重要意义,但对急性粒单细胞白血病(M4)和急性单核细胞白血病(M5)的分型还有一定的难度,对微量残留白血病的检测也有重要价值.
②淋巴细胞免疫表型分析
③血小板病诊断
④网织红细胞分析
⑤造血干/祖细胞计数
⑥细胞免疫功能分析
⑦DNA倍体与细胞周期分析
⑧白细胞分类计数
⑨细胞分选
流式细胞仪可将样本中所需要的细胞亚群从群体细胞中分离出来,即所谓分选(sorting).
(2)常用FISH技术的种类,原理,方法和临床应用
1)普通FISH
荧光原位杂交技术(flourenscent in situ hybridization,FISH).它用生物素(biotin)标记探针,通过荧光-抗生物素蛋白(avidine)酶联反应,在荧光显微镜下观察荧光信号即表示探针杂交的部位.FISH包括染色体FISH,间期核FISH等.FISH技术不仅可以测定中期染色体的特异序列,而且也能敏感地测定间期细胞核中的特异序列,这一优势在白血病的检测中尤为重要,因为它弥补了白血病患者骨髓细胞培养后难以获得高质量中期染色体的缺陷.
2)DNA纤维荧光原位杂交
DNA纤维FISH的优点是分辨率高,可达到1-500kb,可快速对探针排序,确定方向,测定探针间距离;较适用于端粒附近基因富集区的基因排序;对材料要求不高,新鲜组织,冰冻组织或石蜡标本等均可;对基因拷贝数的判定比较准确,可消除传统的中期FISH由于信号分裂引起基因拷贝数判断的错误.
3)比较基因组杂交(CGH)
CGH方法是近年来在多色染色体FISH基础上发展起来的—种新的分子遗传学技术,可用来确定间期核或中期细胞的染色体异常,且不需进行肿瘤细胞培养和制备其中期染色体标本,也不需事先了解染色体的结构和可能存在的异常.在一次实验中就可对整个基因组中所有的染色体异常进行总的分析.该技术在血液系统恶性肿瘤研究中已得到广泛应用.
4)多重FISH(M-FISH)
M-FISH可以检测许多具有结构异常标本或肿瘤样本中简单或复杂的染色体异常,可以解决常规染色体分析不能精确识别的染色体异常.如M—FISH可识别染色体数目异常及一些结构重排,如整条染色体的获得或丢失,简单或复杂的易位.应用比例长度分析及染色体条带转换图也可以识别染色体易位断裂点.M-FISH可以从已定论的疾病如白血病中发现新的隐匿的染色体异常.
(3)免疫细胞化学染色
免疫细胞化学染色是将血液,骨髓液,浆膜腔积液等等各种体液组织制成的涂片和骨髓等组织的切片经各种单克隆抗体的标定和常用的过氧化物酶或碱性磷酸酶显色后对白血病细胞直接镜检,以确定细胞类型.
免疫组织化学染色方法繁多,可根据标记物的不同分为:免疫酶细胞化学染色,免疫荧光细胞化学染色,免疫金银染色技术以及亲合免疫组织化学染色技术等.目前血液系统疾病检查常用免疫细胞化学染色方法有三种:过氧化物酶-抗过氧化物酶(PAP)法,碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶(APAAP)法和亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC-AP)法.
应用骨髓切片免疫组织化学技术可以对骨髓细胞进行原位观察,通过对细胞特异性抗原的定性,定位和定量分析,了解骨髓组织和细胞的结构和变化,这对血液系统疾病尤其是血液系统肿瘤的诊断,鉴别诊断,以及血液肿瘤的分类,分型和预后的判断提供了有利的研究手段.
6.造血干/祖细胞培养
体外造血干/祖细胞培养主要是利用造血干/祖细胞的生物学特性检测其在骨髓,血液和脐血中的数量及生物活性,同时也可应用于体外造血干/祖细胞类型,特性及生理意义的实验研究,在造血系统疾病的发生机制,诊断,疗效,预后判断及治疗药物的选择等方面具有十分重要的意义.
(1)常用造血干/祖细胞培养的种类和原理
1)粒-单系造血祖细胞培养
[原理] 受检者血液,骨髓或脐血经过分离获得的单个核细胞在HGFs的作用下,在体外半固体琼脂上形成由不同成熟阶段的粒细胞和单核细胞组成的细胞集落.刺激CFU-GM生长的造血生长因子主要有:GM-CSF,IL-3,G-CSF,M-CSF及SCF等.
[临床应用]
①CFU-GM减少 常见于再生障碍性贫血,阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH),急性白血病,慢粒急变期,红白血病,骨髓纤维化及骨髓增生异常综合征.
②CFU-GM增加 慢性粒细胞白血病(CML),真性红细胞增多症(部分患者伴白细胞增多)及部分缺铁性贫血患者.
2)红系祖细胞的培养
[原理] CFU-E集落为由8-50个细胞组成的细胞团.BFU-E集落为50个以上细胞组成的细胞团,形似烟火礼花,故称BFU-E.在培养体系中选择甲基纤维素作为支持物,加入适量EPO和BPA,使骨髓中红细胞系造血细胞形成BFU-E和CFU-E.每个集落可视为由一个红系祖细胞增殖分化而来,所以集落数的多少可反映培养物中红系祖细胞的量.CFU-E与BFU-E对EPO和BPA的敏感性及集落细胞多少的不同,培养时间和培养方法也有所不同.
[临床应用]
①BFU-E或CFU-E减少 见于再生障碍性贫血,单纯红细胞性再障(PRCA),急性白血病(AML和ALL更明显),慢粒急变,红白血病及铁粒幼细胞性贫血(SA)等.
②BFU-E或CFU-E增加 见于真性红细胞增多症,原发性骨髓纤维化(PMF)及部分慢粒患者.
3)巨核系祖细胞培养
[原理] 以血浆凝块或甲基纤维素为支持物,加入再生障碍性贫血患者血清或TPO,IL-3及SCF等生长因子,使骨髓中巨核系祖细胞形成CFU-MK.
[临床应用]
①CFU-MK减少 常见于再生障碍性贫血,获得性无巨核细胞性血小板减少性紫癜,骨髓增生性疾病,血小板减少症和白血病等.
②CFU-MK增加 常见于慢性粒细胞白血病,在慢粒急变时仍有较高的CFU-MK.
4)混合祖细胞培养
[原理] 以甲基纤维素作为支持物,配以各种造血生长因子如IL-3,GM-CSF和EPO或PHA-LCM加EPO作为CFU-MIX刺激因子,体外受检者骨髓造血细胞可形成含有红,粒,单核及巨核细胞系的混合集落(CFU-MIX或CFU-GEMM).
[临床应用] CFU-GEMM有助于调节多向祖细胞分化与增殖的各种刺激因子的生物活性的定量研究.CFU-GEMM产率较低,临床疾病研究还较少,一般再生障碍性贫血CFU-GEMM减少,慢性粒细胞性白血病时其增殖率增高.
7.血细胞染色体检验
(1)非显带染色体和显带染色体相关概念和技术
1)非显带染色体技术
①直接法
抗凝骨髓标本不经培养,以PBS稀释后加入秋水仙素\"阻留\"中期细胞,经低渗液处理后,再经预固定,固定后即可制片,染色,镜检.秋水仙素能干扰有丝分裂纺锤体形成,使细胞\"阻留\"在分裂中期,增加中期细胞数目.低渗处理则使染色体分散,铺展开来,便于分析.
②短期培养法
抗凝骨髓标本在含小牛血清的培养液中于37℃培养24h或48h左右,加入秋水仙素\"阻留\"中期细胞.其他同直接法.
③非显带染色体的识别和命名
中期染色体的形态:每条染色体上有一收缩成极小的部分,称为着丝粒,该处为染色体的缩窄处,又称为主缢痕(primary constriction).着丝粒在染色体上的位置各不相同,可将染色体分为二部分,染色体的短臂(short arm)用p表示;染色体的长臂(long arm)用q表示.在染色体上也可看到其他的收缩凹陷处,称为次级缢痕(secondary constriction).有些染色体的一端还可有球形小体,称随体(satellite),多见于近端着丝粒染色体.每条染色体的短臂和长臂末端称为端粒(telomere).根据着丝粒位置的不同,可将染色体分成三种:中着丝粒染色体(metacentric chromosome),亚中着丝粒染色体(submetacentric chromosome)和近端着丝粒染色体(acrocentric chromosome).
人类46条染色体可分为7组:A组,1-3号染色体,为大型中着丝粒染色体;B组,4,5号染色体,为大型亚中着丝粒染色体;C组:6-12号和x染色体,为中型亚中着丝粒染色体 ;D组,13-15号染色体,为中型近端着丝粒染色体;E组,16-18号染色体,为中型亚中着丝粒染色体;F组,19,20号染色体,为小型中着丝粒染色体;G组,21,22号和Y染色体,为小型近端着丝粒染色体.
将人体细胞秋水仙素中期染色体经显微摄像后,按以上分组排列成一套染色体图像,称为核型分析(karyotyping).这一套染色体图像就称为核型(karyotype)
2)显带染色体技术
①G显带
标本先经某种处理,再以姬姆萨染色后使染色体显带的方法.G显带的机制较复杂,一种观点认为,DNA上富含A-T碱基对的DNA和组蛋白结合紧密,胰酶处理时不易高度抽提,和染料亲和力较强,呈深带;而富含G-C碱基对的区段结合的蛋白质容易被胰酶抽提,和染料亲和力降低,呈浅带.
②R显带
R带带纹与G带,Q带正好相反,即前者的阳性带相当于后者的阴性带,而前者的阴性带则相当于后者的阳性带.R带按制备方法不同可分为荧光R带和姬姆萨R带两种类型.其显带机制尚未完全明了,可能由于DNA受热变性,使富含A-T碱基对的区段单链化,故不易为姬姆萨染色,呈浅带;而富含G-C碱基对的区段仍保持正常的双链结构,易于染色,故显深带.
③染色体同步化及高分辨染色体技术
中期染色体常规显带方法在一套单倍体仅能显示322条带,分裂中期的早,中阶段染色体较长,而晚中期以后的染色体较短小.为了获得较长而带纹更加丰富的染色体,采用某些药物如氨甲碟吟(MTX)等阻断DNA的合成达一定时间,细胞高度阻滞在细胞周期的同一位置,当阻断作用解除后各细胞的DNA合成重新同步进行,细胞即处于同一分裂周期,可获得分裂较早期的细胞.在上述同步化基础上,使用某些抑制剂抑制染色体的收缩,可使染色体长度增加20%左右,显带后可达到400-800条带,即所谓高分辨染色体显带.
(2)常见染色体数目和结构异常的有关概念和表示方法
1)染色体数目异常
染色体数目异常的主要原因是由于减数分裂或有丝分裂时染色体不分离(non-disjunction).常见的有整倍体,非整倍体,嵌合体三种.
①整倍体
如果所有的同源染色体在生殖细胞成熟分裂时全部归于—个细胞,那么这个生殖细胞的染色体数目仍然是二倍体.此生殖细胞和正常的生殖细胞结合就会形成三倍体(triploid).如果两个这种生殖细胞结合就会形成四倍体(tetraploid).这些均属整倍体(euploid).
②非整倍体
如果生殖细胞在成熟分裂时仅仅有个别染色体发生不分离,结果造成受精卵中染色体的数目不是染色单体的倍数,则称为非整倍体.因个别染色体增加而染色体总数超过二倍体者,称为超二倍体(hyperdiploid);少于二倍体者,称为低二倍体(hypoidploid).如果染色体数目仍然是二倍体,但不是23对,而是个别染色体增加合并,个别染色体缺失,则称为假二倍(pseudodiploid).
③嵌合体
如果染色体不分离现象发生在受精卵卵裂过程及胚胎发育早期的细胞分裂过程中,则此胚胎的部分细胞发生染色体数目异常,一个个体具有几个不同核型的细胞系,称为嵌合体.嵌合体的临床表型一般比较轻.
2)染色体结构异常
①缺失(deletion)
指染色体臂的部分丢失,用del表示.
②重复(duplicatlon)
指同源染色体中—条断裂后,其断片连接到另一条同源染色体的相对应部位或由同源染色体间的不等交换,使一条同源染色体上部分基因发生重复,而另一条同源染色体相应缺失,一般用dup表示.
③倒位(inversion)
指染色体中的某一片段断裂下来,颠倒1800后重新连接,造成原来基因顺序的颠倒.倒位用inv表示.
④易位(translocatiol)
指染色体的节段位置发生改变,即一条染色体断裂后,其片段接到同一条染色体的另一处或接到另—条染色体上去.易位用t(A;B)的形式表示,A,B分别表示发生易位的两条不同染色体.
易位分相互易位(reciprocal translocation)和非相互易位(nonreciprocal translocation)两种.相互易位指发生易位的两条染色体都发生断裂,断片相互交换.非相互易位指仅一条染色体发生断裂,断片插入到另一条染色体中或接在另一条染色体的末端.
凡是易位后主要的遗传物质没有丢失,个体表型正常的,称为平衡易位(balanced lranslocation).而易位后丢失了部分遗传物质,造成个体表型异常的,称为不平衡易位(unbalanced translocation).
(3)染色体分析在临床血液学中的应用
1)在白血病中的应用
①在白血病诊断和分型中的应用
在多种白血病和其它血液系统疾病中可发现特异性的和非特异性的染色体异常.染色体异常的检出对血液系统疾病的诊断,鉴别诊断等显示越来越重要的作用.如CML患者中费城(Ph)染色体发生率可达90%以上,成为慢性粒细胞白血病的细胞遗传学标志.该染色体异常是9号染色体长臂3区4带(9q34)和22染色体长臂1区1带(22q11)相互易位所致,对CML 的诊断具有重要意义.50%-80%的急性髓细胞白血病(AML)中可发现克隆性染色体异常.由于特异性染色体异常对疾病诊断有标志和分类的意义,故被MIC协作组列为急性白血病MIC(形态学,免疫学和细胞遗传学)分型的主要指标之一.
②在白血病预后判断,指导治疗中的作用
AML中具有t(15;17),inv(16),t(8;21)异常的病人对治疗反应良好,缓解期较长,而具有-5,-7,+8及t(9;22)的AML病人则预后较差.在ALL中,染色体数超过50的超二倍体者对治疗的反应良好,而t(9;22),t(4;11)及:t(8;14)者则预后很差,生存期多小于1年.
慢性粒细胞白血病(CML)患者出现双倍Ph,+8,i17q等新的异常克隆时,往往预示着急变,核型异常对慢性淋巴细胞白血病(CLL)的预后判断具有重要意义.
③鉴别白血病微小残留病灶
微量残留白血病(minimal residual leukemia,MRL)是指白血病经化疗或骨髓移植后达到完全缓解,而体内残存微量白血病细胞的状态,估计此时仍有106-108个白血病细胞存在,但用形态学方法已难以检出.这些残留的白血病细胞是复发的根源,是导致白血病患者不能长期生存的重要因素.当临床及形态学还没有复发的证据时,检测到原已消失的克隆性染色体异常和(或)新的克隆性染色体异常时,往往预示疾病将复发.
2)在骨髓增生异常综合征中的应用
染色体异常可见于40%-80%的MDS,常表现为染色体的丢失,缺失,亦可见染色体增加和结构异常如-7,-17,-Y,5q-,7q-以及+8,+ll和t(3;3)(q21;q26),t(5;17)(q32;q12)等.在MDS与再障,阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)等疾病的鉴别中染色体分析技术有十分重要作用.染色体分析也有利于判断MDS的转归及预后.
3)在淋巴瘤中的应用
核型异常同恶性淋巴瘤亚型相关.如大多数Burkitt淋巴瘤具有t(8;14),少数为t(2;8)和t(8;22).核型异常对淋巴瘤的预后判断价值也是明确的,如约85%的滤泡性(follicular)淋巴瘤具有t(14;18),或单独存在或与其他异常一起存在,前者预后良好而后者预后差.
4)在其他血液病中的应用
约40%的PV有克隆性染色体异常,常见的染色体异常有del(2v)(q11),+8和+9,可见于PV病程的始末,存在克隆性染色体异常,应列为PV的主要诊断条件之一.染色体核型分析为PV诊断和鉴别诊断提供了有力的证据.
原发性骨髓纤维化染色体异常核型检出率约为30%,最常见的染色体异常为-7,-9,+8,+2或lq,13q等结构异常.由于许多情况可伴继发性骨髓纤维化,而单纯骨髓和外周血检查又难以确诊,须依靠排除性诊断.核型分析有助于原发性骨髓纤维化的诊断和鉴别诊断.
5)在骨髓移植中的应用
染色体检查是验证骨髓移植是否成功的常用方法.在供,受者性别不合时,如男性受者接受了女性骨髓,移植后造血细胞中Y染色体消失,或女性受者接受了男性骨髓,造血细胞中出现了Y染色体,均表示完全的植入.染色体的转换常发生于移植后1个月内.
如受,供者性别相同,则可用常染色体多态性标志进行鉴别.如移植前具有随体的受者移植后随体消失或移植前不具有随体的受者移植后出现了随体,均表示植入成功.具有核型异常的白血病受者移植后原有的异常核型为正常核型所代替,也可证明移植成功.
8.分子生物学检查
血液分子生物学检验技术主要包括PCR技术,DNA测序技术,限制性片段长度多态性(RFLP),转基因技术及基因芯片(DNA-chip)技术等分子生物学技术.目前这些技术已应用于血液病基因分析,基因诊断,白血病分型,指导治疗,判断预后和微小残留病检测等方面.
(1)核酸分子杂交技术原理和方法
1)Southern印迹杂交
2)Northern印迹杂交
3)核酸原位杂交
(2)聚合酶链反应原理和常用PCR产物检查方法
聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术于1985年由美国Mullis等建立.PCR技术使体外扩增核酸片段成为可能,使人们能够在几小时内从试管中获得大量特异核酸片段.由于核酸是生物体储存和传递遗传信息的载体,因此能够迅速获得大量特异核酸片段的PCR技术给生命科学各个领域的研究手段带来了革命性的变化.该技术已经与DNA克隆,DNA重组和DNA测序等技术一样成为血液分子生物学一项不可缺少的工具.
1)PCR产物检测
①琼脂糖凝胶电泳
②Southern印迹杂交
③斑点杂交法
④PCR-ELISA法
⑤原位杂交法
(3)以PCR为基础的相关技术
近年来PCR技术在应用的过程中得到了进一步的发展.目前已出现多种以PCR为基础的PCR相关技术,形成了适用于不同目的的PCR技术系列,以下是几种在血液学及检验领域应用较多的PCR相关技术.
1)逆转录PCR
逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)是以细胞内总RNA或mRNA为材料进行的体外扩增技术.由于耐热的DNA聚合酶不能以RNA或mRNA作为模板,因此必须先将总RNA或mRNA作逆转录,生成与之互补的cDNA,然后再以cDNA作为模板进行PCR扩增,得到所需要的目的基因片段.RT-PCR常用于克隆cDNA,合成cDNA探针以及分析基因表达等.
2)定量PCR
最初的PCR技术只是用于定性检测DNA或RNA,对PCR产物的数量并不重视.随着科学研究的逐步深入,人们开始考虑用PCR技术来进行DNA或RNA的定量检测,随之出现了定量PCR(quantitative PCR,Q-PCR)技术这一新名词.目前常用的Q-PCR技术可分为终点法和实时法.
3)多重PCR
多重PCR(multiplex PCR)即在同一反应体系中加入多对引物,以同时扩增一份DNA样品中多个不同序列的靶片段.多对引物间的组合必须满足二个条件,一是将反应条件较为接近的引物组合在一起,以使该反应条件能尽量适合所有被扩增片段,二是同一反应内各扩增片段的大小应不同,以便检测时能通过电泳将各片段分离开.多重PCR比较适用于被检测基因较大,突变点较多的基因.
4)差异显示PCR
差异显示PCR(differential display PCR,DD-PCR)是一种以逆转录PCR为基础的研究基因表达差异的技术.基因在不同组织细胞中的表达不同,在细胞的不同发育阶段和状态中的表达也有差异.研究基因表达谱的变化有助于理解细胞分化,增殖,细胞周期的调节和细胞衰老,凋亡的过程.
5)原位PCR
原位PCR(in situ PCR)是指组织固定处理细胞内的DNA或RNA,并以其作为靶序列进行PCR反应的过程.原位PCR与普通PCR的主要区别在于模板的制备.经脱蜡处理的组织切片或细胞悬液均可作为扩增样品,所有反应在载玻片上进行.原位PCR技术不仅不需要从组织细胞中分离模板DNA或RNA,而且能在细胞原位进行PCR扩增,大大地提高了检测的灵敏度.目前,原位PCR已成为研究靶基因序列的细胞定位,组织分布和基因表达检测的重要手段.
(4)基因芯片技术
基因芯片技术又称DNA微阵列(DNA - chip).该技术是二十一世纪生命科学领域广泛应用的一项高效快速的分子生物学技术.DNA-chip是将大量以特定排列方式的基因探针或基因片段固定于硅片,玻片和塑料片上,样品DNA或RNA通过PCR扩增,体外转录等技术掺入荧光标记分子,与微阵列杂交后再通过荧光扫描仪及计算机分析,即可获得样品大量基因序列及表达信息.目前,基因芯片技术主要应用于白血病的免疫分型,细胞的基因表达检测,基因异常检测及单核苷酸多态分析等.
(5)分子生物学检查在血液学中的应用
1)恶性血液病融合基因的检测
白血病染色体相互易位是导致染色体重排的最常见原因.染色体重排在分子水平上常形成融合基因.重组产生的融合基因及其融合蛋白是疾病的特异性分子标志.融合基因检测对疾病的诊断,分型,治疗方案的选择,预后判断及微小残留病的检测都有重要的意义.
慢性粒细胞白血病(CML)Ph 染色体易位的后果是使位于9q34上的ABL原癌基因易位至22q11的BCR基因上,形成BCR-ABL融合基因,表达一个具有高酪氨酸激酶活性的BCR-ABL融合蛋白,后者是CML发病的分子基础.
急性早幼粒细胞白血病(APL)特异性染色体易位是t(15;17)(q22;q21),易位的结果使15号染色体的PML原癌基因与17号染色体上的维甲酸受体a(RARa)基因融合产生PML-RARa融合基因.临床上变异型APL(M3v,M3b)与急性粒细胞白血病部分分化型(M2)较难鉴别,M2的t(8;21)可产生一种融合基因AML1-ETO,这种融合基因在M2中的发生率为20%-40%,在M2b中可达90%,通过融合基因的检测可准确鉴别这两种白血病.融合基因的检测对治疗方案的选择有明确的指导作用,在ATRA和化疗达完全缓解(CR)的M3,PML-RARa融合基因阳性者极易在十个月内复发,而融合基因阴性者,复发率低.
2)免疫球蛋白重链(IgH)基因和T细胞受体(TCR)基因重排的检测 IgH和TCR的编码基因具有多态性.IgH基因重排是产生个体多样性和独特性的主要原因.由于白血病细胞源于造血干细胞,所以白血病细胞是单克隆性的.用PCR方法对重排基因进行扩增,正常白细胞的扩增产物大小不等,呈模糊的阶梯状,而白血病细胞扩增产物经电泳后条带是单一的.约80%的B淋巴细胞白血病可检测到IgH基因重排.通过PCR方法检测IgH和TCR基因重排,有助于急性淋巴细胞白血病的分型以及微量残留的检测.
3)遗传性血液病的诊断 血红蛋白病是常见的遗传性溶血性疾病,血友病是常见的遗传性出血性疾病.基因缺陷包括基因缺失,点突变,插入,倒位等.对于基因重排,可通过RT-PCR进行检测;对于点突变则可用PCR结合酶切位点分析,即当点突变使某一酶切位点消失或在某一区域出现新的酶切位点时,可用该酶切点两侧的引物进行扩增,然后将扩增产物用适当的内切酶切割,根据电泳图谱来判断有无内切酶切点的改变.对于与限制性内切酶点无连锁的点突变,则可采用PCR结合特异寡核苷酸探针(ASO)斑点杂交法进行诊断.
4)HLA基因多态性检测 采用PCR扩增产物的反相杂交(斑点杂交)进行HLA基因多态性检测十分简便,有效.将每个位点的所有寡核苷酸探针固定在固相支持物上,引物先经生物素化后,进行待测DNA的基因扩增,从而得到生物素化的DNA放大产物.用此产物与膜上的探针杂交,然后进行显色或化学发光.这样每个样本只需杂交一次即可完成.此方法适合骨髓移植的HLA基因配型及HLA基因与疾病相关性分析等.
5)肿瘤细胞多药耐药基因的检测 多药耐药性(multidrug resistance, MDR)是指肿瘤细胞接触了一种药物以后,不但对该药产生耐药性,而且对其他结构的作用机制不同的药物也产生耐药性.研究发现,MDR的出现常与多药耐药基因(MDR1)过度表达有关,目前已建立Northern印迹法,斑点和狭缝印迹法,RT-PCR法及原位杂交法,从mRNA水平对患者进行测定,了解肿瘤细胞的耐药特性.有研究表明,急性髓细胞白血病MDR1的表达与预后有密切相关,即MDR1阳性者CR率低,生存期短,且易早期复发.
6)基因治疗 基因治疗的目的是应用DNA重组技术和基因转移技术,把野生型的基因导入患者体细胞内,成为正常的基因产物,来补偿缺陷基因的功能,从而使疾病得到纠正.目前认为基因治疗的靶细胞是造血干细胞或间质干细胞等.常用的载体是逆转录病毒和腺病毒.采用含人因子Ⅸ基因逆转录病毒载体转染血友病B患者的原代皮肤成纤维细胞,使其表达一定浓度的因子Ⅸ,这将为血友病B治疗提供新的方法.
第三章 红细胞系统
1.红细胞系统形态
(1)红细胞的生成
正常人红细胞的生成包括:造血干细胞阶段,红系祖细胞阶段,红系前体细胞(原红细胞至晚幼红细胞)的增殖与分化阶段,网织红细胞的增殖及成熟过程,以及网织红细胞向外周血释放成熟红细胞的过程.
1)造血干细胞阶段
① 数量及部位:造血干细胞主要存在于骨髓,脾,肝等造血组织内.也有少量循环于外周血中.
② 细胞特点:99.5%以上的干细胞是处于G0静止期.造血干细胞具有不断地进行自我更新,维持在体内一定的数量和保持自己的特性,同时又具有向骨髓红系,粒系和巨核系祖细胞分化的能力,在体内呈不对称分布.
③ 影响其分化的因素:细胞与骨髓微环境;细胞表面;药物受体;环化酶系统;体液等多种因素的控制和调节;造血干细胞的内在基因控制也起一定的作用.
2)红系祖细胞阶段
① 细胞特征:该阶段是处于造血干细胞与红系前体细胞之间的细胞群;是调节红细胞生成自体稳定机制中的一个关键过程,早期祖细胞自我更新和自我维持的能力立即下降,晚期祖细胞完全进行对称性有丝分裂,完全丧失了自我更新的能力.
② 影响造血干细胞向红系祖细胞分化的因素:骨髓造血微环境(微血管系统,神经系统,造血间质细胞等),通过体液因子,细胞因子对造血干细胞的分化起特殊的作用和影响.
③ 红系祖细胞的分化特点:是随机的系限过程.造血祖细胞只向红系细胞发育.骨髓微环境起着决定性的作用,如造血组织氧分压增高,基质中的黏多糖变为中性,均有利于红系细胞的分化.
④ 分类: a)EPO反应细胞(erythropoietin reaction cell,ERC)或EPO敏感细胞(erythropoietin sensitive cell,ESC):指可在EPO的作用下向红系前体细胞的方向分化,增殖,最后成为成熟红细胞的这类细胞,无自我维持能力,是非均一的放大过渡细胞群;b)BFU-E:ERC或ESC细胞在高浓度的EPO条件下,当培养延续到14～16天,培养体系中会骤然生成由30000～40000个红系细胞组成的红系集落,称为红系爆式形成单位(burst forming unit-erthroid,BFU-E),可分化为红系集落形成单位(colony forming unit-cnhroid,CFU-E),数量为5～10/L×l05有核细胞,周围血中,量极少,仅占0.02%～0.05%;c)CFU-E:ERC或ESC在加入EPO的体外半固体培养环境中培养5～8天,可生成由8～65个红系细胞组成的细胞团,称为CFU-E.其形态学表现为核染色质细致,核大,有大核仁,有清楚的核周带及少量的嗜碱性胞浆.数量为50～400/L×105有核细胞,大部分处于活跃的DNA合成期,细胞表面带有较密的EPO受体,且依赖EPO存活.表达可识别红系特征的蛋白,包括唾液酸糖蛋白,血型糖蛋白A和Rh抗原,血型抗原等.转铁蛋白受体(TfR)此时表达最高.
3)红系前体细胞阶段
① 形态学特征:包括原始红细胞,早幼红细胞,中幼红细胞,晚幼红细胞,网织红细胞,红细胞.
② 代谢特点:细胞成熟过程中随着血红蛋白的增加,细胞核活性逐渐衰减,血红蛋白含量不断增加,RNA的含量不断减少;在中幼红细胞后期,细胞中血红蛋白含量≥13.5pg;晚幼红细胞已失去继续分裂的能力,以后细胞核浓缩并逸出,被单核吞噬细胞吞噬,或在脾脏内碎裂,溶解,成为无细胞核的网织红细胞;在成熟阶段不在合成血红蛋白.
③ 影响因素:红细胞成熟过程分裂的次数,细胞最终的大小与血红蛋白合成的快慢有一定的关系,如缺铁时的小红细胞是因为血红蛋白的合成速度慢,需要较长的时间才能达到需要的血红蛋白浓度,故在细胞核停止活动(或聚缩)之前分裂的次数多,造成细胞体积小;而在大细胞时过早地使细胞核变性,分裂的次数也减少.
④ 增殖时间:原始红细胞的增殖时间约为20小时,早幼红细胞约为16小时,中幼红细胞为25～30小时,晚幼红细胞不具备合成DNA的能力,属非增殖性细胞.故正常红系前体细胞由骨髓生成,经过增殖,分化直到新生网织红细胞从骨髓中逸出约需3～5天.在贫血应激时,采用跳跃式分裂,此段时间仅可为2天.网织红细胞以后又在脾内停留1～2天,继续成熟且改变膜脂质成分后再进入血循环.
4)红细胞的脱核与释放
① 红细胞的脱核: 晚红细胞通过增加本身的波状运动,再经过几次收缩,把核挤到胞浆的一端而后脱出.
② 红细胞的释放:红细胞进入血窦时,易变形的胞浆先进入,把细胞核留在血窦处,红细胞进入血窦后,内皮细胞即收缩而使血窦孔闭合.
③ 网织红细胞成熟度:可根据网状物含量分为Ⅰ～Ⅳ级,正常时仅Ⅲ及Ⅳ级见于外周血中.
(2)红细胞形态
1)正常红细胞形态
① 原始红细胞:
胞体:直径15～20 m,圆形或椭圆形,边缘常呈钝角状或瘤状突起,胞核:圆形,居中或稍偏于一旁,约占细胞直径的4/5.染色质呈颗粒状比原始粒细胞粗密,核膜明显.核仁1～2个,大小不一,染浅蓝色.胞浆:量少,深蓝色,不透明,有油画蓝感,在核周围常形成透明区.
② 早幼红细胞:
胞体:直径10～18 m,圆形或椭圆形.胞核:圆形或椭圆,占细胞2/3以上,居中或稍偏位.染色质可浓集或粗密的小块,较原红粗糙些.核仁模糊或消失.胞浆量多,呈不透明蓝色或深蓝色,仍可见瘤状突起及核周淡染区.
③ 中幼红细胞:
胞体:直径8～15 m,圆形.胞核:圆形或椭圆,约占细胞大小的1/2,核染色质紧密,浓集成块,排列成呈车轮状,其中有明显空隙宛如打碎的墨砚感,核仁完全消失.胞浆:浆内血红蛋白形成逐渐增多,嗜碱性物质逐渐减少.因含不等量血红蛋白,可呈不同程度嗜多色性.
④ 晚幼红细胞:
胞体:直径8～15 m,圆形.胞核:圆形或椭圆,占细胞1/2以下,核染色质固缩密集,呈紫黑色团块状,有时可见核碎裂,核溶解或核旁碎片,此为不正常分裂的表现.胞浆:量较多,不规则,颜色因含多量血红蛋白,几乎和成熟红细胞相同呈粉红色或略带蓝色.
⑤ 网织红细胞:
为有核红细胞刚刚失去核的阶段,仍属尚未完全成熟红细胞,浆内尚有嗜碱性物质.在正常血液内占0.5～1.5%,直径8～9μm.用煌焦油蓝作活体染色时,可在红细胞内看见蓝色网状,线状或颗粒状网织结构.此种结构越多,常表示细胞越不成熟.根据网织红细胞的发育阶段可分为以下四型.I型:嗜碱性物质位于红细胞中央,如同致密的线团状,此型多存在于正常骨髓中.Ⅱ型:红细胞中央的线团状结构开始松散,此型也多存于骨髓中.Ⅲ型:网状结构开始松散.呈不规则的枝点状散在于红细胞浆内,末梢血内可见到.Ⅳ型:红细胞浆内的嗜碱性物质进一步减少,呈单独的点状或短丝状.正常人血液中的网织红细胞多为此型.
⑥ 红细胞:
正常红细胞平均直径7.2μm,形态呈双面微凹之园盘状,中央较薄,边缘较厚,染色后呈淡红色略带紫色,中央部分较淡染,无核.
2)异常红细胞形态
① 红细胞大小不均:
正常红细胞大小较为一致,直径6～9μm,平均直径7.5μm.凡直径大于9μm者称为大红细胞,大于12μm者称巨大红细胞;大于16μm者称为超巨红细胞;小于6μm者称为小红细胞,在缺铁性贫血时,小红细胞多见;在缺乏维生素B12及叶酸所致的巨幼红细胞型贫血时,大红细胞,巨红细胞常见,后者且可有严重的红细胞大小不均,各红细胞之间的直径可相关节2～3倍或更多.
② 红细胞形态不整:
a.靶形红细胞:红细胞中央色深,外周呈苍白圈,在近红细胞边缘处又较深.宛如射击之靶,故名靶形细胞,见于各种低色素性贫血,而珠蛋白生成障碍性贫血时尤易见到.
b.镰状红细胞(drepanocyte):这种红细胞两端尖锐,长而狭,形如镰刀样,见于镰刀状红细胞型贫血.
c.球形红细胞:此种红细胞直径缩短(2.6μm),细胞中心区的血红蛋白比周围多,呈小球形状,故名球形红细胞.常见于遗传球形红细胞增多症,自身免疫性溶血性贫血.
d.裂红细胞(schizocyte):系红细胞之碎片,外形不规则,有的可呈半圆盘状,有2至3个尖角或呈盔形,称盔形红细胞(helmet cell).多见于弥散性血管内凝血,微血乏病性溶血性贫血,癌转移等.
e.椭圆形红细胞(elliptocyte):呈椭圆形,横径缩短,长径增大,横径/长径<0.78.正常人椭圆形红细胞也可高达15%.这种红细胞多见于遗传性椭圆形红细胞增多症,一般要高于25～50%,才有诊断价值.在巨幼红细胞性贫血可达25%,恶性血贫及严重缺铁性贫血,珠蛋白生成障碍性贫血及镰刀形贫血也可见到此细胞.
f.棘形红细胞(acanthocyte):红细胞这缘有较大突起,其间距不规则,长度与宽度不一.这种红细胞见于肝病,血浆β脂蛋白缺乏症或制片不及时,正常红细胞也会变成棘细胞.
g.口形红细胞:红细胞中央苍白区呈扁平口形,这种细胞正常人5%.
h.嗜多色性红细胞(polychromatic):如整个红细胞或其一部分呈灰蓝色则称为嗜多色性红细胞,它属于尚未完全成熟的红细胞,故细胞体积多较大,其蓝色嗜碱性物质为胞浆中的核糖体,它随着细胞完全成熟而消失,嗜多色性红细胞增多说明其骨髓造血功能活跃.在各种增生性贫血时均见增多,以溶血性贫血时更为多见.
i.嗜碱性点彩红细胞(basophilic stippling cell):乃指在瑞氏染色条件下,红细胞浆中存在着嗜碱性黑蓝颗粒而言,其颗粒较粗大,也可很细小,多少不一,其胞浆多具有某些嗜多性色调,此种细胞属于未完全成熟的红细胞.在正常人血片中极少见,约占0.01%.此种细胞出现表示再生加速并有紊乱的现象.有人认为它是由于在铅,铋,锌,汞中毒时红细胞膜被金属损伤后,其胞浆中的核糖体发生聚集变性后着色所致.铅中毒病人此种细胞明显增多,为诊断的重要指标之一.
j.豪-周小体(Howell-Jolly\'s小体):呈圆形,大小约1～2μm,紫红色,位于成熟红细胞或有核红细胞的胞浆中,可一个或多个,此种物质可能是细胞在分裂过程中出现的一种异常染色质,也可能是核碎裂或核溶解后所剩下之残核部分.见于溶血性贫血,恶性肿瘤,恶性贫血,脾切除后,严重贫血,新生儿,白血病等.
k.卡波环(Cabot\'s ring):为一细的线状环,呈圆环或\"8\"字形,染紫红色,存在于嗜多色性或碱性点彩红细胞之中,此种物质可能是纺锤体的痕迹,也可能是胞浆中脂蛋白变性所致.此种结构常与Howell-Jolly\'s小体同时存在,见于铅中毒,巨幼红细胞性贫血等.
(3)红细胞生成调节
1)EPO
① 生成机制:当外周血中红细胞数量减少和血红蛋白浓度降低时,红细胞携氧能力下降.血液和组织内氧张力减低,可刺激肾脏产生和释放EPO,促进骨髓内红细胞的生成;其他因素,有动脉血氧分压,心肺功能,血容量,血红蛋白与氧的亲和力以及红细胞2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)含量等.都可能通过肾脏内的EPO释放,对红细胞的生成产生反馈作用.
② 主要作用于红系祖细胞阶段.随着EPO使用剂量的加大.其作用可能会进一步扩及红系生成的全过程,成为影响红系细胞中血红蛋白合成的诱导物质和调节物质,并能促进DNA和RNA的合成.
③ 作用可归结为:刺激有丝分裂,促进红系祖细胞的增殖;激活红系特异基因,诱导分化;能显著减缓CFU—E DNA的降解速率,阻抑CFU-E的程序性死亡(凋亡),以及加速网织红细胞的释放和提高红细胞膜的抗氧化功能.
2)其他红细胞生成的调节物质
① 其他细胞因子:红系分化因子(EDF)能直接诱导血红蛋白表达及间接地促进红系祖细胞生长;红系分化去核因子(EDDF)诱导后期红细胞排核及转录;因子GATAl能激活多种红系特异基因,诱导细胞沿红系分化,并抑制细胞凋亡.
② 雄激素:主要是刺激EPO的产生并可能增加EPO敏感细胞数目及驱使G0期的CFU-S进入DNA合成期,增加红系祖细胞数量;也可直接刺激骨髓促进红细胞的生成.
③ 雌激素:可能抑制红细胞的生成.小剂量雌激素可减低红系祖细胞对EPO的反应,大剂量时可能抑制EPO生成.
④ 其他:甲状腺素,肾上腺皮质激素及生长激素等均可改变组织对氧的要求而间接影响;环腺苷酸(cAMP)亦可刺激EPO的生成;胸腺及T淋巴细胞对正常造血也有调节作用.T淋巴细胞及其产物可促进BFU-E的形成与EPO共同调节红细胞生成;再障及尿毒症患者体内有红细胞抑制素;纯红再障患者血浆中存在抑制因子.
(4)红细胞破坏
1)破坏的部位:
① 主要在单核-吞噬细胞系统.首要器官是脾脏和肝脏.其次为骨髓及其他部位.
② 脾脏内葡萄糖浓度低,氧分压及pH值低,血流缓慢.正常红细胞通过脾小动脉进入白髓的边缘区而进入红髓,通过狭窄的脾索而被挤压进入脾窦,再经过脾窦(含有单核—吞噬细胞)的内皮细胞孔隙,直接进入脾静脉.某些部位的血管内径特别细小,细胞需要变形才能顺利地通过,如果衰老的或有损伤的红细胞易受机械性滤过作用,被阻留于脾脏内,更加重葡萄糖的消耗,造成pH低,缺氧的非生理性环境,促使红细胞的脆性增加,易被吞噬细胞吞噬.
③ 肝脏仅对畸变较明显的红细胞才有清除作用,通过脾脏的血容量为35%.
2.红细胞结构与功能
(1) 红细胞膜的组成
1)膜糖类:以糖蛋白或糖脂蛋白形势存在,有多种功能如受体反应,抗原性,信息传递等,包括葡萄糖,半乳糖,甘露糖等中性糖,氨基糖类包括氨基半乳糖.
2)膜脂质:有三种:①磷脂占60%,其特性为双性物质,在脂质双层形成中起主要作用;②胆固醇和中性脂肪酸占33%,在膜中起调节脂质物理状态的作用;③糖脂占7%,其功能包括红细胞膜抗原性,细胞表面的黏附,细胞间的相互作用.
3)膜蛋白:多与脂质或糖结合在一起,既有维持红细胞结构的作用,又有一定的生理功能,仅起结构作用的蛋白很少,包括骨架蛋白,跨膜蛋白.
4)膜酶:可分为两大类:一类位于膜上,胞浆内不存在,如核苷酸代谢酶类(腺苷酸环化酶等),糖代谢酶类,ATP酶(Na+,K+-ATP酶,Ca2+,Mg2+-ATP酶),蛋白激酶及乙酰胆碱脂酶等;另一类在膜与胞浆中均存在,如某些磷酸酶类(酸性磷酸酶,2,3-二磷酸甘油酸磷酸酶等),葡萄糖代谢酶类(3-磷酸甘油醛脱氢酶,乳酸脱氢酶等),谷光甘肽代谢酶类(谷光甘肽还原酶,谷光甘肽还原酶).
(2)红细胞膜的结构
1)膜的不对称性:膜脂双层的内外两层脂类分子分布的不均一及物理性质的不同,以及膜蛋白在膜内外两侧分布也是不对称性.
2)膜流动性:红细胞膜结构的基本特征,是指膜内部分子运动性,主要是脂质和蛋白质的运动.适当的流动性是膜正常功能必需的.
(3)红细胞膜的功能
1)物质运输:①阳离子运转;②阴离子转运;③水的运输;④葡萄糖运转.
2)红细胞膜的抗原性:①血型抗原;②老化抗原.
3)红细胞的变形性:影响因素有①膜骨架蛋白组分和功能状态;②膜脂质流动性大有利于变形;③细胞表面积与细胞体积比值.
4)红细胞的免疫功能:①清除免疫复合物(IC)的作用;②对淋巴细胞的调控作用;③对吞噬细胞的作用;④对补体活性调节.
(4)血红蛋白的结构与功能
1)血红素是氧结合的铺基,由铁原子和原卟啉Ⅸ组成.
2)血红蛋白分子由四个亚基组成;
3)血红素的可逆氧合作用;
4)Hb对一氧化碳的亲和作用.
3.红细胞检查
(1)红细胞一般检查
1)红细胞计数
2)血红蛋白测定
3)红细胞比积测定
4)红细胞平均容量,红细胞平均血红蛋白量,红细胞平均血红蛋白浓度
5)网织红细胞
(2)有关铁指标的测定
1)血清铁测定
[原理] 血清铁Fe3+形式与转铁蛋白(transferrin,Tf)结合存在,降低介质的pH及加入还原剂(如抗坏血酸,盐酸羟胺等) 使高铁(Fe3+)还原为F2+,则转铁蛋白对铁离子的亲和力降低而解离,解离出的二价铁离子(Fe2+)与显色剂(菲咯嗪和2,2′-联吡啶等)反应,生成有色络合物,同时作标准对照,计算出血清铁的含量.
[参考值] 成年男性11.6～31.3μmol/L,女性9.0～30.4μmol/L
[临床评价] 血清铁降低常见于生理性铁需要量增加,缺铁性贫血,急性感染,恶性肿瘤等.各种原因所引起的缺铁性贫血患者,血清铁含量均明显降低,故可用于鉴别缺铁与非缺铁性贫血的诊断.
血清铁增高常于急性肝炎,恶性贫血,再生障碍性贫血,溶血性贫血及巨幼细胞贫血等.
2)血清总铁结合力
3)血清铁蛋白测定
4)铁吸收率测定
5)血清转铁蛋白测定
[原理] 免疫散射比浊法;利用抗人转铁蛋白血清与待检测的转铁蛋白结合形成抗原抗体复合物,其光吸收和散射浊度增加,与标准曲线比较,可计算出转铁蛋白含量.目前还有放射免疫法和电泳免疫扩散法.
[参考值] 免疫散射比浊法:28.6%～51.9%
[临床评价]
增加:见于缺铁性贫血和妊娠.
降低:常见于肝硬化,肾病综合征,恶性肿瘤,炎症.
6)血清转铁蛋白受体测定(measurement of serum transferrin receptor)
[原理] 血清转铁蛋白受体测定一般采用酶联免疫双抗体夹心法.把对转铁蛋白受体特异的多克隆抗体包被在96孔板上,用标准品和未知样本与转铁蛋白受体的多克隆抗体进行反应,然后加入酶标记的对转铁蛋白受体具有特异性的多克隆抗体,使之与抗原抗体复合物进行反应,通过洗板去掉未与酶标记的多克隆抗体结合部分,再加入底物使之酶联复合物发生颜色反应.颜色的深浅与转铁蛋白受体的量成正比.
[参考值] 以不同浓度标准品的吸光度值在普通坐标纸上绘制标准曲线,通过标准曲线上查出未知标本的转铁蛋白受体水平.
[临床评价]
升高:常见于缺铁性贫血和溶血性贫血.
降低:见于再生障碍性贫血,慢性病贫血及肾功能衰竭等.
(3)叶酸和维生素B12的测定
1)血清和红细胞叶酸测定
2)血清维生素B12的测定(measurement of vitamin B12)
[原理] 放射免疫法,用抗氧化剂和氰化钾在碱性环境下(pH>12),将人血清中的维生素B12从载体蛋白中释放出来.加入57Co标记的维生素B12,与固定在微晶纤维颗粒上纯化的维生素B12结合物(纯化的猪内源内因子)竞争结合,检测其放射活性,其量与受检血清的维生素B12含量成反比,与标准管作对照,换算出维生素B12含量.
[参考值] 成人148～660pmol/L
[临床评价] 血维生素B12降低对巨幼细胞贫血诊断有重要价值;而白血病患者血清维生素B12明显升高;真性红细胞增多症,某些恶性肿瘤和肝细胞损伤时也可增加.
3)血清维生素B12吸收试验
[原理] 给受检者口服放射性核素57Co的维生素B120.5μg,2小时后肌注未标记的维生素B121mg,收集24小时尿测定57Co排出量.
[参考值] 正常人>7%
[临床评价] 巨幼细胞贫血<7%,恶性贫血290s
[临床评价] 遗传性球形红细胞增多症AGLT50明显缩短(25～150s).自身免疫性溶血性贫血,肾功能衰竭,妊娠等AGLT50也可缩短.
4) 高渗冷溶血试验(hyperosmotic cold hemolysis test)
5) 红细胞膜蛋白电泳分析
[原理] 将制备的红细胞膜样品进行SDS-PAGE电泳,根据样品中各蛋白相对分子质量的不同,分离得到红细胞膜蛋白的电泳图谱,从而可见各膜蛋白组分百分率.
[参考值] 各种膜蛋白组分百分率变化较大,多以正常红细胞膜蛋白电泳图谱作比较.或以带3蛋白为基准,各膜蛋白含量以与带3蛋白的比例表示.
[临床评价] 许多溶血性疾病常见红细胞膜蛋白异常.各种膜缺陷疾病如遗传性球形红细胞增多症有收缩蛋白等含量减低或结构异常.某些血红蛋白病骨架蛋白可明显异常.
(7)血红蛋白异常的检验
1)红细胞包涵体试验(Heinz-body forming test)
2) 血红蛋白电泳检测
[原理] 血红蛋白电泳(hemoglobin electrophoresis)是根据不同的血红蛋白带有不同的电荷,等电点不同,在一定的PH缓冲液中,缓冲液的PH大于Hb的等电点时其带负电荷,电泳时在电场中向阳性泳动;反之,Hb带正电荷向阴极泳动.经一定电压和时间的电泳,不同血红蛋白所带电荷不同,相对分子质量不同,其泳动方向和速度不同,可分离出各自的区带,同时对电泳出的各区带进行电泳扫描,可进行各种血红蛋白的定量分析.
[参考值] pH8.6 TEB缓冲液醋酸纤维膜电泳:正常血红蛋白电泳区带;HbA>95%,HbF<2%,HbA2为1%～3.1.pH8.6 TEB缓冲液适合于检出HbA,HbA2,HbS,HbC,但HbF不易与HbA分开,HbH与Hb Barts不能分开和显示,应在选择其他缓冲液进行电泳分离.
PH6.5 TEB缓冲液醋酸纤维膜电泳:主要用于HbH与Hb Barts的检出.HbH等电点为5.6,在pH6.5 TEB缓冲液中电泳时泳向阳极,Hb Barts则在点样点不动,而其余的血红蛋白都向阴极移动.
[临床评价] 通过与正常人的血红蛋白电泳图谱进行比较,可发现异常血红蛋白区带.如HbE,HbH,Hb Barts,HbS,HbD和HbC等异常血红蛋白.
HbA2增多,见于β珠蛋白生成障碍性贫血,为杂合子的重要实验室诊断指标.HbE病时也在HbA2区带位置处增加,但含量很大(在10%以上).HbA2轻度增加亦可见于肝病,肿瘤和某些白血病.
3)抗碱血红蛋白测定
[原理] 胎儿血红蛋白F(HbF)具有比HbA更强抗碱能力,将待检的溶血液与一定量的氢氧化钠混匀,作用1分钟后加入半饱和硫酸铵中止碱变性反应.HbF抗碱变性作用强,没有变性存在于上清夜中,HbA变性沉淀,取上清液于540nm处测定戏光度,检测出HbF的浓度.此试验也称为碱变性试验,其检测的是抗碱血红蛋白,除HbF外,Hb Barts和部分HbH也具有抗碱能力,需通过电泳鉴别.
[参考值] 成人<2%,新生儿90%,对葡萄球菌杀菌率 >85%.
[临床应用] 是判断中性粒细胞杀菌能力的一个指标.
7)白细胞趋化试验(滤膜渗入法)
[原理] 检测离体后中性粒细胞从滤膜的一侧潜过到达有趋化因子一侧的定向移动能力.
[参考值] 趋化指数 3.0～3.5
[临床应用] 趋化功能缺陷见于代谢性疾病(糖尿病,尿毒症),感染,白血病及各种皮炎.当趋化因子生成不足或其抑制因子过多也表现为趋化功能缺陷.
8)中性粒细胞黏附功能
[原理] 中性粒细胞有在体外黏附异物的性质,将肝素抗凝血通过尼龙纤维后,计数通过前,后的中性粒细胞数.
[参考值]
黏附率(%)=100- × 100
正常健康人黏附率约为 47%～83% .
[临床应用] 是判断中性粒细胞黏附能力的一个指标.
(2)粒细胞代谢及产物检验
1)性粒细胞碱性磷酸酶染色 见细胞化学染色章
2)过氧化物酶染色 见细胞化学染色章.
3)特异性酯酶染色 见细胞化学染色章.
4)嗜酸粒细胞阳离子蛋白测定(ECP测定)
[原理] ECP是嗜酸粒细胞特异性标志,可反映嗜酸粒细胞的活化程度.
[参考值] 免疫萤光法:正常儿童血清含量为4.26±2.34μg/L;哮喘儿童为18.24±8.88μg/L
[临床应用] 患者ECP水平与末梢血中嗜酸粒细胞数无关.ECP水平与疾病的严重程度密切相关,测定ECP对过敏性哮喘的诊断,监视及抗炎治疗等均有重要意义.
5)嗜碱粒细胞脱颗粒试验
[原理] 嗜碱粒细胞与过敏原混合一定时间后,产生脱颗粒作用使细胞不再被着色,染色的细胞数明显减少.
[参考值] 计数9个大方格内染成蓝色的嗜碱粒细胞数(F),计算脱颗粒指数(DI): 判断结果以DI > 30% 为阳性.
[临床应用] 是嗜碱粒细胞脱颗粒功能的常作试验.在过敏性疾病或骨髓增殖疾病时,嗜碱粒细胞颗粒释放能力增高.
6)白三烯测定(LTB4测定)
[原理] 中性粒细胞内磷脂中的花生四烯酸在脂氧化酶作用下加氧生成白三烯化合物(LTS),其后再经水解生成稳定的LTB4.
[参考值] LTB4( 46214±172.99)ng/107 中性分叶粒细胞 .
[临床应用] LTS具有很强的生物活性,参与体内多种生理生化代谢;并且与临床某些疾病的病理机制密切相关.
7)中性粒细胞质膜标志酶测定
质膜指中性粒细胞去除胞质中颗粒和细胞核后的完整膜,即为胞质体.质膜上的各种受体与标志酶与中性粒细胞的功能相关.
①酸性磷酸酶测定:
[原理] 酸性磷酸酶表达在中性粒细胞质膜内侧,在初级颗粒和核膜上也有表达.在酸性缓冲液中(pH4.8)中,该酶使对硝基苯磷酸(P-NPP)水解为黄色的对硝基苯酚和磷,对硝基苯酚在405nm处有吸收峰,吸光度与酶活性呈正相关.
酶活性计算:活性单位用对硝基苯酚的含量表示.
AU= PNP nmol/(min·mg) Protein
[临床应用] 多种癌症(子宫,胃,结肠和乳腺癌)患者中性粒细胞酸性磷酸酶活性明显增高.
②碱性磷酸酶测定:
[原理] 碱性磷酸酶表达在中性粒细胞质膜外侧.在碱性条件下(pH10)下,对硝基苯磷酸被该酶水解生成黄色的对硝基苯酚和磷,并在405nm处有吸收峰,吸光度与酶活性呈正相关.
酶活性计算:活性单位用对硝基苯酚的含量表示.
AU= PNP nmol/min/mg Protein
[临床应用] 碱性磷酸酶是一种反映中性粒细胞在循环中和脾中寿命的标志酶.在细菌感染性疾病时其活性增高;但慢性粒细胞性白血病患者中性粒细胞碱性磷酸酶缺失或活性低下.
③5\'- 核苷酸酶测定(5\'-NT)
[原理] 5\'- 核苷酸酶不仅是中性粒细胞的标志酶,也是淋巴细胞成熟的标志物.本法用金属离子Ni 抑制5\'-核苷酸酶的活性,从不抑制的样品中测出的吸光度(A)值减去Ni 抑制的样品的 A值,即可从无特异性的磷酸酶中得出5\'-核苷酸酶活性.
酶活性计算:用每分钟每mg蛋白催化ATP释放磷(Pi)的nmol数表示:Pi nmol/mg Pr/min .
[临床应用] 5\'- 核苷酸酶活性随着粒细胞的分化成熟而下降,其在原幼粒细胞膜上表达较多.
(3) 粒细胞动力学检查
1)氚标记脱氧胸苷测定
[原理] 在粒细胞培养中使其进入有丝分裂期,再加入 3H-TdR后可被粒细胞摄入参与其DNA合成,摄入的量与DNA合成的量及增殖细胞数成正比.
[参考值] SI 20×109/L .
[临床应用] 本方法可间接但准确地反映骨髓中粒细胞的储备功能.该试验对某些骨髓受损引起的轻度粒细胞减少有一定参考及诊断价值;反之,则反映储备不足.
3)肾上腺素激发试验
[原理] 注射肾上腺素后血管收缩,黏附于血管壁上的粒细胞脱落,从边缘池进入循环池,致外周血粒细胞数增高.
[参考值] 粒细胞上升值一般低于(1.5～2.0)×109/L .
[临床应用] 本试验可鉴别粒细胞减少症是否为\"假性\"减少,如果增高低于上述值,须进一步确定粒细胞减少原因.
4)二异丙酯氟磷酸盐标记检测
[原理] 利用含有放射性磷的二异丙酯氟磷酸盐(DF32P)作为胆碱酯酶的抑制剂,其能与粒细胞膜上的胆碱酯酶结合.采血制成标记物后,立刻静脉注射.经过一段时间再次采血,分离粒细胞, 观察其放射活性的变化,则可测知外周血中有关粒细胞的参数.
[参考值] 粒细胞总数的测定:
标记粒细胞半衰期(T1/2): 4～10小时;血中滞留时间:10～14小时.
全血粒细胞池(TBGP): (35～70)×107/kg
循环粒细胞池(,CGP): (20～30)×107/kg
边缘粒细胞池(MGP): (15～40)×107/kg
粒细胞周转率(GTR): (60～160)×107/(kg · d)
[临床应用] 本方法可在体外及体内标记粒细胞以观察骨髓中细胞增殖情况.
5)流式细胞仪检测DNA合成及含量
流式细胞仪(FCM)能够快速而准确地获得形态学,生物化学,免疫学等多种参数(DNA,RNA,蛋白质,细胞体积,抗原等),从而实现对细胞的定量分析和分选.
①DNA合成的检测
[原理] 用5-溴脱氧尿嘧啶(5-BrdU)掺入S期细胞的DNA,然后用抗5-BrdU抗原的特异性抗体,用FCM准确测定细胞的DNA合成速率.
[结果] 提供有关细胞周期各时相分布的动态参数.
[临床应用] 间接了解DNA的合成情况,协助临床上制定最佳治疗方案.
②DNA含量的测定
[原理] 用荧光染料碘化丙啶(PI)与双链DNA分子特异性结合,DNA的含量与荧光染料的结合量成正比.利用FCM绘出DNA直方图作细胞周期分析.
[结果]
细胞DNA含量:用DNA指数(DI)表示相对含量.
细胞周期各时相细胞的相对数包括:G0/G1期,S期和G2-M期各时相细胞的百分比,SPF(%)及细胞增殖指数PI(%) .
[临床应用] 了解髓系白血病细胞的倍体水平和增殖情况;了解急性白血的不同细胞周期细胞数的百分比,协助判断预后情况.对比白血病治疗前后患者白血病细胞内的DNA含量,可了解其对化疗药物是否敏感,从而指导临床用药.SPF(%)高者对周期特异性药物比较敏感,可诱导白血病细胞进入S期,以提高化疗效果.
6)粒细胞抗体检测
①萤光免疫法
[原理] 在正常人粒细胞悬液中加入受检血清,如血清中有粒细胞抗体,便与正常人粒细胞结合,再加入标记有萤光物质的抗抗体,可与粒细胞膜结合而显示萤光.
[参考值] 正常时血清阴性,有阳性反应表示受检血清中有粒细胞抗体.
[临床应用] 本方法临床上常作为确诊免疫性粒细胞减少的试验.
②化学发光法
[原理] 用化学发光技术测定单个核细胞与抗体被覆的粒细胞相互作用产生的代谢反应,间接测定抗粒细胞抗体.
[参考值] 以发光指数表示结果.
[临床应用] 本法可用于确诊免疫性粒细胞减少症.
③流式细胞技术检测
[原理] 用正常人\"O\"型抗凝血分离出单核细胞和粒细胞,经1%多聚甲醛固定,二者再等量混合制成细胞悬液,加受检血清孵育,再加结合异流氰酸萤光素(FITC)和抗人F(ab)2IgG,,采用FCM进行分析.
[参考值] 荧光强度与粒细胞抗体量呈线性关系,根据萤光强度的大小即可得到粒细胞抗体的量
[临床应用] 本法可对粒细胞抗体作半定量测定及对抗体类型进行分析,以确定是否存在免疫复合物.
④白细胞抗人球蛋白消耗试验
[原理] 在受检血的粒细胞悬液中加入抗人球蛋白抗体,如粒细胞膜上吸附有不完全抗体,则加入的抗人球蛋白抗体即与之结合而被消耗.
[参考值] 如测定组效价低于标准对照组2管或2管以上为阳性,表明受检血清中有不完全抗粒细胞抗体.正常对照和盐水对照组应无消耗.
[临床应用] 可间接测定受检者血清或粒细胞表面存在不完全抗体.
(4)白细胞免疫标记检测
免疫标记存在于细胞表面或胞质内,其代表某一细胞种类或某一亚群,如表面受体,分化抗原等.白细胞在其成熟过程中有不同的分化抗原表达.白细胞免疫标记检测在国际上公认流式细胞术.
1)萤光显微镜计数检测
[原理] 利用萤光素把抗体蛋白标记为萤光抗体.此萤光抗体与细胞表面的分化抗原相结合后在萤光显微镜特定激发光的照射下发出荧光,成为可见的圆形物.以此对细胞表面标志作出鉴定和定位.
[结果] 计算阳性细胞率.
[临床应用] 参见生物素-亲和素酶标法.
2)流式细胞仪计数检测
[原理] 将粒细胞标本用荧光标记制成悬液,用流式细胞仪在短时间分析数万个细胞,用计算机记录处理后快速对各个细胞进行多参数定性和定量分析.
[结果] 流式细胞仪的数据显示通常以一维单参数直方图,二维点阵图,二维等高图或假三维图来表示.单参数直方图是一维数据应用最多的图形.
[临床应用] 参见生物素-亲和素法
3)碱性磷酸酶-抗-碱性磷酸酶桥联酶标法
[原理] 碱性磷酸酶-抗-碱性磷酸酶桥联酶标(APAAP)法首先是以牛肠碱性磷酸酶作为抗原免疫小鼠,制备小鼠杂交瘤抗碱性磷酸酶单克隆抗体,再与碱性磷酸酶结合,形成APAAP复合物.以小鼠杂交瘤单克隆抗体为第一抗体,兔抗-鼠免疫球蛋白为第二抗体(桥),APAAP复合物为第三抗体.通过碱性磷酸酶水解底物显色,达到抗原定位.
[结果] 高倍镜下计数200个有核细胞,其中细胞膜上或胞质内显示红色标记物为阳性,无红色标记物为阴性.计算各片阳性细胞百分率,该百分率即分别代表各单抗所指向抗原的阳性百分率.阳性细胞 ≥20%为阳性结果.
[临床应用] 参见生物素-亲和素法
4)生物素-亲和素酶标法
[原理] 生物素先与辣根过氧化物酶偶联,再与亲和素结合,形成亲和素-生物素- 辣根过氧化物酶复合物,即ABC.细胞抗原与特异性抗体(第一抗体)结合后,与已标记上生物素的第二抗体起反应,再与ABC结合.ABC上辣根过氧化物酶作用于显色剂,使其产生有色沉淀,确定抗原存在部位.
[结果] 计数方法同APAAP.
[临床应用] 抗人白细胞分化抗原CD的测定有重要的临床意义.用于对造血干,祖细胞的研究或分离与纯化,T细胞亚群的检测.也常在血液系统疾病中应用,如:在急性白血病中鉴别AML和ALL,急性白血病化疗药物的选择;微量残留白血病的检测,恶性淋巴瘤分类和诊断以及在造血干细胞移植中;都运用白细胞免疫标记技术.
第五章 单核细胞系统
1.单核-吞噬细胞的生物化学与代谢
(1)单核-吞噬细胞的生物化学
单核细胞转变为吞噬细胞的过程中胞质中溶酶体颗粒增多.溶酶体主要包括β-葡萄糖醛酸酶,酸性磷酸酶等多种变性酶,这与该细胞吞噬,杀死和消化微生物及清除受损伤和衰老的血细胞的功能密切相关.线粒体,线粒体酶(如细胞色素氧化酶)的活性及细胞呼吸率也增加.
(2)单核-吞噬细胞的化谢
单核-吞噬细胞的代谢特点是:
1)呼吸爆发 静止的单核-吞噬细胞仅有很低的需氧代谢,代谢所需的能量大部分来自于其中的厌氧糖原酵解.当受到激活时,无论有无配体与单核-吞噬细胞表面受体结合,单核-吞噬细胞都表现为氧消耗增加,厌氧糖原酵解增加,戊糖磷酸途径活跃.同时产生高毒性的氧衍生物O2-,H2O2等,这一系列反应即称为呼吸爆发,产生的活性态氧物质都具有杀菌或细胞毒活性.
2)活性氮中间体的产生 单核-吞噬细胞中存在一氧化氮合成酶的酶系统.这种合成酶作用于L-精氨酸末端胍基氮,从而产生一系列高活性氮中间体如NO等,具有强烈的杀伤效应和免疫系统的调节作用.
3)在单核-吞噬细胞及其他吞噬细胞的吞噬溶酶体或溶酶体中,有许多酶或非酶蛋白质,它们在pH发生改变时,也可以产生不依赖于活性氧和活性氮的杀伤作用.
4)单核-吞噬细胞中的花生四烯酸代谢也十分活跃.
2.单核-吞噬细胞功能
(1)趋向性 单核细胞和吞噬细胞在内,外源性的趋化因子的作用下能定向移动
(2)吞噬功能 单核-吞噬细胞能将病原微生物(主要针对结核杆菌,原虫,真菌等),衰老损伤的细胞和异物颗粒等固体物质和液体物质,分别经吞噬和胞饮作用摄入细胞内形成吞噬小体,并进一步与溶酶体融合形成吞噬溶酶体,并发生脱颗粒现象.
(3)诱导及免疫调节反应 ①正调节功能:在诱导免疫反应时,吞噬细胞摄取并处理抗原,并将有效抗原成分递呈给淋巴细胞,②负调节功能:吞噬细胞受到某些刺激信号,如LPS,分枝杆菌成分或肿瘤抗原等的持续,过度激活,会转成抑制性吞噬细胞.抑制性吞噬细胞可以通过本身或其分泌的物质(如PGE2),直接抑制作用,对免疫应答起负调控作用.
(4)抗肿瘤活性 主要是通过抗体依赖性细胞毒机制(ADCC);激活的吞噬细胞释放的TNF或其胞内的溶酶体杀伤肿瘤细胞等.
(5)吞噬细胞的分泌作用 吞噬细胞分泌不同的因子,主要有酸性水解酶,中性蛋白酶(纤维蛋白溶酶原活化因子等),溶菌酶,补体成分,凝血因子,血管生长因子,EPO,成纤维细胞生长因子,TNF,花生四烯酸代谢产物,分别起不同的生物学作用.
(6)对白细胞生成的调节
人正常单核细胞和吞噬细胞产生CSF,作用于自身骨髓祖细胞CFU-GM而诱导分化分化成粒细胞,单核细胞或吞噬细胞.吞噬细胞通过产生前列腺素(如PGE1)来抑制CFU-GM的分化,与CSF的刺激作用共同参与维持白细胞生存的平衡.成熟粒细胞可产生乳铁蛋白,抑制吞噬细胞产生CSF,并产生抑素,抑制其祖细胞的增殖.
3.单核-吞噬细胞动力学
(1)骨髓 骨髓中有单核细胞的干细胞池,生成池和贮存池.原始,幼稚单核细胞构成生成池.幼稚单核细胞分化为两个单核细胞,组成贮存池.骨髓中几乎不存在单核细胞的贮存池.
(2)血液 骨髓中的单核细胞进入血液后,在循环池与边缘池之间进行交换,边缘单核细胞池约为循环单核细胞池的3倍.
(3)组织 血液中单核细胞移向结缔组织或其他器官.它们在结缔组织内继续分化,经过5-9天后成为一个典型的吞噬细胞,成熟的吞噬细胞不再分裂.感染,毒物刺激或组织损伤能刺激骨髓产生单核-吞噬细胞,加速吞噬细胞的更新.吞噬细胞分泌的某些体液因子对单核细胞的产生增强和调节作用.
第六章 淋巴细胞浆细胞系统
1.淋巴细胞-浆细胞的生物化学与代谢
(1)淋巴细胞的分类:淋巴细胞源于骨髓干细胞,根据淋巴细胞发育和成熟的途径不同以及含有不同的表面分化抗原,大致分为T细胞,B细胞,NK细胞三类
(2)淋巴细胞的生物化学特点:血液中静止淋巴细胞所含阳离子主要有K+,Na+和Ca2+.T细胞糖原储备贫乏,DNA含量和其它二倍体细胞相同,而RNA含量较低.其溶酶体中包含酸性水解酶,如酸性磷酸酶,β-葡萄糖醛酸酶和α-糖苷酶等.
(3)淋巴细胞的代谢:①核酸的合成:与淋巴细胞核酸代谢有关的酶有:末端脱氧核苷酸转移酶,腺苷脱氨酶和嘌呤核苷磷酸化酶等.其中TdT是血液系统最重要的酶之一.血液中静止的淋巴细胞含有与DNA复制,修复等功能有关的酶,如DNA多聚酶Ⅰ和Ⅱ,RNA多聚酶,还有嘌呤和嘧啶合成的酶等.②脂肪酸和脂类代谢:能将14C醋酸盐掺入长链脂肪酸,不合成前列腺素.③糖类代谢:其能量主要来源于糖酵解途径和三羧酸循环,一少部分来源于磷酸戊糖途径.④蛋白合成:淋巴细胞蛋白质合成也与其存活和功能有关.
2.淋巴细胞-浆细胞功能
淋巴细胞的主要功能包括参与体液免疫,细胞免疫和分泌淋巴因子.
(1)T细胞的功能
1)介导细胞免疫反应 T细胞分为TCRαβ(TCRⅡ型),TCRγδ(TCRⅠ型)T细胞.TCRⅡ型T细胞分为CD4+ T细胞和CD8+ T细胞.CD4+ T细胞分为两个功能亚群:①辅助性T细胞:能够促成T细胞和B细胞的免疫反应.②诱导抑制性T细胞:能诱导CD8+ T细胞中细胞毒功能和抑制T细胞功能.另外,CD4也是人类免疫缺陷病毒的受体分子,可结合HIV.CD8+ T细胞可分为两个功能亚群:①抑制性T细胞:能抑制T细胞和B细胞的免疫反应.②细胞毒性T细胞:其主要作用是直接与靶细胞结合,通过释放穿孔素等杀伤靶细胞.
2)免疫调节作用 执行免疫调节功能的T细胞主要为TH和TS细胞.TH能够辅助B细胞产生抗体和辅助TC功能,分别由TH1和TH2亚群完成.另外TH1亚群还能介导特异性的炎症反应. TH2主要负责刺激B细胞增生,分化为抗体产生细胞即浆细胞.CD4+ T亚群中的诱导抑制T细胞能诱导CD8+ T中细胞毒功能和抑制性T细胞功能.TS对B细胞合成和分泌抗体,TH细胞介导的细胞免疫和迟发性变态反应以及TC介导的细胞毒作用都有抑制作用.
(2)B细胞的功能 体液免疫,免疫调节
B细胞通过Ig接受抗原刺激,并在TH2细胞辅助下分化为浆细胞,合成和分泌Ig.B细胞有三个主要的功能:产生抗体,提呈抗原及分泌细胞因子与参与免疫调节.
1)体液免疫 细胞介导体液免疫,可由胸腺依赖抗原或非胸腺依赖抗原引起.
2)免疫调节作用 激活的B细胞能产生大量细胞因子,它们参与免疫调节,炎症反应及造血过程.通过抑制作用和抗原递呈作用两种方式参与免疫调节作用:①抑制性B细胞: ②抗原递呈作用:
(3)NK细胞的功能
大约有10%～15%的外周血淋巴细胞缺少T或B细胞标志.在形态上,这群细胞属于大颗粒淋巴细胞.80%的LGL能够不经预先致敏即可杀伤肿瘤细胞以及病毒和寄生虫感染的细胞.它们杀伤靶细胞的作用也不受MHC限制.这类细胞称为NK细胞
3.淋巴细胞-浆细胞动力学
(1)T细胞(胸腺依赖性淋巴细胞)
在胸腺中淋巴细胞的增殖与分化不依赖于抗原的刺激.最终分化为能与异物抗原发生反应的CD4+或CD8+的单阳性细胞,进一步分化成不同的T细胞亚群.
(2)B细胞(囊依赖性淋巴细胞)B细胞分化过程分为两个阶段,即抗原非依赖性期(中枢免疫器官内进行)和抗原依赖期(主要在外周免疫器官内进行).各阶段的主要标志为Ig基因的重排和膜表面标志的表达.当成熟B细胞分化为浆细胞时,B细胞表面的大部分标志均可丧失,并可出现一些新的浆细胞特有标志,如浆细胞抗原-1(PCA-1)等分子.
(3)淋巴细胞再循环 是指淋巴细胞在血液与淋巴组织之间的反复循环.通过淋巴细胞再循环,可使淋巴细胞接触抗原的机会增加,增强免疫反应,也能使免疫记忆性淋巴细胞有机会经常接触到相应的特异性抗原,保持其免疫记忆功能.
第七章 血栓与止血
1.巨核细胞形态和功能
巨核细胞系统由髓系干细胞发育而来,包括原始巨核细胞,幼稚巨核细胞,颗粒型巨核细胞,产血小板型巨核细胞,裸核型巨核细胞及血小板.巨核细胞的生长和成熟包括胞核的分裂和成熟,胞质的成熟及血小板生成.巨核细胞增殖时,细胞核内DNA含量成倍增加,核分裂,但胞体不分裂,形成多倍体细胞,故胞体明显大于其他血细胞.正常人骨髓中,16N巨核细胞占多数.
(1)正常巨核细胞形态
1)原始巨核细胞(megakaryoblast) 胞体直径15～30μm,不规则,常可见指状胞质突起,周边常有少许血小板附着;胞质较少,深蓝色,周边深浓,无颗粒;胞核较大,圆形或不规则,胞核1～2个,染成紫红色,染色质较粗,排列较紧密且分布不均匀,核仁2～3个,常不清晰,呈淡蓝色.
2)幼稚巨核细胞(promegakaryocyte) 胞体直径30～50μm,常不规则,也可有指状突起,有时细胞周边有少许血小板附着;胞质较丰富,深蓝色或淡蓝色,近核处常有较明显的淡染区,胞质中出现细小,大小一致的淡紫红色颗粒,颗粒一般在近核处首先出现而使此处的胞质呈淡红色;胞核不规则,有重叠或扭曲,呈肾形或分叶状,核染色质粗颗粒状或小块状,排列紧密,核仁常无.
3)颗粒型巨核细胞(granular megakaryocyte) 胞体直径40～70μm,有时可达100μm以上,常不规则,胞膜完整;胞质极丰富,呈淡红色或淡蓝色,胞质中充满大量淡紫红色颗粒,早期细胞的边缘呈狭窄的嗜碱性透明区,形成外浆,而内浆充满颗粒;胞核巨大,不规则,核分叶后常重叠,核染色质呈粗块状或条状,无核仁.
4)产血小板型巨核细胞(thromocytogenic megakaryocyte) 胞体直径40～70μm,有时可达100μm,胞膜不完整,呈撕破,毛边状,或呈伪足状;胞质极丰富,淡红色,胞质边缘的颗粒可聚集呈簇(称为雏形血小板),其胞质的外侧常有被释放出来的血小板;胞核巨大,不规则,核分叶后常重叠,核染色质呈条状或块状,无核仁.
5)裸核型巨核细胞(naked megakaryocyte) 胞核同产血小板型巨核细胞,胞质无或有少许.裸核型巨核细胞有时是由于涂片制作时,将胞质推散所致,此核最终被吞噬细胞吞噬.
6)血小板(platelet) 见本章2..
(2)异常巨核细胞形态
1)微小巨核细胞 又称为淋巴样巨核细胞.其胞体在15～20μm以下,周围常有血小板;核单个,圆形或椭圆形,核如淋巴细胞大小,无核仁;胞质少,呈浅红色或灰蓝色,常含有淡紫红色颗粒.此细胞几乎都出现于恶性血液病.
2)小巨核细胞 胞体20～40μm ;核小,1～2个,呈圆形或椭圆形;胞质多少不一,有少量淡紫红色颗粒或血小板.
3)多小核巨核细胞 胞体40～80μm ;胞核小,多个,无核丝相连,圆形;胞质丰富,有少量淡紫红色颗粒,多无血小板形成.
4)大单核巨核细胞 胞体20～40μm ;胞质丰富,有淡紫红色颗粒,多无血小板形成;核大,圆形,偏位.
5)巨核细胞核分叶过度 胞体大小似颗粒型巨核细胞,其核分为多叶,其中有的以核丝相连,分叶的核常大小及形态不一,常无核仁.
6)变性巨核细胞 指巨核细胞胞质及或胞核中形成空泡(多少不一),颗粒明显减少.
(3)巨核细胞功能
巨核细胞是骨髓中最大的造血细胞,其功能就是形成血小板,每个巨核细胞产生血小板量的多少与巨核细胞的倍体数有关.巨核细胞能合成多种特异性的蛋白质,如血小板第4因子,β-血小板球蛋白,巨核细胞还能合成转化生长因子,血小板衍生生长因子,碱性纤维母细胞生长因子等具有广泛生物学作用的因子,在细胞生长,核酸代谢,血管形成,骨髓纤维化等生理及病理过程中起着重要的作用.巨核细胞还具有摄取细胞外物质的功能.巨核细胞也可见于其他器官如肺,脾脏及肝脏等,至于巨核细胞在这些器官中的起着什么作用不清楚.
2.血小板形态和功能
血小板虽然是血液中最小的一个细胞,但它在血栓和止血中起着重要的作用.循环的血小板来源于骨髓巨核细胞.血小板释放到血中后,约1/3贮存在脾脏中,寿命为8～11天,主要在肝脏和脾脏中破坏.
(1)血小板形态
1)普通显微镜下形态
正常血小板胞体直径2～4μm,厚度为0.2-0.4μm,平均体积(MPV)约为6.8～13.5fl,呈星形,圆形,椭圆形,逗点状或不规则形;胞质淡红色或淡蓝色,有时胞质周围呈淡蓝色,称为透明区,中心部位有细小,分布均匀的淡紫红色颗粒,称为颗粒区;胞核无.
异常血小板包括①小血小板:指直径小于2μm;②大血小板:指直径5-7μm;③巨大血小板:指直径大于7.5μm;④超巨大血小板:指直径大于20μm;⑤畸形血小板:呈长轴状,花生形,蝌蚪形,类圆形等;⑥蓝色血小板:胞质蓝色,无颗粒或大颗粒,又称为年轻的血小板.
2)电镜下形态
扫描电镜下,静息血小板呈双面微凸圆盘状,似铁饼;透射电镜下的血小板形态由四部分组成:表面结构,骨架系统,细胞器及特殊膜系统.
①表面结构
血小板表面结构又称为外周区,主要由血小板膜和细胞外衣组成.
Ⅰ.血小板膜 血小板 细胞膜主要由蛋白质和脂质组成,还有少量的糖类.糖类与蛋白质结合形成糖蛋白(glycoprotein,GP),糖类与脂质结合形成糖脂;脂质主要由鞘磷脂和甘油磷脂组成,甘油磷脂主要包括磷脂酰胆碱,磷脂酰乙醇胺,磷脂酰丝氨酸,磷脂酰肌醇.磷脂具有以下生理作用:Ⅰ)膜磷脂代谢:血小板被激活时,膜磷脂在磷脂酶PLA2 ,PLC作用下形成花生四烯酸(arachidomic acid,AA),AA在环氧化酶作用下形成前列腺素内过氧化物(PGG2,PGH2),PGG2和PGH2在血栓烷A2(thromboxane A2,TXA2)合成酶作用下形成有活性的TXA2.TXA2能抑制腺苷酸环化酶(AC)而促进血小板聚集,此外TXA2还具有收缩血管的作用,但其半衰期短,很快转化为稳定而无活性的血栓烷B2(thromboxane B2,TXB2,),TXB2在肝脏氧化酶作用下能形成更稳定的去二甲基-血栓素B2(DM-TXB2) 和11-去氢--血栓素B2(11-DH-TXB2).TXA2和PGI2(在血管内皮细胞膜上合成)是一对作用完全相反的调控系统,在生理情况下两者呈动态平衡,使血管和血小板保持正常功能;Ⅱ)形成血小板活化因子(platelet activating factor,PAF),PAF是迄今发现的最强血小板聚集诱导剂,并参与炎症反应及免疫调节;Ⅲ)形成血小板第3因子(platelet factor 3,PF3):详见本节血小板功能中的促凝活性.
Ⅱ.细胞外衣 又称为糖萼(glycocalyx),主要由糖蛋白的糖链膜外段部分组成,它是许多血小板膜受体的所在部位,如ADP,肾上腺素,胶原,凝血酶,vWF,纤维蛋白原受体等.血小板膜糖蛋包括血小板质膜糖蛋白和颗粒膜糖蛋白.血小板质膜糖蛋白有多种(见表7-1).
表7-1 血小板质膜主要膜糖蛋白特性
国际名称
CD名称
相对分子量
特性
GPⅠa
CD49b
160 000
与GPⅡb形成复合物,是胶原的受体
GPⅠb
CD42 b(Ⅰbα)
CD42 c(Ⅰbβ)
165 000
GPⅨ形成复合物,是vWF,凝血酶的受体
GPⅠc
CD49f
148 000
GPⅡa形成复合物,是纤维连接蛋白的受体,也是层素的受体
GPⅡa
CD29
130 000
与GPⅠa和 GPⅠc形成复合物,是胶原和纤维连接蛋白的受体
GPⅡb
CD41b
145 000(Ⅱb)
Ⅱ与Ⅲ形成复合物,是纤维蛋白原的受体,也是和纤维连接蛋白的受体
和Ⅲa
CD61
90 000(Ⅲa)
CD41a(Ⅱb/Ⅲa)
GPⅣ
CD36
88 000
是凝血酶敏感蛋白的受体
GPⅤ
CD42d
82 000
与GPⅠb,Ⅸ形成复合物,构成凝血酶的受体
GPⅨ
CD42a
22 000
GPⅠb形成复合物,是wWF的受体
α颗粒膜蛋白-140(granular membrane protein-140,GMP-140)是一种颗粒膜糖蛋白,又称为血小板选择素(P-selectin).它是a颗粒膜上分子量为140KD的糖蛋白,血小板未活化时位于α颗粒膜上,血小板被活化时在血小板膜上大量表达并释放入血浆中,因此GMP-140是血小板活化的一个重要指标.
②骨架系统(skeletal system)
骨架系统又称为溶胶-凝胶区,由位于膜内侧的微管,微丝及膜下细丝组成,其中最重要的是环形微管.此外,还有凝溶蛋白,肌动蛋白结合蛋白,a-辅肌动蛋白,外廓蛋白等也参与了血小板骨架系统的工作.
Ⅰ.微管(microtubules) 主要成份是微管蛋白A,B,两者组成了二聚体,一定数量的二聚体排列形成了细丝, 12～15根这种细丝围绕形成环形微管.环形微管在低温环境下消失,这时血小板变成了不规则球形;当血小板加热至37℃时,环形微管重新出现,血小板又变成了圆盘状.可见环形微管对维持血小板形态具有重要的作用,是血小板骨架系统中的主要组成部分.
Ⅱ.微丝(microfilaments) 是血小板收缩作用的主要成份,有许多蛋白质调节着微丝的形成.它为实心细丝状结构,由肌动蛋白细丝和肌球蛋白粗丝组成,两者组成比例为100:1.血小板在静息状态下,微丝通常不易见到;当血小板被活化时,胞质中出现大量的微丝.血小板的收缩实际上是肌动蛋白和肌球蛋白相互滑动,收缩的结果,所以微丝在血小板的变形,释放反应及血块收缩中起着重要的作用.
Ⅲ.膜下细丝(submembrane filaments) 位于细胞膜与环形微管之间,结构和作用与微丝相似.
总之,血小板被活化时,细胞由圆盘状转变为球形,出现突起,使血小板变形,伸展和伪足形成,血小板的这种形态改变称为黏附变形.
③细胞器(organelle)
血小板胞质中含有多种细胞器,其中α颗粒(a-granules),致密颗粒(dense granules)和溶酶体(lysosome)最为重要.
Ⅰ.α颗粒 每个血小板中有十几个,圆形,直径为250～500nm,颗粒有界膜包围,内容物呈中等电子密度.α颗粒是血小板可分泌蛋白质的主要贮存部位包括血小板第4因子(platelet factor 4,PF4),β-血小板球蛋白(β-thromboglobulin,β-TG),凝血酶敏感蛋白,纤维连接蛋白,血小板衍生生长因子,因子Ⅴ,Ⅺ,Fg,vWF,HMWK等.其中PF4和β-TG是血小板特有的蛋白质,PF4能中和肝素的抗凝活性,β-TG能抑制血管内皮细胞合成PGI2,故能间接地促进血小板聚集和血栓形成.
Ⅱ.致密颗粒 又称为δ颗粒,主要贮存低分子量的活性物质.每个血小板中有4～8个,圆形,直径为200～300nm,颗粒有界膜包围,颗粒与界膜之间常有一层透亮的间隙,主要含有钙离子,ADP,ATP,5-HT,抗纤溶酶等.致密颗粒中含有较多的钙离子,所以其电子密度很高.血小板中ATP是维持血小板形态,功能和代谢活动所需的能量来源;ADP与血小板次发聚集有关,当血小板被活化时,可释放出而引起血小板次发聚集.
Ⅲ.溶酶体 又称为γ颗粒,每个血小板数目少,形态上不易与a颗粒区分.溶酶体是血小板的消化结构,其中含有丰富的水解酶及蛋白酶如芳香族硫酸酯酶,β-N-乙酰氨基葡糖甙酶,β-甘油磷酸酶,β-葡萄醛酸酶等.溶酶体的内容物只有在强诱导剂(如凝血酶,胶原等)作用下才发生释放反应.
④特殊膜系统
Ⅰ.开放管道系统(open canalicular system,OCS) OCS的膜来源于巨核细胞的质膜,是血小板膜凹陷于血小板内部形成的曲折管道系统, OCS不仅增加了与外界接触的面积,将外界的刺激信息传递到血小板内部,而且也是血小板与血浆之间物质交换的通道,血小板释放反应就是通过OCS释放的.
Ⅱ.致密管道系统(dense tubular system,DTS) DTS的膜来源于巨核细胞的粗面内质网,与外界不相通.DTS是血小板贮存钙离子的场所,也是合成TXA2的场所,从而调节血小板收缩活动和血小板释放反应.此外,DTS具有巨核细胞和血小板所特有的一种酶即血小板过氧化物酶(platelet peroxidase ,PPO),通过检测PPO对鉴别巨核细胞和其他细胞有重要的价值.
(2)血小板功能
1)血小板黏附功能
血小板黏附(adhension)功能是指血小板与非血小板表面的黏附.参与血小板黏附的因素包括血小板,血浆中桥联物质和非血小板表面.在体内,非血小板表面主要是血管内皮下组织,黏附能力强的内皮下组织有胶原,微纤维及基底膜等;在体外,非血小板表面为带负电荷的物质上如玻璃,白陶土,金属等.vWF是血浆中的桥联物质,血小板黏附胶原等时必须有vWF作为桥联物质.血小板质膜上的GPIb/Ⅸ复合物借vWF的桥联作用黏附于血管损伤处的内皮下组织.血小板GPⅡb/Ⅲa也可通过与vWF,纤维蛋白连接蛋白(Fn)等黏附蛋白作用导致伸展黏附.
2)血小板聚集功能
血小板聚集(aggregation)功能是指血小板与血小板之间的黏附形成聚集体,它在初期止血中起着重要作用.血小板聚集可有两类不同机制诱发,一类是诱导剂,另一类是流动状态下的剪切变应力.血小板的诱导剂包括ADP,肾上腺素,凝血酶,胶原,瑞斯托霉素,5-HT,AA,PAF,微纤维,内毒素,细菌,病毒,肿瘤细胞,免疫复合物等,其中前五者是体外最常用的诱导剂.诱导剂引起的血小板聚集有三种途径: ADP途径,TXA2途径和PAF途径.
参与血小板聚集的因素包括: GPIIb/IIIa,钙离子及纤维蛋白原.血小板被活化,GPIIb/IIIa的空间构型发生变化,导致纤维蛋白原受体暴露,从而发生聚集.在某种情况下,除纤维蛋白原外的一些其他大分子黏附蛋白如vWF,Fn也可与 GPIIb/IIIa 结合介导血小板聚集反应.
血小板的聚集有两种类型:①初发聚集(又称为第一相聚集):指在外源性诱导剂作用下发生的血小板聚集,这种聚集是可逆的;②次发聚集(又称为第二相聚集):指在血小板释放的内源性诱导剂作用下的聚集,是不可逆的.
3)血小板释放反应
血小板释放反应(release reaction)是指血小板被激活后,形态改变, 血小板中的颗粒与质膜融合,使颗粒中的生物活性物质从开放管道系统释放到血中的过程.血小板的释放通常在血小板聚集后发生,现已证明大部分聚集诱导剂能引起血小板释放反应,但强,弱诱导剂所引起的释放反应程度不同.弱诱导剂所诱导的释放不超过α颗粒和致密体颗粒内容物的25%,强诱导剂可使70%～90%内容物释放.致密体内容物在受弱刺激如ADP,低浓度胶原作用下,即可诱导释放反应;溶酶体内容物需要在强刺激物作用下才可诱导释放反应.
4)血小板促疑活性 是指血小板参与凝血反应,加速内源凝血系统,促进血液凝固的功能.血小板被激活时,静息状态下位于膜内侧的磷脂酰丝氨酸转向外侧,形成PF3,为凝血提供了因子活化的产所;血小板表面存在着凝血因子Ⅹa的结合位点,促进凝血酶原酶形成;释放多种凝血因子等参与凝血过程.
5)血块收缩功能 血块收缩依赖血中纤维蛋白原和血小板的数量,质量.被激活的血小板伸出多个伪足,伪足搭在纤维蛋白网上.当伪足呈向心性收缩时,纤维蛋白网变小,其网中的血清被挤出来,使血块收缩.
6)维护血管内皮细胞完整性 血管内皮细胞和内皮细胞之间存在着空隙,这间隙由血小板来填充,故能增强血管壁的抵抗力,降低血管的脆性和通透性.
综上所述,血小板通过黏附,聚集和释放反应参与初期止血过程,再通过释放其内含凝血因子,提供催化表面和血块收缩等功能参与二期止血过程.
3.血小板检查
(1)血小板黏附试验
[原理] 血小板黏附试验(platelet adhension test,PAdT)是利用血小板在体外可黏附于玻璃的原理设计的.根据所使用玻璃器材不同,将血小板黏附试验分为玻璃珠柱法,旋转玻球法及玻璃漏斗法.基本原理是将离体的新鲜全血置玻璃珠柱或玻璃漏斗或旋转的玻璃球中,同玻璃接触一定时间后,计数接触前,后的血中血小板数,得出血小板黏附率.
[参考值]
血小板黏附率(%)= ×100%
玻璃珠柱法:53.9%～71.1%
玻璃漏斗法:21.0%～42.8%
旋转玻球法(12ml玻瓶):男性28.9%～40.9%;女性34.2%～44.6%
[临床意义]
1)减低 先天性和继发性血小板功能异常(以后者多见),如血管性假血友病,巨大血小板综合征,低(无)纤维蛋白血症,异常纤维蛋白血症,急性白血病,骨髓增生异常综合征,骨髓增殖性疾病,肝硬化,尿毒症,服用抗血小板药物等.
2)增加 见于血栓前状态和血栓形成性疾病,如高血压病,糖尿病,妊娠高血压综合征,肾小球肾炎,肾病综合征,心脏瓣膜置换术后,心绞痛,心肌梗死,脑梗死,深静脉血栓形成,口服避孕药等.
(2)血小板聚集试验
[原理] 血小板聚集试验(platelet aggregation test,PAgT)常用的是比浊法.在富含血小板血浆的比浊管中加入诱导剂,仪器自动搅拌,随着血小板聚集的发生其透光度逐渐增高,记录仪自动记录血小板透光度的变化(即血小板聚集曲线),通过分析血小板聚集曲线的最大聚集率(MAR)等参数判断血小板的聚集功能.
[参考值] 每个实验室的参考值相差较大,各实验室应根据自己的实验具体情况及实验结果调节诱导剂的浓度,建立自己的参考值.中国医学科学院血液研究所常用的体外诱导剂测得的MAR为:
11.2μmol/L ADP液: 53%～87%
5.4μmol/L肾上腺素: 45%～85%
20 mg/L花生四烯酸: 56%～82%
1.5g/L瑞斯托霉素: 58%～76%
20mg/L胶原: 47%～73%
[临床意义]
1)减低 血小板无力症,血小板贮存池病(无第二个峰),血管性假血友病,巨大血小板综合征,低或无纤维蛋白原血症,急性白血病,骨髓增生异常综合征,骨髓增殖性疾病,肝硬化,尿毒症,服用抗血小板药物,特发性血小板减少性紫癜等.
2)增加 见于血栓前状态和血栓形成性疾病,如糖尿病,肾小球肾炎,肾病综合征,心脏瓣膜置换术后,心绞痛,心肌梗死,脑梗死,深静脉血栓形成,抗原-抗体复合物反应,高脂饮食,口服避孕药,吸烟等.
(3)血块收缩试验
[原理] 血块收缩试验(clot retraction test,CRT)是反映血小板收缩功能的试验,分为定量法,试管法和血浆法.其原理为全血或血浆凝固后,由于血小板收缩使血清从纤维蛋白网眼中挤出而使血块缩小,观察血清占原有全血量(如定量法,试管法)或血浆量(如血浆法)的百分比(即血块收缩率),可反映血块收缩程度.
[参考值]
定量法:48%～64%
试管法:1h开始收缩,24h完全收缩
血浆法:>40%
[临床意义]
1)下降 见于血小板减少症,血小板增多症,血小板无力症,低或无纤维蛋白原血症,严重凝血功能障碍,异常球蛋白血症,红细胞增多症(定量法及试管法)等.
2)增加 纤维蛋白稳定因子缺乏症,严重贫血(定量法及试管法).
(4)血小板活化指标检测
1)血浆b-血小板球蛋白和血小板第4因子检测
[原理] b-血小板球蛋白(b-TG)和血小板第4因子(PF4)是血小板特有蛋白质,血小板被激活时可释放到血浆中,用双抗体夹心法可进行检测.
[参考值] b-TG:(6.6～26.2)μg/L ,PF4:(0.9～5.5)μg/L
[临床意义]
①减低 见于先天性或获得性α-贮存池病.
②增加 见于血栓前状态及血栓性疾病,如糖尿病伴血管病变,妊娠高血压综合征,系统性红斑狼疮,血液透析,肾病综合征,尿毒症,大手术后,心绞痛,心肌梗死,脑梗死,弥散性血管内凝血,深静脉血栓形成等.
2)P选择素检测
[原理] P选择素存在于α颗粒膜中,当血小板被活化后P选择素在血小板膜表面表达并释放到血中,故测定血浆或血小板表面的P选择素可判断血小板被活化的情况,检测原理为双抗体夹心法.
[参考值] 血浆P选择素 (9.2～20.8)μg/L,血小板P选择素数目 (7900～10100)分子数/血小板.
[临床意义] 增加见于血栓前状态及血栓形成性疾病,如心肌梗死,脑梗死,糖尿病,自身免疫性疾病等.
3)血栓烷B2检测
[原理] 血小板被激活后,血小板膜磷脂发生AA代谢,形成稳定的血栓烷B2,可用ELISA法进行检测.其原理为将TXB2包被在反应板中,将待测标本(或不同浓度的标准液)和抗TXB2抗体加入反应板中,标本中的TXB2和反应板中的TXB2竞争性地与抗TXB2抗体结合,酶标板经洗涤后,加入酶标抗体,最后加底物显色,显色深浅与血中TXB2含量呈反比,根据标准曲线可得出待测标本的TXB2含量.
[参考值] (28.2～124.4)ng/L
[临床意义]
①减低 见于服用阿司匹林类等非甾体类抗炎药物或先天性环氧化酶缺乏等.
②增加 见于血栓前状态及血栓形成性疾病,如糖尿病,肾病综合征,妊娠高血压综合征,动脉粥样硬化,高脂血症,心肌梗死,心绞痛,深静脉血栓形成等.
4)11-脱氢-血栓烷B2检测
[原理] 11-脱氢-血栓烷B2(11-DH-TXB2)是TXB2在肝脏氧化酶作用下形成的产物,可用ELISA法进行检测.在包被有鼠抗兔IgG酶标板中,依次加入游离11-DH-TXB2(指的是待测标本或不同浓度的标准液),兔抗人11-DH-TXB2抗体,乙酰胆碱酯酶标记11-DH-TXB2,此时游离11-DH-TXB2和标记11-DH-TXB2竞争性地与兔抗人11-DH-TXB2抗体结合形成复合物,复合物再与酶标板中鼠抗兔IgG结合,酶标板洗涤后加入酶底物显色,显色深浅与标本中11-DH-TXB2含量呈反比,根据标准曲线可得出待测标本中含量.
[参考值] (2.0～7.0)ng/L
[临床意义] 同TXB2测定.
(5)血小板第3因子有效性检测
[原理] 利用白陶土作为血小板的活化剂促进PF3形成,用氯化钙作为凝血反应的启动剂,用正常血浆,患者血浆的PPP和PRP相互组合(详见表7-2),测定各自的凝固时间,比较各组时间,可判断PF3有否缺陷.
表7-2 PF3有效性测定分组
组别
患者血浆(ml)
正常血浆(ml)
PRP
PPP
PRP
PPP
1
0.1
0.1
2
0.1
0.1
3
0.1
0.1
4
0.1
0.1
[参考值] 第3组,第4组分别为患者和正常人(作为对照管),患者PF3有缺陷或内源凝血因子有缺陷时第3组凝固时间比第4组长.当第1组较第2组凝固时间延长5s以上,即为PF3有效性减低.
[临床意义]
1)减低 见于先天性血小板PF3缺乏症,血小板无力症,肝硬化,尿毒症,弥散性血管内凝血,异常蛋白血症,系统性红斑狼疮,特发性血小板减少性紫癜,骨髓增生异常综合征等.
2)增加 见于高脂血症,食用饱和脂肪酸,一过性脑缺血发作,心肌梗死,动脉粥样硬化,糖尿病伴血管病变等.
(6)血小板膜表面相关抗体和相关补体检测
[原理] 在某些免疫性疾病中,血小板膜表面存在着抗体(IgG,IgA,IgM)或补体,导致血小板破坏过多,测定血小板膜表面相关抗体(platelet associated immunglobulin,PAIg)或补体(platelet associated complement,PAC)的含量有助于判断血小板减少的原因.测定血小板抗体的方法有很多,其中国内最为常用的方法为双抗体夹心法.
[参考值]
PAIg G:(0～78.8) ng/107血小板
PAIgA: (0～2) ng/107血小板
PAIgM: (0～7 )ng/107血小板
PA C3: (0～129)ng/107血小板
[临床意义]
1)它是特发性血小板减少性紫癜(ITP)诊断,治疗效果,预后观察的指标及切脾的指征,90%以上的ITP病人PAIgG增加.
2)其它疾病如同种免疫性血小板减少性紫癜,Evans综合征,药物免疫性血小板减少性紫癜,慢性活动性肝炎,系统性红斑狼疮,恶性淋巴瘤,慢性淋巴细胞白血病,多发性骨髓瘤等也可增加 .
(7)血小板膜糖蛋白检测
[原理] 用抗人血小板膜糖蛋白(GPⅠb,GPⅡb,GPⅢa)单克隆抗体与受检者血小板膜上的特异性糖蛋白结合,通过放射免疫法检测血小板膜上的糖蛋白含量.
[参考值]
GPⅠb:(1.05～2.03)×104分子数/血小板
GPⅡb/Ⅲa:(4.26～6.64)×104分子数/血小板
[临床意义] GPⅠb 缺乏见于巨大血小板综合征,GPⅡb/Ⅲa缺乏见于血小板无力症.本试验的特异性和敏感性高,故对诊断巨大血小板综合征和血小板无力症具有诊断价值.
(8)血小板生存时间检测
[原理] 阿司匹林(ASP)具有不可逆性抑制血小板环氧化酶的作用,使血小板不能合成TXB2,直至新的血小板生成才能合成TXB2.因此观察受检者服用ASP后TXB2的恢复情况,可推断血小板的生存时间.
[参考值] (7.6～11.0)d
[临床意义] 血小板生存时间缩短见于特发性血小板减少性紫癜,弥散性血管内凝血,Evans综合征,<B style=\'color:black;background-color:#ffff66\'>脾功能亢进,血栓性血小板减少性紫癜-溶血性尿毒症综合征及各种血栓性疾病.
(9)血小板钙流检测
[原理] 利用荧光探针标记血小板内钙离子,在诱导剂作用下,血小板的钙离子通道打开,用共聚焦显微镜观察血小板荧光的强弱变化并经计算机控制系统及图像分析系统观察血小板中钙离子浓度和钙流的变化.
[参考值] 正常细胞内钙浓度为(20～90)nmol/L, 正常细胞外钙浓度为(1.1～1.3)nmol/L.
[临床意义] 血小板钙流是一项新的检测项目,测定有助于了解钙离子在血小板活化和各种止血功能中的作用,也可用于判断钙通道阻滞剂的药理作用.
4.血液凝固
(1)凝血因子的主要特性及分组
参加血液凝固的凝血因子至少有14个,包括12个经典的凝血因子以及激肽系统的激肽释放酶原和高分子量激肽原.根据凝血因子的作用和理化特性可分为四组.
1)依赖维生素K的凝血因子
包括因子II,VII,IX和X,它们的共同特点是分子结构中N端含有数量不等γ-羧基谷氨酸残基(γ-GLa),而该残基在肝细胞内的生物合成依赖维生素K的介导.血浆中的这些因子可同时被硫酸钡所吸附.
凝血酶在止血血栓中的生理病理作用有:①水解Fg;②激活因子XI,VIII,V,VII,XIII;③激活血小板;④激活抗凝系统的蛋白C;⑤抑制纤溶活性等.
2)接触凝血因子
包括因子XII,XI,激肽释放酶原及高分子量激肽原.它们的共同特点是通过接触反应启动内源凝血途径,并可参与纤溶和补体等系统的活化,临床发现接触因子缺乏并不出现出血现象(除因子XI缺乏有轻度出血外),反而表现出不同程度的血栓形成倾向或纤溶活性下降.
3)凝血酶敏感凝血因子
包括因子I,V,VIII,XIII.它们都对凝血酶敏感,从而发生酶促反应或被激活.
4)其他凝血因子
包括因子Ⅲ和Ⅳ.
①因子Ⅲ 习惯称之为组织因子(TF)是正常人血浆中唯一不存在的凝血因子.其广泛存在于各种组织中,尤其在脑,胎盘和肺组织中含量极为丰富,单核-吞噬细胞和血管内皮细胞均可表达.TF是FⅦ的受体,可与FⅦ或FⅦa结合,提供凝血反应的催化表面,参与外源凝血途径的激活.
②因子Ⅳ 习惯称之钙离子(Ca2+),Ca2+作为因子Ⅳ存在于血浆中,与其他二价金属离子(如Mg2+和Zn2+)都可能共同参与凝血过程.
(2)血液凝固,内源性途径,外源性途径及共同途径的概念
1)血液凝固 是指血液由液体状态转为凝胶状态的过程,简称凝血.
2)内源凝血途径 是指从FXII被激活到FXa形成的过程.本途径包括因子Ⅻ,Ⅺ,Ⅸ,Ⅷ,Ca2+及PK,HMWK之间的作用.这一途径在体内已不再是主要的凝血途径.而FVII-TF复合物对因子Ⅸ的活化,以及由FVIIa-TF最终形成凝成凝血酶后对因子Ⅺ的活化作用更大.因此而这里的FⅪa 和FⅨa只是对体内因血管内皮损伤引起的凝血病理生理反应的一个补充.
3)外源凝血途径 是指从TF的释放入血到FX被激活的过程.TF由各种途径(血管损伤,血液中细胞的释放,表达等)进入血液,引起FVII的活化,并与之构成复合物,进而激活FX,FII,最终形成纤维蛋白.这是体内凝血的主要途径,也是发生止血血栓病理改变的主要原因之一.
4)共同凝血途径 是指从因子X的激活到纤维蛋白形成的过程,为内,外源凝血系统所共有.包括凝血酶酶原酶或称凝血活酶的生成,凝血酶的生成及纤维蛋白的形成三个阶段.
(3)凝血机制的过程
凝血是一系列凝血因子相继酶解激活的过程,结果是生成凝血酶,形成纤维蛋白凝块.该过程一般分为内源性凝血途径和外源性凝血途径(其中包括凝血的共同途径),两条凝血途径的主要区别在于启动方式及参加的凝血因子不同,结果形成两条不同的FX激活通路.现在认为两条凝血途径并不是各自完全独立,而是相互密切联系,在机体的整个凝血过程中可能发挥不同的作用.
5.凝血因子检查
常用筛选试验:
(1)活化部分凝血活酶时间测定
[原理] 37℃条件下,以白陶土激活因子XII和XI,以脑磷脂(部分凝血活酶)代替血小板,在Ca2+参与下,观察贫血小板血浆凝固所需时间,即为活化部分凝血活酶时间(APTT),是内源凝血系统较敏感和常用的筛选试验.有手工法和仪器法.
目前主要有3类仪器法检测纤维蛋白的形成,其原理有下述三方面.
1) 光学法 当纤维蛋白原逐渐变成纤维蛋白时,经光照射后产生的散射光(散射比浊法)或透射光(透射比浊法)发生变化,从而得以测定.
2)电流法(钩方法) 根据纤维蛋白具有导电性,利用纤维蛋白形成时的瞬间电路连通来判断凝固终点.
3)黏度法(磁珠法)利用血浆凝固时血浆黏度增高,使正在磁场中运动的小铁珠运动强度减弱,以此判断凝固终点.
[方法学评价] 手工法虽重复性差一点,且耗时,但操作简便,有相当程度准确性,现仍作为参考方法.仪器法快速,敏感和简便,所用配套的试剂,质控物,标准品均保证了试验的高精度;但在诊断的准确性方面,仪器法并不比手工法更高;且仪器本身也会产生一定误差.APTT是一个较为敏感的检测内源凝血因子缺乏的简便试验,已替代普通试管法CT测定.
[质量控制] 标本采集,抗凝剂用量,仪器和试剂,实验温度等均对APTT试验的准确性产生重要的影响,故对实验的要求基本与PT相同(见PT测定).由于缺乏标准的试剂和技术,APTT测定的参考值也随所用的检测方法,仪器和试剂而变化,因此,按仪器和试剂要求进行认真检测比选择测定的方法更为重要.
1)激活剂和部分凝血活酶试剂 来源及制备不同,均可影响测定结果.① 激活剂:常用的有白陶土(KPTT),还可以用硅藻土,鞣花酸.即使是同一类激活剂,其质量也可能有很大的差异.② 部分凝血活酶(磷脂):主要来源于兔脑组织(脑磷脂);不同制剂质量不同,一般选用FVIII,FIX和FXI的血浆浓度为200~250U/L时敏感的试剂.
2)标本采集和处理:基本要求同PT试验.注意冷冻血浆可减低APTT对狼疮抗凝物以及对XII,XI,HMWK,PK缺乏的灵敏度;室温下,FVIII易失活,因此,须快速检测;高脂血症可使APTT延长.
[临床意义] APTT反映内源凝血途径凝血因子(XII,XI,IX,VIII),共同途径中FII,FI,FV和FX的水平.虽然,APTT测定的临床意义基本与凝血时间相同,但灵敏度较高,可检出低于正常水平15%-30%凝血因子的异常.APTT对FVIII和FIX缺乏的灵敏度比对FXI,FXII和共同途径中凝血因子缺乏的灵敏度高.必须指出,单一因子(如因子FVIII)活性增高就可使APTT缩短,其结果则可能掩盖其他凝血因子的缺乏.
1) APTT延长 超过正常对照10s以上即为延长.① 主要见于轻型血友病,可检出FVIII活性低于15%的患者,对FVIII活性超过30%和血友病携带者灵敏度欠佳.在中,轻度FVIII,FIX,FXI缺乏时,APTT可正常.② 血中抗凝物如凝血因子抑制物,狼疮抗凝物,华法林或肝素水平增高,FII,FI及FV,FX缺乏时灵敏度略差.③ 其他如肝病,DIC,大量输入库血等.
2)APTT缩短 见于DIC早期,血栓前状态及血栓性疾病.
3)监测肝素治疗 对血浆肝素的浓度较敏感,是目前广泛应用的实验监测指标.此时,要注意APTT测定结果必须与肝素治疗范围的血浆浓度呈线性关系,否则不宜使用.一般在肝素治疗期间,APTT维持在正常对照的1.5~3.0倍为宜.
(2)血浆凝血酶原定时间测定(一期法)
[原理] 在受检血浆中加入过量的组织凝血活酶(人脑,兔脑,胎盘及肺组织等制品的浸出液)和钙离子,使凝血酶原变为凝血酶,后者使纤维蛋白原转变为纤维蛋白.观察血浆凝固所需时间即凝血酶原时间(PT).该试验是反映外源凝血系统最常用的筛选试验.有手工和仪器检测两类方法.仪器法检验纤维蛋形成的原理与APPT基本相同.
[方法学评价]
1) 手工法 常用普通试管法,曾用毛细血管微量法,后者虽采血量少,但操作较繁琐,已淘汰;也可用表面玻皿法,尽管准确性较试管法高,但操作不如后者方便.手工法虽重复性差一些,耗时,但仍有相当程度的准确性,且操作简便,故仍在临床应用,并可作为仪器法校正的参考方法.
2)仪器法 仪器连续记录凝血过程引起光,电或机械运动的变化,其中,黏度法(磁珠法)可不受光学法影响因素(黄疸,乳糜,高脂血症,溶血等)的干扰.
半自动仪法(加样,加试剂仍为手工操作)提高了PT测定的精确度和速度,但存在标本交叉污染的缺点.全自动仪法(加样,加试剂全部自动化)使检测更加精确,快速,敏感和简便;同时,仪器测定法所用的试剂,质控物,标准品均有可靠的配套来源,保证了试验的高精度.但在临床诊断的准确性方面,仪器法并不比手工法更高.
凝血仪干化学法测定,操作简单,特别有助于床边DIC的诊断,但价格较贵,尚未能普及.
3)标本采集和处理
①患者的准备 患者应停用影响止凝血试验的药物至少1周.
②抗凝剂 国际血液学标准化委员会推荐用于止凝血试验的抗凝剂为0.109M枸橼酸钠(有利于稳定V和VIII,有利于提高APTT监测肝素时的灵敏度),其与血液的容积比为1:9;该比例是基于血标本Ht在正常范围内为前题,若血标本的Ht异常增高或异常减低,由于枸橼酸离子不能进入红细胞内,如不调整适合不同Ht的抗凝剂量,则可使PT延长或缩短.矫正公式:抗凝剂用量=0.00185×血量(ml)×(100—患者Ht).
③采血和处理 止血带使用时间要短,否则可使局部血液浓缩,内皮细胞释放t-PA增加;使用高质量真空带盖采血管或硅化管或塑料管;如不加盖,可使血液中的二氧化碳丢失,pH增高,从而凝固时间延长;采血必须顺利快捷,避免凝血溶血和气泡(气泡可使Fg,FV,FVII变性和引起溶血,溶血又可引起FVII激活,使PT缩短);凝血检测用的血标本应单独采集,立即分离血浆,按规定的离心力除去血小板;创伤性或留置导管的血标本以及溶血,凝血不适宜做凝血试验.
④储存温度和测定时间 低温虽可减缓凝血因子的失活速度,但可活化FVII,FXI.如储存血标本,也要注意有效时间,储存时间过长,凝血因子(尤其FVIII)的活性明显减低,因此,从标本采集到完成测定的时间通常不宜超过2h.
⑤测定 手工法测定,标本温浴时间不宜低于3min,也不宜超过10min;判断何时为纤维蛋白形成(血浆凝固)则是测定PT的关键性技能之一.仪器法测定必须按规范的操作要求进行,不能随意改变测定条件;不同仪器,不同凝固法的终点判原理不一,应建立各自的参考值.
4)组织凝血活酶试剂质量
该试验灵敏度的高低依赖于组织凝血活酶试剂的质量.试剂可来自组织抽提物,应含丰富的凝血活酶(TF和磷脂);现也用纯化的重组TF(r-TF)加磷脂作试剂,r-TF比动物性来源的凝血活酶对FII,FVII,FX灵敏度更高.组织凝血活酶的来源及制备方法不同,使各实验室之间及每批试剂之间PT测定结果差异较大,可比性差,特别影响对口服抗凝剂患者治疗效果的判断,因此,应使用标有国际敏感指数(ISI)的试剂.
5)国际敏感指数和国际标准化比值
为了校正不同组织凝血活酶之间的差异,早在1967年WHO就将人脑凝血活酶标准品(批号67/40)作为以后制备不同来源组织凝血活酶的参考物,并要求计算和提供每批组织凝血活酶的ISI.
ISI表示标准品组织凝血活酶与每批组织凝血活酶PT校正曲线的斜率.即在双对数的坐标纸上,纵坐标是用标准品测定的PT对数值,横坐标是用待校正的组织凝血活酶测定相同标本PT的对数值,经回归求得直线斜率,则待标定的组织凝血活酶的ISI=已知ISI×斜率.批号67/40的组织凝血活酶的参考物ISI为1.0.ISI值越低,试剂对有关凝血因子降低的敏感度越高.
对口服抗凝剂的患者必须使用国际标准化比值(INR)作为PT结果报告形式,并用以作为抗凝治疗监护的指标.
INR=(患者凝血酶原时间/正常人平均凝血酶原时间)ISI.
作PT测定前,应首先了解所用组织凝血活酶试剂的ISI,ISI值通常由厂商提供,测定PT后,即可计算出INR.INR也可从试剂制造商提供的图表中查得.使用ISI和INR可缩小各实验PT测定在技术上和试剂上差异,使抗凝疗法监测中,不同机构的检测结果有可比性.
由于INR是由公式INR=PTRISI换算而来,ISI对INR有很大影响.当ISI=1时,其精密度与敏感度都最高,此时INT=PTR.随着ISI值的增加,INR与PTR的CV值逐渐增大,同时敏感性也逐渐降低.一般认为,用于监测口服抗凝剂治疗时,所用组织凝血活酶的ISI值以1.0~1.5为好.
6) 正常对照 必须至少来自20名以上男女各半的混合血浆所测结果.
7)报告方式 一般情况下,可同时报告受检者PT(s)和正常对照PT(s)以及凝血酶原比率(PTR),PTR=被检血浆PT/正常血浆PT.当用于监测口服抗凝剂用量时,则必须同时报告INR值.
[参考值] 每个实验室应建立所用测定方法相应的参考值.通常:① 成人:11~15s;新生儿延长2~3s;早产儿延长3~5s(3~4d后达到成人水平).② PTR:0.85~1.15.③ INR:口服抗凝剂治疗不同疾病时,需不同的INR.
[临床意义] 是检测外源性凝血因子有无缺陷较为敏感的筛检试验,也是监测口服抗凝剂用量的有效监测指标之一.
1)PT延长 超过正常对照3秒以上或PTR超过参考值范围即为延长.主要见于:① 先天性FII,FV,FVII,FX减低及纤维蛋白原缺乏(Fg<500mg/L),或无纤维蛋白原血症,异常纤维蛋白原血症.② 获得性凝血因子缺乏,如DIC,原发性纤溶亢进症,阻塞性黄疸和维生素K缺乏,循环抗凝物质增多等.香豆素治疗时,当FII,FV,FVII,FX浓度低于正常人水平40%时,PT即延长.
PT对FVII,FX缺乏的敏感性较对FI,FII缺乏的要高,但对肝素的敏感性不如APTT.
2)PT缩短 ① 先天性FV增多.② DIC早期(高凝状态).③ 口服避孕药,其他血栓前状态及血栓性疾病.
3)口服抗凝药的监测 临床上,常将INR为2~4时作为口服抗凝剂治疗时剂量适宜范围.当INR大于4.5时,如Fg和血小板数仍正常,则提示抗凝过度,应减低或停止用药.当INR低于4.5,而同时伴有Fg和(或)血小板减低时,则可能是DIC或肝病等所致,也应减低或停止口服抗凝剂.
7.血液凝固调节系统
(1)抗血液凝固系统的组成和功能
抗血液凝固机制包括细胞和体液二方面的因素.重点是体液抗凝蛋白的特性与作用.
1)蛋白C系统:蛋白C系统除PC外,还包括蛋白S(PS),血栓调节蛋白(TM)和内皮细胞蛋白C受体(EPCR).PC必须转变成活化的PC(APC)才能发挥其抗凝作用.凝血酶是PC唯一的生理性活化剂,TM可大大加速凝血酶对PC的激活.APC的作用靶是因子Va和因子VIIIa.另外,APC可抑制因子Xa与血小板膜磷脂的结合;激活纤溶系统;增强AT-III与凝血酶的结合.APC可以被a2抗纤溶酶,α1抗胰蛋白酶, a2巨球蛋自和3型纤溶酶原激活抑制物所灭活.
2)肝素-抗凝血酶途径:在肝素的存在下,AT-III抑制凝血酶,因子Xa,XIa,IXa以及其它丝氨酸蛋白酶.血浆AT-III缺陷与血栓形成性疾病的相关性表明,它在调节体内止血方面起着至关重要的作用.肝素是众所周知的高效抗凝物,它的抗凝活性归因于其加速AT-III对凝血蛋白酶的灭活作用.
3)组织因子途径抑制物:TFPI是一种与脂蛋白结合的生理性丝氨酸蛋白酶抑制物,在生理性抗凝血蛋白作用中占相当重要的比重,并且直接参与了血液凝固的全过程.它可以直接抑制活化的因子X(Xa),并以依赖Xa的形式在Ca++存在条件下抑制TF-VIIa复合物;还能抑制胰蛋白酶,对纤溶酶及糜蛋白酶也有轻微抑制,但不抑制凝血酶,APC,t-PA等.
4)其它凝血抑制物:蛋白Z和蛋白Z依赖的蛋白酶抑制物;表面结合抑制物,包括磷脂酶A2,狼疮抗凝物,维生素K依赖性凝血蛋白活化片段及血管抗凝物.
【记忆要点】 主要体液抗血液凝固蛋白可总结于表7-3,便于记忆.
表7-3 主要抗血液凝固物质
名称 组成成份 主要作用靶
蛋白C系统 PC,PS,TM,EPCR FVa,FVIIIa
肝素-抗凝血酶III AT-III,HC-II 凝血酶,FXa,FIXa等
组织因子途径抑制物 TFPI TF/VIIa
其它凝血抑制物 PZ,PZI等 FXa等
(2)纤维蛋白溶解系统的组成和功能
纤维蛋白溶解系统(简称纤溶系统),是指纤溶酶原被特异牲激活物转化为纤溶酶(PL),纤溶酶降解纤维蛋白的过程.这一系统的主要功能是将沉积在血管内外的纤维蛋白溶解而保持血管畅通,防止血栓形成或使已形成的血栓溶解,血流复通.
1)纤溶酶原:在组织型纤溶酶原激活物和尿激酶型纤溶酶原激活物的作用下,激活成纤溶酶,使纤维蛋白溶解.
2)组织纤溶酶原激活物:其作用是使纤溶酶原激活转化为纤溶酶.
3)尿激酶型纤溶酶原激活物:肾小管部分上皮细胞,内皮细胞,单核细胞,纤维母细胞以及一些肿瘤细胞株均能合成和分泌u-PA.其作用也是使纤溶酶原激活转化为纤溶酶.
4)纤溶酶:PL是由PLG经纤溶酶原激活物作用裂解后所产生的.主要作用有:①降解纤维蛋白原和纤维蛋白;②水解各种凝血因子(V,VII,X,XI,XII);③分解血浆蛋白和补体;④将单链t-PA,u-PA转变为双链t-PA,u-PA;⑤将谷-PLG转变为赖-PLG;⑧降解GPIb,GPIIb/IIIa;⑦激活转化生长因子,降解纤维连接蛋白,TSP等各种基质蛋白质.
5)纤溶抑制物:有纤溶酶原激活抑制物-1(PAI-1),纤溶酶原激活抑制物-2(PAI-2),纤溶酶原激活抑制物-3(PAI-3),α2-抗纤溶酶(α2-AP),α2-巨球蛋白(α2-MG)等.
纤维蛋白(原)降解机制:纤维蛋白溶解过程是一系列蛋白酶催化的连锁反应,主要分为二个阶段,即PLG在其激活物的作用下转变成PL和PL水解纤维蛋白(原)及其他蛋白质的过程.
纤溶酶原激活途径:内激活途径,外激活途径,外源性激活途径.
纤维蛋白〔原〕降解机制:纤溶酶作用于纤维蛋白原,水解释放出两条多肽,即Bβ1～42和Aa链上裂解下来的碎片A,B,C,H,留下X片段.X片段继续被纤溶酶作用,裂解为D片段及Y片段,Y片段再进一步被裂解为D和E片段.可溶性纤维蛋白及交联纤维蛋白在纤溶酶的作用下,最终形成X\',Y\',D和E\'片段,还生成D-二聚体和g-二聚体等产物.
纤维蛋白(原)降解产物的作用:纤维蛋白原降解产物(FgDP)和纤维蛋白降解产物(FbDP)统称为纤维蛋白(原)降解产物(FDP),均具有抗血液凝固的作用.
【记忆要点】 表7-4总结纤维蛋白溶解系统主要成份及作用.
表7-4 纤维蛋白溶解系统
名称 组成成份 主要作用靶
纤溶酶 PLG,PL Fb,Fbg等
纤溶酶原激活物 t-PA,u-PA PLG
纤溶抑制物 PAI-1,PAI-2,PAI-3等 t-PA,u-PA,PC等
纤维蛋白(原)降解产物 碎片A,B,C,D,H,
X片段,Y片段,D-二聚体等 凝血酶等(抗凝作用)
8.血液凝固调节系统的检查
(1)生理性抗凝物质检测
1)蛋白C活性及抗原测定
2)抗凝血酶III活性及抗原测定
3)凝血酶—抗凝血酶III复合物
4)组织因子途径抑制物活性及抗原测定
(2)病理性抗凝物质检测
1)复钙交叉实验
2)血浆肝素水平测定
3)凝血酶时间及其纠正实验
4)凝血因子VIII抑制物测定
5)狼疮抗凝物
(3)纤维蛋白溶解活性检测
1)组织纤溶酶原激活物活性及抗原测定
2)纤溶酶原激活物抑制物活性及抗原测定
3)血浆纤溶酶原活性及抗原测定
4)纤溶酶—抗纤溶酶复合物
5)a2-抗纤溶酶活性及抗原测定
(4)纤维蛋白降解产物检测
1)血浆硫酸鱼精蛋白副凝固实验
2)纤维蛋白(原)降解产物测定
3)D-二聚体测定
4)纤维蛋白单体(TM)测定
5)纤维蛋白肽Bb1-15与Bb15-42测定
【记忆要点】 表7-5总结检测抗凝及纤溶系统主要项目.
表7-5 检测抗凝及纤溶系统主要项目
项目 参考值 临床应用
蛋白C活性检测 100.24%±13.18% 易栓症,先天性PC缺陷症
蛋白C抗原检测 102.5%±20.1%
抗凝血酶III活性测定 108.5%±5.3% 高凝状态,遗传性AT-III缺乏
抗凝血酶III抗原测定 (0.29±0.06)g/L
组织因子途径抑制物活性测定 < 1U 先天性TFPI缺乏,
组织因子途径抑制物抗原测定 (75～120)mg/L 消耗性TFPI缺乏
血浆肝素水平测定 0 U/L 肝素抗凝监测
凝血酶时间 16～18s 纤溶亢进,DIC,溶栓监测
组织纤溶酶原激活物活性测定 300～600 U/L 纤溶亢进,DIC,高凝状态
组织纤溶酶原激活物抗原测定 1～12 g/L
纤溶酶原激活物抑制物活性测定 (100～1000)AU/L 高凝状态,原发及继发纤溶
纤溶酶原激活物抑制物抗原测定 4～43 mg/L
血浆纤溶酶原活性测定 85.55%±27.83% 高凝状态,原发及继发纤溶
血浆纤溶酶原抗原测定 (0.22±0.03)g/L
a2-抗纤溶酶活性测定 95.6%±12.8% 血栓形成,DIC,先天性a2-
a2-抗纤溶酶抗原测定 66.9±15.4 mg/L 抗纤溶酶缺乏
血浆硫酸鱼精蛋白副凝固实验 阴性 DIC
纤维蛋白(原)降解产物测定 < 5 mg/L 血栓形成,原发及继发纤溶
D-二聚体测定 0～0.256 mg/L 血栓形成,继发纤溶,DIC
第八章 红细胞疾病的检查
1.贫血的诊断和分类
(1)确定贫血存在,程度及类型
贫血是指患者的血红蛋白浓度低于相应的年龄组,性别组和海拔高度组的参考值下限.
表8-1 贫血的诊断标准及程度
男性 女性 孕妇
贫 血 Hb<120g/L Hb<110g/L Hb<100g/L
极重度 Hb100 >34 叶酸/B12缺乏症
部分骨髓再生障碍性贫血
正细胞性贫血 80~100 27~34 急性失血
溶血性贫血
部分骨髓再生障碍性贫血
继发性贫血
小细胞性贫血 <80 1.0 1.0 <1.0 0.5 0.5 <0.5 20 20 <20 <20
骨髓增生程度 低下 极度低下 低下 极度低下 极度低下
预后 较好 差 较好 差 差
(2)再生障碍危象
1)定义 是由于多种原因所致的骨髓造血功能暂时性的急性停滞.常在原有疾病的基础上合并感染,特别是病毒感染诱发.患者可突然贫血或原有贫血突然加重,多数在1~2周内恢复.
Hb常低至20~30g/L,网织红细胞急剧下降或为0为特点.骨髓象多数增生活跃,正常幼红细胞难见,可见巨大原始红细胞,粒系受累时可见巨大的早幼粒细胞.
本病需与急性再生障碍性贫血和纯红细胞再生障碍性贫血相鉴别.后者以骨髓单纯红细胞系统造血障碍为特征的一组异质性综合征.诊断主要是根据其血象和骨髓象中单纯的红细胞系的减少,网织红细胞显著减少,无病态造血和髓外造血;有关溶血性贫血的实验室检查均为阴性.
2.缺铁性贫血
(1)铁缺乏症和缺铁性贫血的定义,病因和分期
1)定义 铁缺乏症是指机体铁含量低于正常.铁缺铁性贫血是指因铁的需要量增加或/和铁的吸收减少所致机体储存铁减少或耗竭,导致红细胞生成障碍所致贫血.
2)病因 ①铁摄入不足;②铁丢失过多.婴幼儿,儿童及孕妇的缺铁性贫血以营养性为主,成年人缺铁性贫血的以出血为主.
3)分期 铁缺乏症可分为三个连续的阶段:储存铁耗竭,缺铁性红细胞生成,缺铁性贫血.
(2)血象,骨髓象和其他检查
(3)诊断标准与鉴别诊断
1)储存铁耗竭 符合以下条款1,再加上2或3中任意一条即可诊断.①有明确的缺铁病因和临床表现;②血清铁蛋白<14μg/L;③骨髓铁染色铁粒幼红细胞<10%或消失,细胞外铁缺如.
2)缺铁性红细胞生成 符合储存铁耗竭的诊断标准,同时有以下任何一条者即可诊断.转铁蛋白饱和度<15%,血清铁64.4μmol/L (或转铁蛋白>3.8g/L);②红细胞游离原卟啉>0.9μmol/L或>4.5g/gHb.
3)缺铁性贫血 ①符合铁耗竭和缺铁性红细胞生成的诊断标准;②小细胞低色素性贫血;③铁剂治疗有效.
4)合并感染,炎症,肿瘤时缺铁的诊断标准 ①红细胞内碱性铁蛋白5%或6叶者>1%;③骨髓巨幼红细胞>10%.粒细胞也有巨幼样变,特别是晚幼粒细胞.巨核细胞可有巨幼样变和核分叶过多及血小板生成障碍.
特殊检查:①血清叶酸(放射免疫法)<6.91nmol/L(<3ng/ml);②红细胞叶酸(放射免疫法)<227nmol/L(<100ng/ml);③脱氧尿嘧啶核苷抑制试验不正常,并可被叶酸纠正者;④诊断性治疗有效.
符合特殊检查标准任意两项,或同时具有消化道症状者诊断为叶酸缺乏症.达到实验室检查标准的①和②(或③),同时有临床表现者诊断为叶酸缺乏性巨幼细胞贫血.
2)维生素B12缺乏性巨幼红细胞贫血
临床表现:①贫血症状;②消化道症状及舌炎;③神经系统症状.
实验室检查与叶酸缺乏性巨幼细胞贫血相同.
特殊检查:①血清维生素B12(放射免疫法)<75pmol/L;②红细胞叶酸(放射免疫法)<227pmol/L(10%
(↑)膜异常 自身溶血试验+)
遗传性椭圆形红细胞增多症(椭圆形红细胞 >15%)
红细胞渗透 遗传性口形红细胞增多症 (口形红细胞 ↑)
脆性试验
G6PD缺乏 (G6PD酶活性↓)
(正常) 酶异常
PK缺乏 (PK活性测定↓)
α-珠蛋白生成障碍性贫血(Hb Bart\'s, HbH)
(↓)血红蛋白异常 β-珠蛋白生成障碍性贫血 (HbA2↑,HbF↑)
镰形细胞贫血 (红细胞镰变性异常,HbS)
不稳定血红蛋白病 (异丙醇试验+,变性珠蛋白小体>30%)
图 8-3 遗传性溶血性贫血的病因诊断示意图
2)临床特征 大多数在儿童期发病,轻型病人到成年时才诊断.偶尔可以表现为溶血危象.典型病例为中等度脾肿大,慢性溶血性贫血.脾切除可以永久性消除溶血.
3)实验室检查与诊断 渗透脆性增加;外周血涂片上小球性红细胞增多(多>10%),可高大60~70%;自溶血试验溶血大于5%;酸化甘油溶血试验阳性(150秒以内).阳性家族史非常重要.
(3)葡萄糖-6-脱氢酶缺乏症
1)定义,遗传方式,发病机理及分型
G6PD是已发现的遗传性红细胞酶缺陷病中最常见的一种.主要分布于非洲,亚洲和有此两种血统的人群中,地中海地区也较常见.G6PD基因位于X染色体上,以伴性不完全显性方式遗传.携带G6PD疾病基因的男性和纯合子女性为疾病患者,而杂合子女性因两条X染色体中一条随机失活,细胞G6PD的表达很不一致,可从正常到明显缺乏不等.
G6PD活性降低,使细胞的还原能力(NADPH和还原型谷光苷肽)缺乏,使血红素的亚铁离子,血红蛋白和其他结构蛋白的巯基被氧化而损伤.
2)临床表现 ①急性溶血性贫血:患者在疾病稳定期无贫血表现,只在某些诱导因素作用下才发生;②先天性非球性红细胞性溶血性贫血:其共同特点是体外酶活性降低,且极不稳定,溶血无明显诱因.患者在新生儿期即可有黄疸和贫血;③新生儿高胆红素血症多于出生后一周内发生黄疸;④蚕豆病:以儿童居多.发病具有明显的季节性(3~5月),患者具有进食新鲜蚕豆或哺乳期婴儿有母亲进食蚕豆史,摄入蚕豆后数小时至数天突然发生急性血管内溶血.
3)实验室检查与诊断 G6PD活性筛选试验有高铁血红蛋白还原试验,荧光斑点试验,硝基四氮唑蓝纸片法及Heinz 包涵体试验.有条件的应提倡使用G6PD活性定量试验.
阳性家族史.筛选试验中两项中度异常,或一项中度异常伴排除其它血红蛋白病后的Heinz包涵体试验阳性(>45%),或一项中度异常伴阳性家族史,或一项严重异常,或定量测定酶活性异常,即可确定诊断.
(4)免疫性溶血性贫血
1)定义 是一组由于红细胞表面结合抗体或/和补体而引起的溶血性贫血.包括自身免疫性(温抗体型和冷抗体型),同种免疫性(血型不合输血和新生儿溶血病)和药物免疫性(自身抗体型,免疫复合物型和半抗原型)溶血性贫血.其中温抗体型自身免疫性溶血性贫血是免疫性溶血中最常见的一种.
表8-6 自身免疫性溶血性贫血的诊断依据
温抗体型 冷抗体型
获得性溶血性贫血 获得性溶血性贫血
直接Coomb\'s 试验IgG 或/和C3 + 直接Coomb\'s试验IgG-/C3 +
4个月内无输血和特殊药物史 *寒冷时手足发绀
*冷凝集素效价>1:40
@冷热溶血试验+
注 *冷凝集素综合征 @阵发性冷性血红蛋白尿
2)临床特征 主要是贫血和不明原因的发热.本病如伴免疫性血小板减少称为Evans综合征.
3)检验与诊断 直接抗人球蛋白试验阳性是诊断免疫性溶血性贫血的依据.但是,其结果与溶血的严重程度之间没有关系.进一步的试验可以帮助分类:①同种免疫性溶血性贫血通过血型鉴定可以确诊;②药物性免疫性溶血常有明确的药物接触史,间接Coombs未加药物阴性,加药物后为阳性.③符合表8-6条件者可分别诊断为温抗体型或冷抗体型自身免疫性溶血性贫血.
(5)阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)
1)定义 是唯一的获得性的红细胞膜缺陷所致的溶血病.已证明本病为造血干细胞的糖化磷脂酰肌醇-锚(GPI-A)基因突变,使红细胞对补体的敏感性增加.
2)临床特征 ①慢性溶血性贫血;②特征性的,间歇性发作的睡眠后血红蛋白尿;③主要累及静脉系统的血栓形成;④感染和出血.
3)检验 ①几乎所有患者有贫血,多数Hb<60g/L,通常是大细胞性的,可见有核细胞和红细胞碎片;半数患者为全血细胞减少;②半数以上的骨髓三系细胞增生活跃,尤以红系造血旺盛为特征;不同穿刺部位增生程度明显差异,可呈增生低下;③尿含铁血黄素试验阳性;④溶血存在的实验室证据;⑤补体敏感的红细胞存在的证据.蔗糖溶血试验(筛选)阳性;热溶血试验(阴性可极大程度上排除PNH)阳性;酸溶血试验(确诊)阳性.
4)诊断 ①临床表现符合PNH;②证明有补体敏感的红细胞群存在.
(6)血红蛋白病
1)定义 是一组遗传性或基因突变所致的血红蛋白合成障碍性疾病.根据其缺陷的不同又分为珠蛋白肽连数目合成异常或结构异常两大类.前者被称为珠蛋白生成障碍性贫血, 是常染色体隐性遗传性疾病,包括常见的β-珠蛋白生成障碍性贫血和少见的α-珠蛋白生成障碍性贫血;后者被成为狭义的血红蛋白病,为常染色体显性遗传性疾病,如HbS,HbE和HbC等.
血红蛋白病代表了一种世界范围内最常见的遗传性疾病.珠蛋白生成障碍性贫血约有1.5亿基因携带者;HbS约有1亿基因携带者;HbE在南亚约有30%的基因携带者;HbC在西非约有25%的基因携带者.
各种血红蛋白的组成见表8-7.
2)β-珠蛋白生成障碍性贫血 由于β链合成减少,过多的α链:①使含α链的血红蛋白HbA2或/和HbF的增加;②在幼红细胞和红细胞中形成包涵体,使红细胞特别扁平,中间的血红蛋白稍多,而周边较少,形成靶形红细胞;③形成的α链包含体附着于红细胞膜,使红细胞僵硬,导致无效造血和溶血;④使红细胞对钾离子的通透性增加,能量代谢能力降低,生存期缩短.
根据β-链合成是部分或是完全缺如,分别称为β+-和β0-两种基因型.其基因型和表型(或疾病)之间的关系见表8-8.
表8-7 各种血红蛋白的肽链组成
血红蛋白种类 珠蛋白肽链组成
HbA α2β2
HbA2 α2δ2
HbF α2γ2
Hb Gower1 ζ2ε2
Hb Gower2 α2ζ2
Hb Porland γ2δ2
各型β珠蛋白生成障碍性贫血的临床表现和实验室结果的差异极大,详见表8-9.
表8-8 β-珠蛋白生成障碍性贫血基因型和表型(或疾病)的关系
表型/疾病 基 因 型
极轻型β-珠蛋白生成障碍性贫血 杂合子 β+/β
轻型β-珠蛋白生成障碍性贫血 杂合子 β+/β
β0/β
(δβ)0/β
(δβ)Lepore/β
中间型β-珠蛋白生成障碍性贫血 纯合子 β+/β+
(δβ)0/(δβ)0
双重杂合子 βo/(δβ)0
β+/(δβ)0
β0/(δβ)Lepore
β+/(δβ)Lepore
(δβ)0/(δβ)Lepore
(δβ)0/β
杂合子 β0/β
重型β-珠蛋白生成障碍性贫血 纯合子 β0/β0
β+/β+
(δβ)Lepore/(δβ)Lepore
双重杂合子 β0/β+
[诊断和鉴别诊断]
①重型β珠蛋白生成障碍性贫血:Ⅰ.多在出生后6~9个月出现贫血,发育障碍,智力受损,肝脾明显肿大,黄疸,骨骼改变,特殊\"地中海贫血面容\".需要输血治疗;Ⅱ.血红蛋白<70g/L,MCV48~72fl,;靶形红细胞在10%~30%,网织红细胞5%~15%,外周血可见有核红细胞;骨髓红细胞系统明显增生;HbA 为零或存在,HbF20%~95%,HbA2在纯合子时可以低,正常和增高.酸洗脱试验显示HbF分布相当异质
表8-9 β珠蛋白生成障碍性贫血的临床特征
项目 重型 中间型 轻型 极轻型
遗传学 纯合子 纯合子 杂合子 杂合子
双重杂合子 双重杂合子
临床严重性 ++++ +++/++ +/± ±/0
输血 定期 不需要 0 0
铁负荷 ++++ +++/++ ± 0
骨骼改变 ++++/+++ +++/0 +/0 0
脾 肿 大 ++++ ++/+++ +/0 0
黄疸 +++ ++/+ 0 0
贫血 100g/L ±
小细胞增多 +++ +++/++ + 0
低色素 ++++ +++/++ ++ +
靶形红细胞 10~35% ++ + ±
网织红细胞 5~15% 3~10% 2~5% 1~2%
0 没有异常;± 没有或极轻度异常;+ 轻度异常;+++/++++ 明显异常.
性;Ⅲ.双亲均为杂合子β+或β0珠蛋白生成障碍性贫血;或一方为杂合子β+,另一方为杂合子β0珠蛋白生成障碍性贫血;Ⅳ.患者珠蛋白肽链合成速率显示β/α降低(0~0.3),基因分析为纯合子β+或β0珠蛋白生成障碍性贫血,或双重杂合子β0/β+.
有慢性溶血性贫血的临床表现,HbF增加,能排除HbF增加的其他疾病,重型β珠蛋白生成障碍性贫血的诊断即成立.
②中间型β珠蛋白生成障碍性贫血:Ⅰ.多在2~5岁时出现贫血,症状和体征较重型轻,不需要输血;Ⅱ.血红蛋白70~100g/L,MCV明显降低,成熟红细胞形态与重型相似;网织红细胞3%~10%;偶见有核红细胞;HbA为零或存在,HbF20%~80%, HbA2量可减低,正常或增高;Ⅲ.双亲为β+或β0或其他类型珠蛋白生成障碍性贫血的杂合子;Ⅳ.珠蛋白肽链合成速率显示β/α比值降低,基因分析可知突变基因类因.
中间型珠蛋白生成障碍性贫血的特点是一些病例检查结果像重型,临床表现又不像.另一些病例检查结果像轻型,但临床表现又较重.他们包含着多种遗传学上不相同的疾病.具备重型β珠蛋白生成障碍性贫血的基本的诊断条件,但不需要输血,血红蛋白维持在70g/L以上,可诊断为本型珠蛋白生成障碍性贫血.
③轻型β珠蛋白生成障碍性贫血:Ⅰ.可有轻度贫血,无黄疸,偶见脾轻度肿大,无明显骨骼改变;Ⅱ.血红蛋白>100g/L;轻度小细胞,低色素,网织红细胞2%~5%,外周血无有核红细胞,HbA2>3.2%, HbF1%~6%;Ⅲ.双亲一方为杂合子β+或β0或其他类型珠蛋白生成障碍性贫血;Ⅳ.患者为杂合子β+或β0或其他类型珠蛋白生成障碍性贫血.
HbA2轻度增加,能排除HbA2增加的其他原因和缺铁性贫血,本并病的诊断即成立.
④极轻型β珠蛋白生成障碍性贫血:Ⅰ.偶见轻度贫血,无黄疸,无肝脾肿大,多为其他疾病做血液学检查时发现;Ⅱ.血红蛋白正常,偶见红细胞呈小细胞低色素,网织红细胞1%~2%;外周血无有核红细胞和靶形红细胞;HbA97%,HbA2<3.2%, HbF<1%;Ⅲ.双亲一方为杂合子β+或β0珠蛋白生成障碍性贫血;Ⅳ.患者珠蛋白肽链合成速率显示α/β为1.3左右;基因分析为杂合子β+珠蛋白生成障碍性贫血
本型诊断一般根据双亲的一方是正常的,另一方是HbA2升高的轻型β珠蛋白生成障碍性贫血而进行推断.珠蛋白肽链合成速率测定或基因分析可确诊.
3)α珠蛋白生成障碍性贫血
α珠蛋白生成障碍性贫血是由于α基因缺失所致的α链合成速度明显降低或几乎不能合成.在胎儿期过多γ链聚合形成γ4,即Hb Bart\'s.Hb Bart\'s与氧的亲和力高,在组织中放氧极少,常导致胎儿窒息死亡,或因胎儿水肿综合征在围产期死亡.出身后,由于γ链的合成逐步转化为β链,过多的β链聚合形成β4,即HbH.但因为HbH一般在30%以下,出生后能存活和成长.HbH是一种不稳定血红蛋白,形成小量的红细胞内包涵体,并易沉积在红细胞内;同时这种红细胞膜的通透性增高,红细胞膜易破碎,使红细胞的生存时间明显缩短,出现慢性溶血性贫血和骨髓造血代偿性增加.
α链合成部分缺如称为α+基因,完全缺如称为α0基因.α+基因表示为(-α),α0基因表示为(--).α珠蛋白生成障碍性贫血表型与基因型之间的关系见表8-10.
表8-10 α珠蛋白生成障碍性贫血基因型与表型(或疾病)的关系
表型/疾病 基因型
胎儿水肿综合征 纯合子α0 (--/--)
Hb H病 双重杂合子α0/α+ (--/-α)
轻型α珠蛋白生成障碍性贫血 杂合子α0 (--/αα)
纯合子α+ (-α/-α)
极轻型α珠蛋白生成障碍性贫血 杂合子α+ (-α/αα)
各型α珠蛋白生成障碍性贫血的临床表现和实验室结果见表8-11.
表8-11 α珠蛋白生成障碍性贫血的临床特征
项目 胎儿水肿综合征 Hb H病 轻型 极轻型
遗传学 纯合子α0/α0 双重杂合子α0/α+ 杂合子α0 杂合子α+
纯合子α+
胎儿/新生儿死亡 是
慢性溶血性贫血 相当于中间 轻度贫血 无临床和
型珠蛋白生成障碍性贫血 血液学异常
新生儿的Hb组成 Hb Bart\'s80~90% Hb Bart\'s20~40% Hb Bart\'s2~10% Hb Bart\'s0~2%
Hb H Hb H5~10%
Hb Portland HbF
一岁后Hb组成 Hb H 5~40% HbA270%, HbH5%~10%, Hb Portland 10%~15%;Ⅲ. 胎儿双亲均为杂合子α0珠蛋白生成障碍性贫血;Ⅳ.胎儿缺失4个α珠蛋白基因,基因型为--/--(纯合子α0珠蛋白生成障碍性贫血).
水肿胎儿,Hb Bart\'s>70%,能排除Rh或ABO血型不合所致的胎儿水肿,诊断即成立.
②血红蛋白H病:Ⅰ.出生后一岁左右逐步出现轻度贫血,轻度黄疸,肝脾肿大,骨骼改变,轻度\"地中海贫血\"面容;Ⅱ.血红蛋白70~80g/L,MCV,MCH均降低;新生儿:Hb Bart\'s20~40%,HbH 5%~10%,其余为HbF;大于6g个月或成人可见大量的HbH细胞(结晶紫染色有包涵体的细胞),HbH10%~20%;少量Hb Bart\'s或/和HbCS;Ⅲ.患者双亲一方为杂合子α+珠蛋白生成障碍性贫血,另一方为杂合子α0珠蛋白生成障碍性贫血;Ⅳ. 患者基因型为--/-α(混合杂合子α+α0).
血红蛋白电泳出现HbH带,能排除继发性HbH病,诊断即成立.
③轻型α珠蛋白生成障碍性贫血:Ⅰ.常无贫血;Ⅱ.轻度低色素和小细胞增多;新生儿脐血Hb Bart\'s 2%~10%,出生一年后消失;之后,HbH不存在,HbA250%),红细胞即发生镰形变.镰形变的红细胞易在血管内外被破坏而溶血.镰形变的红细胞也使血液的黏滞度增加,血流缓慢,引起血管堵塞.堵塞的血管加重组织缺氧和酸中毒,导致更多的红细胞镰形变.
镰形细胞贫血有纯合子和杂合子两种基因型,其临床和实验室特征见表8-12.HbS与其他血红蛋白病的双重杂合子,如Hb SC,Hb SE,Hb SD等统称为镰形变综合征.
[诊断] ①阳性家族史;②血红蛋白电泳或层析分析发现HbS;③血涂片上观察到镰形细胞改变有助于诊断.
表8-12 镰形细胞贫血的临床和实验室特征
血红蛋白病 基因型 临床表现 血红蛋白组成
镰形细胞贫血 纯合子(Hb SS) 一岁起病 HbS>90%
①慢性溶血性贫血 HbF<10%
②血管栓塞致疼痛 HbA2<3.2%
危象和多器官损伤
镰形细胞特征 杂合子(Hb AS) 无症状,罕见无 HbS35~45%
症状血尿 HbA297%
网织红细胞2~6% HbF0.5~2%
靶形红细胞>90%
偶见小球形红细胞
HbC特征 杂合子(Hb AC) 无症状 HbA2不能分离出
可出现血尿/阴茎异常勃起 HbC30~40%
靶形红细胞5~30% HbA50~60%
诊断依赖于血红蛋白电泳或层析发现HbC,阳性家族史很重要.
6)HbE病
是由于β链第26位上的谷氨酸被赖氨酸取代而形成的血红蛋白变异体,是第二种常见的血红蛋白病.80%的患者生活在东南亚.临床和实验室特征见表8-14.
表8-14 HbE的临床和实验室特征
血红蛋白病 基因型 临床表现 血红蛋白组成
HbE病 纯合子(Hb EE) 无或轻微贫血 HbA2不能分离出
明显的小红细胞 HbE92~95%
MCV55~65fl HbF正常或增加
靶形/细长红细胞
HbE特征 杂合子(Hb AE) 无症状 HbA2不能分离出
小红细胞MCV65fl HbE20~35%
靶形红细胞 其余为HbA
诊断依赖于血红蛋白电泳或层析发现HbE.
7)不稳定血红蛋白病
是由于维持血红蛋白分子稳定性特别重要的氨基酸被替换所致,这主要是涉及到血红素与珠蛋白之间的连接处.其基因型都是杂合子,遗传方式是常染色体显性遗传.不稳定血红蛋白变异体可自发或被氧化性物质诱导而形成红细胞内的变性珠蛋白小体,使红细胞寿命缩短.这组疾病的临床表现为慢性或药物诱导的溶血性贫血,Heinz包涵体和中暗褐色尿.
热变性试验和异丙醇沉淀试验都能可靠地检测出不稳定的血红蛋白
6.继发性贫血
继发性贫血即造血系统以外的全身性疾病导致的贫血.
(1)慢性感染或肿瘤性贫血
贫血是慢性感染或肿瘤性疾病的结果.以结核,类风湿关节炎,克隆氏病,亚急性细菌性心内膜炎,溃疡性结肠炎,肿瘤最为常见.约2/3患者是正细胞的,1/3的患者为小细胞的,虽有血清铁水平降低而储存铁增加.原因:①病原微生物或/和炎症组织释放的毒素使红细胞生成素释放减少;②吞噬细胞固定贮存铁,因此不能与转铁蛋白迅速进行交换,使铁被排除在正常的铁循环之外,而致血红蛋白和合成减少;③某些红细胞外在因素导致红细胞寿命缩短等.症状主要取决于原发病.
(2)慢性肝脏疾病所致贫血
一般为大细胞性.主要原因:①摄入和储存不足致营养性的叶酸或/和B12缺乏;②<B style=\'color:black;background-color:#ffff66\'>脾功能亢进和脂肪代谢障碍使红细胞破坏过多;③凝血因子合成减少所致的出血;④EPO减少使骨髓红细胞系统增生障碍等.临床上以肝病的临床表现为主,
(3)慢性肾脏疾病所致贫血
一般为中度贫血.以血清肾功能试验异常和EPO减少为特征.贫血原因:①肾小管周围细胞EPO的分泌减少;②抑制EPO活性的物增多.临床上表现为慢性肾功能不全的症状和体征.
(4)内分泌疾病所致贫血 内分泌疾病所致的贫血主要见于因垂体,甲状腺,肾上腺和性腺等疾病.在激素替代治疗以前很常见.目前,应用激素替代治疗后已罕见.临床表现以相应的内分泌腺的症状和体征为主.
第九章 恶性造血系统疾病的检查
1.急性白血病的FAB分型及各型的实验室诊断标准
(1)概念 急性白血病是造血干细胞的克隆性恶性疾病,其主要特征是异常的原始细胞及早期幼稚细胞(白血病细胞)在骨髓中大量增殖并浸润各种器官,组织,使正常的造血功能受抑.
(2)急性白血病的分型 传统的分类方法主要根据白血病细胞的形态学特征及化学染色将AL分为急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia, ALL)和急性非淋巴细胞白血病(acute non-lymphocytic leukemia,ANLL),两者可进一步分为若干亚型.
1)FAB分型 FAB分型是目前应用最广泛的一种急性白血病的分型方法,其主要依据是骨髓细胞形态学和细胞化学特征,尤其是原始细胞的数量和形态,规定原始细胞≥30%为急性白血病的诊断标准,并将急性白血病分为急性淋巴细胞性白血病(acute lymphocytic leukemia, ALL)和急性非淋巴细胞性白血病(acute non-lymphocytic leukemia, ANLL)或称急性髓性白血病(acute myeloblastic leukemia,AML)两大类,其中ALL有3个亚型(L1,L2,L3),ANLL有8个亚型(M0,M1,M2,M3,M4,M5,M6,M7).各亚型的特点见表9-1.
表9-1 急性白血病FAB分型
类型
分 型 依 据
ALL
L1
以小原淋巴细胞为主,胞体小而一致,胞浆量极少,核形多规则,染色质呈较粗颗粒,核仁小而不清楚.
L2
以大原淋巴细胞为主,胞体大小不均,胞浆量较多,核形不规则,常见凹陷或切迹,染色质颗粒较L1型细致,易见核仁.
L3
以原淋巴细胞为主,胞浆量较多染深蓝色,富含空泡,核形多规则,染色质呈细颗粒状,核仁明显.
AML
M0
急性髓细胞白血病极微分化型:原始细胞≥30%,无T,B淋巴系标记,至少表达一种髓系抗原,免疫细胞化学或电镜MPO阳性.
M1
急性粒细胞白血病未成熟型:骨髓中原粒细胞≥90%(非红系细胞),早幼粒细胞很少,中幼粒细胞以下阶段不见或罕见.
M2
急性粒细胞白血病部分分化型:骨髓中原始粒细胞占30%～89%(非红系细胞),早幼粒细胞及以下阶段粒细胞>10%,单核细胞20%(非红系细胞);③M4c 原始粒细胞既具粒细胞系,又具单核细胞系形态特征者>30%(非红系细胞);④M4e 除上述特点外,骨髓非红系细胞中嗜酸性粒细胞>5%,这些嗜酸性粒细胞较异常,除有典型的嗜酸颗粒外,还有大的(不成熟)嗜碱颗粒.
M5
急性单核细胞白血病:根据细胞分化成熟程度分为二种亚型,即①M5a(未分化型)骨髓中原始单核细胞≥80%(非红细胞系);②M5b(部分分化型) 骨髓中原始和幼稚单核细胞(非红系细胞)>30%,原单核细胞50%,且常有形态学异常,骨髓非红细胞系原粒细胞(或原始+幼稚单核细胞)Ⅰ+Ⅱ型>30%;若血片中原粒细胞或原单核细胞>5%,骨髓非红系细胞中原粒细胞或原始+幼稚单核细胞>20%.
M7
急性巨核细胞白血病:骨髓中原巨核细胞≥30%,电镜下血小板过氧化酶(PPO)阳性,外周血中有原巨核(小巨核)细胞,血小板膜蛋白Ⅰb,Ⅱb/Ⅲa或因子Ⅷ相关抗原(vWF)阳性
注:原始细胞:指不包括原始红细胞及小巨核细胞,原始细胞包括Ⅰ型和Ⅱ型,Ⅰ型为典型原始细胞,Ⅱ型胞质可出现少许细小嗜天颗粒.核质比例稍低,其他同Ⅰ型原始细胞.
2)免疫学分型 白血病细胞的表面上有大量的蛋白抗原,可以用单克隆抗体来识别,这些抗原和抗体系根据分化簇(CD)的号码来区分的.近年来采用急性白血病的一线单抗来筛选AML及T,B淋巴系白血病,用二线单抗进一步确定亚型.
①ALL免疫学分型 目前较常用将ALL分为T细胞系(占20%)和B细胞系(80%)两大型.T细胞系分前T-ALL和T-ALL两个亚群,二者都有CD7和TdT阳性,但前者CD2阴性,后者阳性.B细胞系ALL一般分为4个亚型.
②AML的免疫学分型 髓系相关抗原的表达反映了细胞的起源,在AML中,各亚型的细胞表面上也有粒细胞,单核细胞或其他细胞的抗原,当形态学,细胞化学的检查结果不明确时,这些标记有助于各亚型的诊断,并有助于混合白血病的诊断.
③细胞遗传学分型 细胞遗传学的发展,特别是高分辨分带技术和分子生物学技术的应用,已发现多数急性白血病患者有特异的染色体异常(如异位,缺失,倒位),已发现AML核型异常检出率达93%,大约90%以上ALL可检出克隆性核型异常,其66%为特异性染色体重排,染色体异常表现与急性白血病的关系已渐明确,因此,国际上结合白血病细胞形态学(M),免疫学(I)和遗传学(C)特点提出MIC分类法.
④分子生物学分型 白血病的基因改变,基因重排及融合基因的形成与白血病的发病机制,治疗及预后等关系极为密切,如AML-M3型,90%以上患者可见到t(15;17)(q22;q12)的染色体异常,17q上的维甲酸α受体和15q上的早幼粒细胞白血病基因发生易位,形成PML-RARα融合基因,是其特异性分子标志.
⑤WHO关于急性白血病的分类建议 WHO分类将AML分为四类,即①伴重现性遗传学异常的AML;②伴多系增生异常的AML;③治疗相关性AML和MDS;④不能按上述分类的AML.将ALL分为三类,即①前B-ALL;②前T-ALL;③BurKitt细胞白血病.
(3)急性白血病的诊断与疗效判断标准
1)急性白血病的诊断
急性白血病的诊断是形态学诊断为基础,结合免疫学,细胞遗传学和分子生物学检验的MICM综合性诊断,目前,仍以FAB分类标准对急性白血病进行诊断与分型,急性非淋巴细胞白血病分8型,急性淋巴细胞白血病分3型.各型诊断标准见表9-1.
2)急性白血病疗效判断标准
急性白血病患者经治疗后,大部分患者可获得完全缓解,但缓解后部分患者可复发,有些患者可达到临床治愈,具体标准见表9-2.
表9-2 急性白血病疗效判断标准(1987年11月制订)
1.缓解标准 (1)完全缓解(complete remission,CR):
骨髓象:原粒细胞Ⅰ型+Ⅱ型(原单+幼单或原淋+幼淋)≤5%,红细胞及巨核细胞系正常
M2b型:原粒Ⅰ型+Ⅱ型≤5%,中性中幼细胞比例在正常范围;M3型:原粒+早幼粒≤5%;M4型:原粒Ⅰ型+Ⅱ型,原单+幼单核≤5%;M6型:原粒Ⅰ型+Ⅱ型≤5%,原红+幼红以及红系细胞比例基本正常;M7型:粒,红两系比例正常,原巨及幼巨核细胞基本消失
血象:男性血红蛋白≥100g/L,女性及儿童血红蛋白≥90g/L,中性粒细胞绝对值≥1.5×109/L,血小板≥100×109/L,外周血分型中无白血病细胞
临床:无白血病浸润所致的症状和体征,生活正常或接近正常
(2)部分缓解(partial remission,PR):骨髓原粒细胞Ⅰ型+Ⅱ型(原单+幼单或原淋+幼淋)>5%≤20%;或临床,血象2项中有一项未达完全缓解标准者
(3)未缓解(non-remission,NR):骨髓象,血象及临床3项均未达上述标准者
2.复发标准 有下列三者之一者称为复发(relapse):①骨髓原粒细胞Ⅰ型+Ⅱ型(原单+幼单或原淋+幼淋)>5%且20%者;③骨髓外白血病细胞浸润者
3.持续完全缓解(continual complete remission,CCR) 指从治疗后完全缓解之日起计算,其间无白血病复发达3-5年者
4.长期存活 白血病确诊之日起,存活时间(包括无病或带病生存)达5年或5年以上者
5.临床治愈 指停止化学治疗5年或无病生存(disease free survived,DFS)达10年者
注:凡统计生存率时,应包括诱导治疗不足1疗程者.诱导治疗满1疗程以上的病例应归入疗效统计范围
(4)急性髓性白血病
急性髓性白血病(AML)是由于髓系造血干/祖细胞的恶性变,目前,仍以FAB协作组的诊断标准对其进行诊断与分型,该协作组将AML分为M0～M78个亚型,并规定骨髓中原始细胞必须大于非红系细胞的30%,还将原粒细胞分为二型,即Ⅰ型为典型原粒细胞,胞浆中无颗粒;Ⅱ型有原粒细胞的特征,胞浆量较少,有少量细小颗粒(我国原用的标准是一旦出现嗜天青颗粒就划分为早幼粒细胞).
1)急性髓细胞白血病微分化型(M0)
①血象 白细胞数可低可高,血小板减少或正常,伴正细胞正色素性贫血.
②骨髓象 骨髓有核细胞增生活跃,原始细胞>30%,可达90%以上,白血病细胞形态较小,亦可较大,核圆,核仁明显,胞质少,嗜碱性,无颗粒,亦可透明,无Auer小体,易误诊为ALL的L1或L2型,红系,巨核系有不同程度的增生减低.
③细胞化学染色 POX及SBB染色为阴性或阳性率<3%;PAS及特异性酯酶染色呈阴性或弱阳性.
④免疫学标志检测 髓系分化抗原CD13,CD34,CD14,CD15,CD11b中至少有一种阳性,不表达T,B系特异性抗原,可表达无系列特异性未成熟标志CD34,TdT,HLA-DR.
⑤遗传学和分子生物学检验 大多有染色体异常,但无特异性核型.
2)急性粒细胞白血病未成熟型(M1)
①血象 血红蛋白和红细胞下降明显,大部分患者血红蛋白90%,可见小原粒细胞(胞体小,与淋巴细胞相似,胞核圆形,核染色质呈细颗粒状,较正常原粒细胞密集,核仁1～2个,有伪足),须与淋巴细胞鉴别.早幼粒细胞少,中幼粒细胞及以下各阶段细胞罕见或不见.少数病例白血病细胞内可见Auer小体,核分裂细胞较多见.大多数病例幼红细胞及巨核细胞明显减少,淋巴细胞减少.
③细胞化学染色 POX染色至少有3%原粒细胞阳性.
④免疫学检验 本型往往显示HLA-DR,MPO,CD34,CD33及CD13阳性,CD11,CD15阴性.CD33阳性者CR率高,CD13阳性,CD33阴性者CR率低.
3)急性粒细胞白血病部分成熟型(M2)
国内将M2型分为M2a和M2b两种亚型.
【M2a型】
①血象 贫血显著,白细胞的改变与M1相似,以原始粒细胞及早幼粒细胞为主,血小板中度到重度减少.
②骨髓象 骨髓中原始粒细胞占30%～89%(非红系),早幼粒细胞以下阶段至中性分叶核粒细胞>10%,单核细胞30%),以异常的中性中幼粒细胞为主,且>30%,此种细胞形态明显异常,核浆发育显著不平衡,核染色质细致,疏松,有1～2个大而清楚的核仁,与原粒细胞的核结构相似,但胞浆中已有较多细小而分布较密集的特异性中性颗粒,胞体较大,核可不规则,胞浆丰富,易见空泡,在核凹陷区常有一淡染区.
③细胞化学染色 POX染色呈阳性或强阳性反应.
④免疫学标志 表达HLA-DR,MPO,CD13,CD33和CD57,其中CD33,CD13阳性率减低,而表达列成熟的髓系抗原CD15和CD11b.
⑤遗传学和分子生物学特征 t(8;21)染色体易位,可作为M2b基因的标志,其检出率高达90%,其最大特点是常伴有性染色体丢失.也有伴其他核型异常,如-9,-15,-18等.
4)急性早幼粒细胞白血病(M3)
①血象 血红蛋白,红细胞及血小板计数减少,大多数病例白细胞轻度增高,少数患者白细胞总数减少,此时患者的血象表现为全血细胞减少.分类以异常早幼粒细胞为主,可见少数原粒及其他阶段的粒细胞,Auer小体易见.
②骨髓象 多数病例增生明显或极度活跃,个别病例增生低下.分类以颗粒增多的异常早幼粒细胞为主,>30%(非红系细胞),此类细胞胞体大小不一,外形多不规则,胞核相对较小,但大小不一,常偏位,可为圆形或类圆形,常有凹陷,折叠或分叶,染色质细致,核仁1～3个,胞浆丰富,含有很多大小不等且密集的嗜天青颗粒,有的细胞为椭圆形,核在一端,另一端为异常颗粒,有的细胞胞浆可分为内外二层,内浆含大量颗粒,外浆透明蓝色而无颗粒,常形成伪足状或瘤状突起,部分病例早幼粒细胞胞浆中有Auer小体,有的病例一个细胞可有数至数十根,呈柴捆样排列,称为\"柴捆细胞\".根据胞浆中颗粒的大小又将M3型分为两种亚型:Ⅰ.M3a(粗颗粒型):颗粒粗大,密集或融合染深紫色,可掩盖核周围甚至整个胞核;Ⅱ.M3b(细颗粒型):胞浆中嗜苯胺蓝颗粒密集而细小,核扭曲,折叠或分叶,易与急单白血病混淆.
③细胞化学染色 POX染色呈阳性或强阳性反应.非特异性酯酶染色呈阳性反应,但不被氟化钠抑制,此为急单白血病鉴别的依据之一.
④免疫学标志 典型的免疫表型呈CD13,CD33阳性,CD34及HLA-DR阴性.故以髓系标志为主而HLA-DR为阴性者M3型的可能性大.CD34阳性的APL恶性细胞颗粒小和少,且易出现白细胞计数增高,预后较差.
⑤染色体及分子生物学检验 约70%～90%的APL具有特异性的染色体易位t(15;17),是APL特有的遗传学标志,t(15;17)染色体易位使17号染色体上的维甲酸受体α(RARα)基因发生断裂,与15号染色体上的早幼粒细胞白血病(PML)基因发生融合,形成PML-RARα融合基因.
5)急性粒-单核细胞白血病(M4)
①血象 血红蛋白和红细胞数为中度到重度减少,白细胞数可增高,正常或减少,可见粒及单核两系早期细胞,原单核和幼单核细胞有时可达30%～40%,且有较活跃的吞噬现象,而粒系早幼粒细胞以下各阶段均易见到.血小板呈重度减少.
②骨髓象 骨髓增生极度活跃或明显活跃,粒,单核两系同时增生,红系,巨核系受抑制.本病是一组异质性很强的疾病,至少包括两种类型:Ⅰ.异质性白血病细胞增生型:白血病细胞分别具有粒系,单核系形态学特征;Ⅱ.同质性白血病细胞增生型:白血病细胞同时具有粒系及单核系特征.此型部分细胞可见到Auer小体,浆细胞常增多.
原粒单和幼粒单核细胞的特征为核染色质细网状,核圆,易见凹陷,扭曲,折叠及分叶,核仁较明显,胞质丰富,呈浅蓝色或蓝灰色,有的可见大小不一的嗜苯胺蓝颗粒,部分可见特异性中性颗粒,成熟粒单细胞在形态上类似正常成熟单核细胞,但胞质内可见中性颗粒.
③细胞化学染色
Ⅰ.POX,SB染色:原单及幼单细胞呈阳性或弱阳性反应;而幼粒细胞呈阳性或强阳性反应.
Ⅱ.非特异性酯酶染色:应用α-醋酸萘酚为底物进行染色,原始和幼稚细胞呈阳性反应,其中原粒细胞不被氟化钠(NaF)抑制,而原单细胞可被NaF抑制.
Ⅲ.酯酶双重染色:可呈现醋酸萘酚酯酶阳性细胞,氯醋酸酶阳性细胞或双酯酶阳性细胞.
④免疫学检验 白血病细胞主要表达粒,单系抗原CD13,CD14,CD15,CD33,HLA-DR.
⑤遗传学及分子生物学检验 常累及11号染色体长臂的异常,包括缺失和易位,后者尤以t(9;11)(p21;q23)为多见.M4E0常有非随机16号染色体异常,主要表现为inv(16),del(16)和t(16;16)三种类型,伴inv(16)的M4E0患者CR率较高.
6)急性单核细胞白血病(M5)
①血象 血红蛋白和红细胞数中度到重度减少,大多数患者白细胞数偏低,分类可出现原单和幼单核细胞增多,血小板明显减少.
②骨髓象 骨髓增生极度活跃或明显活跃,原单加幼单细胞≥30%.M5a以原始单核细胞为主,≥80%;M5b骨髓中原始和幼稚单核细胞(非红系细胞)>30%,原始单核细胞30%,或见到巨大原始巨核细胞及小巨核细胞,小巨核细胞体积小,多数直径约10μm,少数达20μm,胞体圆形,边缘不整齐,呈云雾状或毛刺状,胞质蓝色不透明,着色不均,周围可有伪足样突起,核染色质较粗,偶见蓝染小核仁,幼稚巨核细胞也增多.巨核细胞分裂象多见,成熟巨核细胞少见.
③细胞化学染色 PAS阳性,呈大小,粗细不等的阳性颗粒,ANAE阳性,并可被氟化钠抑制,MPO及SBB染色阴性.
④免疫学检查 原始细胞上有vWF(von Willebrand factor)抗原和Ⅰb,Ⅱb/Ⅲa,Ⅲa糖蛋白.
⑤遗传学检验 染色体有inv(3)或del (3),+8,+21异常.
本型白血病因骨髓中常有纤维组织增生,故穿刺时往往干抽,须作骨髓活检,可发现原始和巨核细胞增多,网状纤维增加.
(5)急性淋巴细胞白血病
急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia,ALL) 是由于原始和幼稚淋巴细胞在造血组织中无限增殖所致的恶性血液病.本病可发生于任何年龄,以儿童及青壮年多见.其临床特征除有急性白血病的表现外,还易并发中枢神经系统白血病,尤其在完全缓解期发病率高.睾丸白血病及高尿酸血症并发率也高.
1)血象 多数病例白细胞总数增多,少数患者白细胞数可正常或减少,分类中原始及幼稚淋巴细胞增多,破碎细胞易见,中性粒细胞减少或缺如.大多数患者有不同程度的红细胞数和血红蛋白量的减少,常为正细胞正色素性贫血.血片中偶见红细胞大小不等,嗜碱性点彩或呈多染性,可见到少数幼红细胞.血小板常减少,约半数病例30%,常伴有形态异常,成熟淋巴细胞较少见.粒细胞系,红细胞系增生受抑,巨核细胞系显著减少或不见.根据其形态
学特征将ALL分为L1,L2和L3三个亚型.
3)细胞化学染色 主要用于协助形态学鉴别各类白血病,常用的白血病细胞化学染色反应见表9-3.
表9-3 急性白血病常用的细胞化学反应鉴别
急性淋巴细胞白血病
急性粒细胞白血病
急性单核细胞白血病
过氧化物酶(POX)
(-)
分化差的原始细胞
(-)～(+)
分化好的原始细胞
(+)～(+++)
(-)～(+)
糖原染色(PAS)
(+)成块或颗粒状
(-)或(+),弥漫性淡红色
(-)或(+)呈弥漫性淡红色或颗粒状
非特异性酯酶(NSE)
(-)
(-)～(+)NaF抑制不敏感
(+)能被NaF抑制
中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)
增加
减少或(-)
正常或增加
4)免疫学标志 急性淋巴细胞白血病的免疫标志检测临床应用较多,常用一线单克隆抗体诊断T或B系急淋与AML,再用二线单克隆抗体确定ALL各亚型.
5)染色体及分子生物学检验 大约有70%～90%的急淋有克隆性核型异常,其中60%以上为特异性基因重排,染色体的改变包括染色体数目异常和结构异常.
2. MDS,CML,MM,MH等恶性血液病的细胞形态学特点与诊断
(1)MDS
1)概念 骨髓增生异常综合征(myelodysplastic symdrome,MDS)是一种造血干细胞克隆性疾病,骨髓出现病态造血,外周血血细胞减少.
2)分类
①FAB协作组分类 根据骨髓中原始细胞的多少及外周血中原始细胞的有无将MDS分为5个类型,即难治性贫血(refractory anemia,RA);环形铁粒幼细胞难治性贫血(refractory anemia with ringed sidero blast,RARS);原始细胞过多难治性贫血(refractory anemia with excess blasts,RAEB);转化中的原始细胞过多难治性贫血(RAEB in transformation,RAEB-T);慢粒-单核细胞白血病(chronic myelomonocytic leukemia,CMML).
②WHO的分类 2000年世界卫生组织(world health organization,WHO)对原有的FAB分类作了修订,见表9-4.
表9-4 WHO对MDS的分类及其标准
类型
外周血
骨髓
难治性贫血
贫血
无原始细胞或罕见
仅有红系发育异常
原始细胞<5%,环状铁粒幼细胞<15%
难治性贫血
伴环状铁粒幼细胞(RARS)
贫血
无原始细胞
仅有红系发育异常
原始细胞<5%,环状铁粒幼细胞≥15%
难治性血细胞减少症
伴有多系发育异常
(RCMD)
血细胞减少(两系减少或全血细胞减少)
无原始细胞或罕见
无Auer小体
单核细胞<1×109/L
髓系中≥2个细胞系中发育异常的细胞≥10%
原始细胞<5%
无Auer小体
环状铁粒幼细胞<15%
难治性血细胞减少症
伴有多系发育异常和环状铁粒幼细胞(RCMD-RS)
血细胞减少(两系减少或全血细胞减少)
无原始细胞或罕见
无Auer小体
单核细胞<1×109/L
髓系中≥2个细胞系中发育异常的细胞≥10%
原始细胞<5%
无Auer小体
环状铁粒幼细胞≥15%
难治性贫血
伴原始细胞增多-1
(RAEB-1)
血细胞减少
原始细胞<5%
无Auer小体
单核细胞<1×109/L
1系或多系发育异常
原始细胞5%～9%
无Auer小体
难治性贫血
伴原始细胞增多-2
(RAEB-2)
血细胞减少
原始细胞5%～9%
有或无Auer小体
单核细胞<1×109/L
1系或多系发育异常
原始细胞10%～19%
有或无Auer小体
MDS,不能分类
(MDS-u)
血细胞减少
无原始细胞或罕见
无Auer小体
粒系或巨核细胞系1系发育异常
原始细胞<5
无Auer小体
MDS伴单纯del(5q)
贫血
原始细胞<5
血小板计数正常或增高
巨核细胞数正常或增加伴有核分叶减少
原始细胞90%,出现大量未成熟粒细胞,以中性中幼粒及晚幼粒细胞增多尤为突出,杆状和分叶核粒细胞也增高,尤其是嗜碱性粒细胞可高达10%～20%,是慢粒的特征之一,有助于其诊断且是与其它粒细胞增多的疾病相鉴别依据之一.淋巴细胞和单核细胞的比率减少,少数患者单核细胞也增高.随着病期进展,原始粒细胞可增多,加速期可>10%,急变期可>20%.
Ⅱ)红细胞和血红蛋白 在疾病早期,红细胞数正常或增多,以后逐渐出现贫血,一般为正常细胞性贫血,可有红细胞大小不均和异形,嗜多色性或点彩红细胞和有核红细胞.
Ⅲ)血小板 初诊断病例血小板正常或增多,有时可高达1000×109/L,加速期及急变期,血小板可减少.血小板形态可发生变异,偶见巨核细胞碎片或裸核.
Ⅱ.骨髓象 骨髓有核细胞增生明显至极度活跃,以粒细胞为主,红系细胞相对减少或受抑制,粒,红比值可高达10～50:1.主要是中性中幼,晚幼及杆状核粒细胞明显增多(原始粒细胞<10%,嗜酸,嗜碱性粒细胞增多.巨核细胞正常或增多,晚期减少.
本病的晚期可发生急性变(慢粒急变),又称原始细胞危象(blast crisis).大多数病例发展为急粒变,约占50%～60%,其次为急淋变,约20%～30%,少数患者可急变为单核细胞,红细胞,巨核细胞等类型急性白血病.此时的骨髓象特点为原始细胞明显增高,因慢粒急变时可发展成为任何类型急性白血病,故骨髓中原粒细胞(Ⅰ型+Ⅱ型)或原淋+幼淋,或原单+幼单等相应类型的原始和幼稚细胞增高,≥30%,嗜碱性粒细胞增高,红系,巨核系细胞均受抑制或减少.
骨髓活检病理切片见骨髓组织几乎完全为白血病细胞所浸润,而无脂肪组织.在疾病后期,部分病例出现局灶性骨髓纤维化.
Ⅲ.细胞化学染色 NAP阳性率及积分明显减低,甚至为0分.慢粒合并感染,妊娠及急变期,NAP积分可升高.治疗获得完全缓解时,若NAP活力恢复正常,提示预后较好.
Ⅳ.免疫学标志 慢粒急变后免疫标志表达较复杂,慢粒髓细胞变多表现CD33,CD13,CD15,CD14及HLA-DR阳性;淋巴细胞变有CD3,CD7,CD2,CD5,CD10,CD19,CD20,CD22及HLA-DR阳性;巨核细胞变可出现CD41a,CD41b及PPO阳性.
Ⅴ.血液生化 血清及尿中尿酸浓度增高,血清钾亦增高,主要是化疗后大量白细胞破坏所致.血清维生素B12浓度及其结合力显著增加,且与白血病细胞增多程度呈正比.血清乳酸脱氢酶,溶菌酶亦增高.
Ⅵ.染色体及分子生物学检验 细胞遗传学的发展,90%以上的慢性粒细胞白血病患者的血细胞中出现Ph染色体.1973年Rowley证实Ph染色体系第9号与22号染色体长臂末端相互易位后所形成.Ph染色体不仅出现于粒细胞,也出现于幼红细胞,幼稚单核细胞,巨核细胞及B细胞,少部分急性淋巴细胞白血病患者中也可出现,这表明本病的病变起源于多能干细胞,是干细胞克隆发生突变和肿瘤转化所致.
②诊断
根据CML的临床表现特征,血象,骨髓象,染色体核型分型及分子生物学技术对此病进行诊断与分期,具体标准见表9-5.本病主要与类白血病反应,骨髓纤维化,血吸虫病等疾病进行鉴别.
表9-5 慢性粒细胞白血病的诊断与临床分期标准
分期
诊 断 标 准
慢性期
具下列四项者诊断成立:
(1)贫血或脾大
(2)外周血白细胞≥30×109/L,粒系核左移,原始细胞(Ⅰ型+Ⅱ型)10%
(5)外周血嗜碱粒细胞>20%
(6)骨髓中有显著的胶原纤维增生
(7)出现Ph以外的其他染色体异常
(8)对传统的抗慢粒药物治疗无效
(9)CFU-GM增殖和分化缺陷,集簇增多,集簇和集落的比值增高
急变期
具下列之一者可诊断为本期:
(1)原始细胞(Ⅰ型+Ⅱ型)或原淋+幼淋,或原单+幼单在外周血或骨髓中≥20%
(2)外周血中原始粒+早幼粒细胞≥30%
(3)骨髓中原始粒+早幼粒细胞≥50%
(4)有髓外原始细胞浸润
此期临床症状,体征比加速期更恶化,CFU-GM培养呈小簇生长或不生长
2)真性红细胞增多症
①概念 真性红细胞增多症(polycythemia vera, PV)是一种原因未明的以红细胞异常增生为主的慢性骨髓增殖性疾病.
②诊断 目前国内诊断PV的标准如下.
Ⅰ.临床表现
Ⅰ)皮肤,黏膜呈绛红色,尤以两颊,口唇,眼结合膜,手掌等处为著;
Ⅱ)脾大;
Ⅲ)高血压或病程中有血栓史.
Ⅱ.实验室检查
Ⅰ)血红蛋白及红细胞计数增加(男性血红蛋白>180g/L,红细胞>6.5×1012/L,女性血红蛋白>170g/L,红细胞>6.0×1012/L);
Ⅱ)血细胞容量绝对值增加,51Cr标记法红细胞容量男性39ml/Kg,女性>27 ml/Kg;
Ⅲ)红细胞比容增高,男性≥0.54,女性≥0.50;
Ⅳ)无感染及其他原因引起白细胞计数多次>11.0×109/L;
Ⅴ)血小板计数多次>300.0×109/L;
Ⅵ)外周血中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)积分>100;
Ⅶ)骨髓象示增生明显活跃或活跃,粒,红与巨核细胞系均增生,尤以红系细胞为显著.
Ⅲ.能除外继发性红细胞增多症.
Ⅳ.能除外相对性红细胞增多症.
诊断真性红细胞增多症可有A,B两种方法,最好采用A法,确无条件测红细胞容量时,则采用B法.
A法:具有Ⅰ类中任何两项,加Ⅱ类中第Ⅰ)及第Ⅱ)项,再加Ⅲ类即可诊断本病.
B法:具有Ⅰ类中第Ⅰ)及第Ⅱ)项加Ⅱ类中第Ⅰ)项(标准改为男性多次血红蛋白≥200g/L,女性≥190g/L).此外,尚需具备第Ⅲ)项至第Ⅶ)项中任何四项,再加上Ⅲ类及Ⅳ类方可诊断本病.
3)原发性血小板增多症
①概念 原发性血小板增多症(essential thrombocythemia,ET)是一种原因不明的以巨核细胞异常增生,血小板持续增多为特征的骨髓增殖性疾病.
②诊断 诊断本病的基本条件是血小板计数增高,但须除外其他引起血小板增多的疾病,即可诊断本病,具体诊断标准如下.
Ⅰ.临床上可有出血,脾脏肿大,血栓形成引起的症状和体征.
Ⅱ.实验室检查符合:Ⅰ)血小板计数>1000×109/L;Ⅱ)血片中血小板成堆,有巨大血小板;Ⅲ)骨髓增生活跃或以上,或巨核细胞增多,体大,胞浆丰富;Ⅳ)白细胞计数和中性粒细胞增加;Ⅴ)血小板肾上腺素聚集反应可减低.
继发性血小板增多症是继发于多种疾病的反应性血小板增生性疾病,
临床上较为常见.
4)骨髓纤维化
①概念 骨髓纤维化(myelofibrosis,MF)是指骨髓造血组织被纤维组织所代替,而影响造血功能所产生的病理状态.
②诊断 目前国内诊断MF的标准如下:Ⅰ)脾明显肿大;Ⅱ)外周血象出现幼稚粒细胞和/或有核红细胞,有数量不一的泪滴状红细胞,病程中可有红细胞,白细胞及血小板的增多或减少;Ⅲ)骨髓穿刺多次\"干抽\"或呈\"增生低下\";Ⅳ)脾,肝,淋巴结病理检查示有造血灶;Ⅴ)骨髓活检病理切片显示纤维组织明显增生.上述第Ⅴ)项为必备条件,加其他任何两项,并能排除继发性MF及急性MF者,可诊断为慢性MF.
(3)多发性骨髓瘤
1)概念 多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是骨髓内单一浆细胞株异常增生的一种恶性肿瘤,属于成熟B细胞肿瘤.
2)骨髓象特点 骨髓有核细胞多呈增生活跃或明显活跃,浆细胞异常增生,并有质的异常.当浆细胞在10%以上,并伴有形态异常,应考虑骨髓瘤可能.瘤细胞在骨髓内可呈弥漫性分布,也可呈灶性,斑片状分布,故有时需多部位穿刺才能诊断.骨髓活检可提高检出率.瘤细胞的大小,形态和成熟程度有明显的异常,其形态特点与分型如下.
①形态特点 瘤细胞与浆细胞极为相似,但前者有下列特征:Ⅰ)瘤细胞大小不一,一般较大,形态呈明显的多变性,多呈堆集分布;Ⅱ)瘤细胞呈圆形,椭圆形或不规则形,胞核长圆形,偏位,核染色质疏松,排列紊乱,可有1～2个大而清楚的核仁;Ⅲ)胞质较为丰富呈中等量,染嗜碱性深蓝色,或呈火焰状不透明,常含有少量天青胺蓝颗粒和空泡;Ⅳ)有些瘤细胞含红色粗大的包涵体(Russel小体),大量空泡(桑椹细胞)及排列似葡萄状的浅蓝色空泡(葡萄状细胞);Ⅴ)骨髓瘤细胞过氧化物酶染色呈阴性反应.
②分型 1957年欧洲血液学会议将瘤细胞分为四型:Ⅰ)Ⅰ型 小浆细胞型 细胞较成熟,染色质致密,核偏位,胞质较丰富,此型分化良好的形态与正常成熟浆细胞相似;Ⅱ)Ⅱ型 幼稚浆细胞型 胞核染色质较疏松,细胞外形尚规整,核偏位,核/质比例1:1;Ⅲ)Ⅲ型 原始浆细胞型 核染色质疏松,如网状细胞,核可居中,有核仁,核/质比例显示核占优势;Ⅳ)Ⅳ型 网状细胞型 细胞形态非常多样化,核仁较大,较多,细胞分化不良者,则恶性程度高.
3)诊断 对本病的诊断,主要根据以下标准.
①骨髓中浆细胞>15%,并有异常浆细胞(骨髓瘤细胞)或组织活检证实为浆细胞瘤.
②血清中出现大量单克隆免疫球蛋白(M蛋白):IgG>35g/L;IgA>20g/L;IgD>2.0g/L;IgE>2.0g/L;IgM>15g/L或尿中单克隆免疫球蛋白轻链(本-周蛋白)>1.0g/24小时.少数病例可出现双克隆或三克隆性.
③无其他原因的溶骨病变或广泛性骨质疏松.
诊断IgM型MM时,除符合①项和②项外,尚须具备典型的MM临床表现和多部位溶骨病变.只有①和③项者属不分泌型MM,对仅有①和②项者(尤其骨髓中无原,幼浆细胞者),须除外反应性浆细胞增多和意义未明单克隆免疫球蛋白(MGUS).
(4)淋巴瘤
1)概念 淋巴瘤(lymphoma)是一组起源于淋巴结或其它淋巴组织的恶性肿瘤.
2)霍奇金病
①分类 恶性淋巴瘤的分类较为复杂,霍奇金病目前普遍采用1965年Rye会议的分类方法,表9-6.我国患者中混合细胞型最为常见,结节硬化型次之,其他各型较少见.
表9-6 霍奇金病组织学分型(Rye会议,1965)
类型
病理组织学特点
临床特点
1.淋巴细胞为主型
结节性浸润,主要为中小淋巴细胞,R-S细胞少见
病变局限,预后较好
2.结节硬化型
交织的胶原纤维,将浸润细胞分隔成明显结节,R-S细胞较大,呈腔隙型.淋巴细胞,浆细胞,中性及嗜酸性粒细胞多见
年轻发病,诊断时多为Ⅰ,Ⅱ期,预后相对较好
3.混合细胞型
纤维化伴局限性坏死,浸润细胞明显多形性,伴血管增生和纤维化.淋巴细胞,浆细胞,中性及嗜酸性粒细胞与较多的R-S细胞混同存在
有播散倾向,预后相对较差
4.淋巴细胞消减型
主要为组织细胞浸润,弥性纤维化及坏死,R-S细胞数量不等,多形性
多为老年,诊断时已达Ⅲ,Ⅳ期,预后极差
②分期 目前淋巴瘤的分期仍采用1971年Ann Arbor会议制定的分期法,此种方法主要运用HD,并于1989年在英国Colswolds召开会议上对原分期作了修改和补充,见表9-7.
表9-7 恶性淋巴瘤的分期(colswolds会议,1989)
分期
侵 犯 范 围
Ⅰ期
病变侵犯一个淋巴结区(Ⅰ)或一个淋巴组织(如脾,胸腺,咽淋巴环或一个淋巴结外部位ⅠE)
Ⅱ期
病变侵犯横膈同侧的2个或更多的淋巴结区(Ⅱ),(纵隔是一个部位;肺门淋巴结双侧受侵是2个部位),侵犯的解剖部位数目应标明(如Ⅱ2)
Ⅲ期
病变侵犯横膈两侧的淋巴结区,Ⅲ1:伴有或不伴有脾门,腹腔或门脉区淋巴结受浸;Ⅲ2:
伴有主动脉旁,髂窝,肠系膜淋巴结受侵
Ⅳ期
侵犯淋巴结(脾)以外的器官
A:无症状
B:发热,盗汗,体重减轻(6个月内下降10%以上)
X:巨块病变,纵隔肿物最大横径>胸廓内径1/3,淋巴结肿块最大直径>10cm
CS:临床分期 PS:病理分型
E:局限性孤立的结外病变,不包括肝和骨髓只有一个部位的病变(ⅠE),侵犯邻近的淋巴结
(ⅡE或ⅢE)
③诊断 本病的确诊依靠病理组织学检查.
3)非霍奇金淋巴瘤
①我国NHL工作分类 非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma,NHL)是恶性淋巴瘤的另一种类型.它包括多种形态,免疫表型,生物学规律.发展速度和治疗反应各不相同的类型.NHL分类甚为复杂,病理分类以1982年美国国立癌症研究所制定的\"国际工作分类\"(IWF)为基础,再加以免疫分型.我国目前采用的是1985年成都会议上拟定的NHL工作分类,表9-8.临床分期参照HD的分期方法.
表9-8 我国NHL工作分类方案(成都,1985)
低度恶性
中度恶性
高度恶性
1.小淋巴细胞性
2.淋巴浆细胞性
3.裂细胞性(滤泡型)
4.裂细胞性(弥漫型)
5.裂-无裂细胞性(滤泡型)
6.裂-无裂细胞性(弥漫型)
7.无裂细胞性(滤泡型)
8.无裂细胞性(弥漫型)
9.Burkitt淋巴瘤
10.免疫母细胞性
11.髓外浆细胞瘤(分化好)
12.髓外浆细胞瘤(分化差)
13.蕈样肉芽肿-Sezary综合征
14.透明细胞性
15.多形细胞性
16.淋巴母细胞性
17.组织细胞性
18.不能分类
②WHO 2000年对淋巴系统肿瘤分类 关于淋巴瘤的分类,WHO提出了新的分类方案,见表9-9.
表9-9 WHO 2000年对淋巴系统肿瘤新的分类
B细胞肿瘤
前B细胞肿瘤
成熟(外周)B细胞肿瘤
T和NK细胞肿瘤
前T细胞肿瘤
成熟(外周)T细胞肿瘤
霍奇金淋巴瘤
前B淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤(B-ALL)
慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤(B-CLL/SLL)
B细胞前淋巴细胞性白血病(B-PLL)
淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL)
脾边缘区B细胞淋巴瘤(±绒毛状淋巴细胞,SMZL)
毛细胞白血病(HCL)
浆细胞骨髓瘤/浆细胞瘤(PCM/PCL)
MALT型结外边缘区B细胞淋巴瘤(MALT-MZL)
淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤(±单核样B细胞瘤,MZL)
滤泡性淋巴瘤(FL)(分级Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ)
套细胞淋巴瘤(MCL)
弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBLc)
伯基特淋巴瘤/伯基特细胞白血病(BL/BCL)
前T淋巴母细胞淋巴瘤/白血病(T-LBL/ALL)
(前T急性淋巴母细胞性白血病,PTALL)
T细胞慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤(T-CLL/SLL)
T细胞前淋巴细胞性白血病(T-PLL)
T细胞颗粒淋巴细胞性白血病(T-LGL)
侵袭性NK细胞白血病(ANKCL)
成人T细胞淋巴瘤/白血病(ATCL/L)
结外NK/T细胞淋巴瘤,鼻型(NK/TCL)
肠病样T细胞淋巴瘤(ITCL)
肝脾γδT细胞淋巴瘤
皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤
蕈样霉菌病/Sezary综合征
间变性大细胞淋巴瘤(ALCL),T/裸细胞,原发皮肤型
外周T细胞淋巴瘤,无其他特征(PTCL)
血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤(AITCL)
间变性大细胞淋巴瘤(ALCL),T/裸细胞,原发全身型
A 结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤(NLPHL)
B 经典型霍奇金淋巴瘤
结节硬化型霍奇金淋巴瘤(NSHL)(1级和2级)
富含淋巴细胞的经典型霍奇金淋巴瘤(LRHL)
混合细胞型霍奇金淋巴瘤(MCHL)
淋巴细胞消减型霍奇金淋巴瘤(LDHL)
③诊断 病理组织学检查系确诊本病的依据.其特点为淋巴结正常结构消失,为肿瘤组织所取代;恶性增生的淋巴细胞形态呈异形性,无Reed-sternberg细胞;淋巴包膜被侵犯.
(5)慢性淋巴细胞性白血病
1)概念 慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia ,CLL)是一种恶性淋巴细胞增殖性疾病,以小淋巴细胞在血液,骨髓和淋巴组织中不断聚集为主要表现.
2)诊断 外周血淋巴细胞持续增高≥3个月,其淋巴细胞比例≥50%,绝对值≥5×109/L,骨髓中淋巴细胞≥40%,以成熟淋巴细胞为主,并排除病毒感染,结核,伤寒,传染性单核细胞增多症等其他引起淋巴细胞增多性疾病者,且在较长期连续观察下,仍无下降,结合临床,血象,骨髓象和免疫表型及遗传学改变,可诊断.
(6)恶性组织细胞病
1)概念 恶性组织细胞病(malignant histiocytosis,MH,简称恶组)是单核-吞噬细胞系统的恶性增生性疾病.
2)骨髓象 骨髓涂片中大多数仍可见各系正常造血细胞.其中可见到形态异常的组织细胞,这是本病最重要的特征.这类细胞呈多少不一的散在或成堆分布,由于病变分布不均,故多次多部位骨髓穿刺可提高阳性检出率.
根据恶性组织细胞形态学特征,可有以下五型,.
①异常组织细胞:细胞大小不等,形态畸异.核圆形,椭圆形,或不规则形,有时呈分支状,偶有双核者.染色质呈细致网状,核仁显隐不一,有的较大.胞浆较丰富,着色深蓝或浅蓝,深蓝者常无颗粒,浅蓝者可有数目不等的小颗粒,并可出现空泡.
②多核巨细胞 这类细胞与异常组织细胞基本相似,其不同点是体积巨大,直径50～95μm,外形极不规则.含有多个核或呈分叶状,核仁显隐不一,胞质浅蓝,无颗粒或有少数颗粒.
③淋巴样组织细胞 大小及外形类似淋巴细胞或内皮细胞.细胞呈椭圆形,圆形,不规则形或窄长弯曲如拖尾状.胞核常偏于一侧,染色质较细致,偶见核仁,胞质浅蓝色,有时可含细小颗粒.
④单核样组织细胞 形似单核细胞,但核染色质较粗或着色较深,胞质浅蓝色,有时含细小颗粒.
⑤吞噬性组织细胞 胞体很大,单个核或双核,核圆形或椭圆形,偏位,染色质疏松,核仁大而清晰.胞质中含有被吞噬的成熟红细胞,幼稚红细胞,血小板,中性粒细胞及血细胞残片,被吞噬红细胞可达20余个.
3)诊断
①临床表现 长期发热,以高热为主,伴进行性全身衰竭,淋巴结,脾,肝进行性肿大,还可有黄疸,出血,皮肤损害和浆膜腔积液等,病情凶险,预后不良.
②实验室检查
Ⅰ.全血细胞进行性减少,血片中可有少量异常组织细胞和有核红细胞;
Ⅱ.骨髓涂片发现数量不等的多种形态的不正常组织细胞,异常组织细胞及/或多核巨组织细胞是诊断本病的细胞学主要依据.
③骨髓或肝,脾,淋巴结及其他受累组织的病理切片中可见各种异常组织细胞浸润,这些细胞呈多样性,混杂存在,成灶性或片状,松散分布,极少形成团块,组织结构可部分或全部破坏.
凡具有上①加②或①加③,且能排除反应性组织细胞增多症者可诊断本病.
(7)其它少见的恶性血液病
1)急性混合型细胞白血病 急性混合型细胞白血病(acute mixed-linage leukemia,AMLL)是髓细胞和淋巴细胞系共同累及的具有独特的临床生物学持征的一类白血病,又名急性杂合性白血病(hybrid acute leukemia).
2)嗜酸性粒细胞白血病 嗜酸性粒细胞白血病(eosinophilic leukemia)是一种罕见的白血病,以嗜酸粒细胞恶性克隆性增生为特征.
3)嗜碱性粒细胞白血病 嗜碱性粒细胞白血病(basophilic leukemia)是一种罕见类型白血病,大多数病人来自慢性粒细胞白血病进展期,可有Ph染色体,t(9;22)(q34;q11)似慢粒急变期,为慢粒急变型.
4)浆细胞白血病 浆细胞白血病(plasma cell leukemia,PCL)是少见类型的白血病之一.临床上分为原发性浆细胞白血病和继发性浆细胞白血病.原发性浆细胞白血病是一种独立细胞类型的白血病,其特征为异常白细胞广泛浸润,可遍及全身各组织,并常伴有出血和淀粉样变,引起脏器肿大或功能障碍,临床表现有贫血,高热,皮肤及黏膜出血,多脏器浸润,肝,脾肿大,若病变侵犯胸膜,可有胸水,胸水内可见大量浆细胞,若侵犯心脏可发生心律紊乱,心力衰竭等.继发性浆细胞白血病主要来自多发性骨髓瘤,慢性淋巴细胞白血病,巨球蛋白血症等,其白血病病理改变和临床表现与原发性浆细胞白血病基本相似.
5)原发性巨球蛋白血症 原发性巨球蛋白血症(primary macroglobulinemia)是B淋巴细胞恶性增生性疾病,恶变细胞合成并分泌大量单克隆免疫球蛋白,血中IgM增高为特征的一种疾病.1944年Jan Waden strom首先描述本病特征,故称Waldenstrom巨球蛋白血病(WM).
6)重链病 重链病(heavy chain disease)是恶性浆细胞病的一种,其特征是产生球蛋白的B细胞-浆细胞恶性增生伴有单克隆不完整(仅有重链而无轻链)免疫球蛋白合成与分泌.
7)多毛细胞白血病 多毛细胞白血病(hairy cell leukemia,HCL)是一种慢性淋巴组织增殖性疾病,来源于B细胞系.
8)幼淋巴细胞白血病 幼淋巴细胞白血病(prolymphocytic leukemia,PLL)是一种特殊类型的淋巴细胞白血病,临床上很少见,其发病率约为CLL的10%,大部分的幼稚淋巴细胞来源于B细胞.
9)成人T细胞白血病 成人T细胞白血病(adult T-cell leukemia,ATL)是一种少见的特殊类型的T细胞受累的淋巴细胞白血病.本病有明显地区性,主要在日本西南部,加勒比海地区和非洲中部三大地区流行,我国于1985年首次报道在福建沿海地区流行.本病好发于成年人,以中,老年为主,男性多于女性.
第十章 非恶性白细胞疾病的检查
1.白细胞减少与粒细胞缺乏症
(1)白细胞减少症和粒细胞缺乏症的概念:白细胞减少症是由各种病因引起的外周血白细胞持续低于对应参考值(成人白细胞数低于4.0×109/L,小于10岁的儿童白细胞数低于5.0×109/L)的一组综合征.当中性粒细胞低于2.0×109/L时为粒细胞减少症;低于0.5×109/L时为粒细胞缺乏症.引起粒细胞减少的的病因和发病机制主要为:粒细胞的增殖或成熟障碍;粒细胞破坏和消耗过多以及粒细胞分布异常所至的假性粒细胞减少.
(2)白细胞减少症和粒细胞缺乏症的血象和骨髓象特征:白细胞减少症外周血白细胞计数小于4.0×109/L,粒细胞减少症时中性粒细胞绝对值小于2.0×109/L.同时,淋巴细胞相对增多,有时单核细胞也相对增多.粒细胞缺乏症时,粒细胞绝对值低于0.5×109/L.在粒细胞明显减低或缺乏时,粒细胞可出现中毒颗粒,空泡及细胞核固缩等形态学改变.而红细胞和血小板的数量和形态多正常.骨髓象中有核细胞多增生活跃,但粒细胞系细胞增生不良或成熟障碍,粒细胞数量明显减少,可见原粒及早幼粒细胞,缺乏成熟阶段的粒细胞,幼粒细胞可伴退行性变.红细胞系及巨核细胞系多正常.淋巴细胞,浆细胞可相对增加.
(3)白细胞减少症和粒细胞缺乏症的实验室诊断:白细胞减少症的诊断标准为外周血白细胞持续低于对应参考值低限时为白细胞减少症,成人白细胞数低于4.0×109/L,≥10岁的儿童白细胞数低于4.5×109/L,50×109/L 中幼粒,早幼粒甚至 各种感染,恶性肿瘤
原始细胞出现 严重外伤等
淋巴细胞型 常(20-30)×109/L 淋巴细胞>40% 某此病毒感染,
可见幼稚淋巴细胞和 粟粒性结核,猩红
异型淋巴细胞 热,胃癌等
嗜酸性粒细胞型 >20×109/L 嗜酸性粒细胞>20% 寄生虫病,过敏性疾
病,风湿病等
单核细胞型 常>30×109/L 单核细胞>30% 粟粒性结核,感染性
偶见幼单核细胞 心内膜炎,细菌性痢
疾,斑疹伤寒等
(2) 类白血病反应的实验室检查:①血象:白细胞常显著增多,但一般不超过120×109/L,不同类型的白细胞出现数量异常及形态异常(中毒颗粒,空泡,核固缩).红细胞和血小板无明显变化.②骨髓象:类白血病反应骨髓象改变不大,可与白血病进行行鉴别.③其他检查:可通过中性粒细胞碱性磷酸酶活性和积分(明显增高),Ph染色体(阴性)以及组织活检等检查排除白血病.
【本章节要点】掌握类白血病反应的特点对疾病进行诊断,并注意排除白血病及骨髓增生异常综合征.白血病及骨髓增生异常综合征除外白细胞系的改变外红细胞系和/或巨核细胞系常有异常.且通过细胞化学染色和染色体的检查可进一步进行鉴别.
3.传染性单核细胞增多症
(1)传染性单核细胞增多症的概念:传染性单核细胞增多症(传单)是一种由EB病毒引起的急性或亚急性的淋巴细胞增生性疾病.其典型的临床表现为不规则发热,咽峡炎和淋巴结肿大.
(2)传染性单核细胞增多症的实验室检查:传染性单核细胞增多症的血象检测是本病的初筛实验和诊断标准之一,而血清学检查是疾病的特异性诊断指标,骨髓象检查主要用于鉴别诊断.
血象中白细胞多增多或正常,淋巴细胞比例增高,异型淋巴细胞超过10%.异型淋巴细胞主要为T细胞,少数为B细胞,Downey将其分为三型:泡沫型或浆细胞型,不规则型号或单核细胞型,幼稚型或幼淋巴细胞样型.
骨髓象淋巴细胞增多或正常,可见异型淋巴细胞但不及外周血多,组织细胞可增生.骨髓象检测不作为诊断的标准,主要用于疾病的鉴别.
血清学检查应用嗜异性凝集实验检测传染性单核细胞增多症患者血清中存在的嗜异性抗体(该抗体属于IgM,能使绵羊和马红细胞凝集,故称嗜异性凝集素),本实验检测患者血清中绵羊红细胞凝集的滴定度大于1:224.抗EB病毒抗体测定对诊断具有特异性.抗体的测定方法多为间接免疫荧光法.抗体的血清学变化见表10-2.可见发病早期检测抗病毒壳蛋白抗体(VCA),病程后期可检测抗EB核抗原(EBNA)抗体或抗早期抗原(EA)抗体.
表10-2 抗EB病毒抗体的血清学变化
状态 VCA-IgM VCA-IgG EA-IgG EBNA-IgG
从未感染 — — — —
无症状感染 + + +/- +
急性期 + ++ + —
恢复期 +/- + +/- +
4.朗罕细胞组织细胞增生症
(1)朗罕细胞组织细胞增生症的定义:朗罕细胞组织细胞增生症(LCH)是一组原因未明的组织细胞增生性疾病.其同共特点为病变组织中朗罕细胞(LC)病理性增生.X线检查多见溶骨性骨质破坏.
(2)朗罕细胞组织细胞增生症的实验室诊断:本病的实验室诊断依据为病理活检,免疫组织化学检查可作为确诊条件.本病患者的血象和骨髓象无特殊异常.以不同程度贫血多见,而骨髓象大多增生正常,仅在外周血象异常时再做骨髓象检查.
此症确诊的关键在于病理活检发现朗罕细胞的组织浸润.可做皮疹,淋巴结或病灶局部穿刺物或刮出物病理检查.为确诊朗罕细胞可作免疫组织化学染色,此类细胞且有Cdla的免疫表型且对S-100神经蛋白,ATP酶,α-D-甘露糖酶和花生凝集素可呈阳性反应.
5.类脂质沉积病
类脂质沉积病是一组较罕见的遗传性类脂代谢紊乱性疾病.由溶酶体中参与类脂代谢的酶缺乏引起,不同酶的缺乏导致鞘脂类不能分解而以各种神经酰胺衍生物沉积于全身各组织而引起各种疾病.较常见的有戈谢病和尼曼-匹克病.
(1)戈谢病的特点及实验室诊断:戈谢病又称为葡萄糖脑苷脂病,为β-葡萄糖苷脂酶活力明显降低,导致葡萄糖脑苷脂在单核-吞噬细胞内大量蓄积所引起的常染色体隐性遗传性疾病.所累的器官有脾,肝,骨髓及淋巴结.
戈谢病的实验室检查主要为骨髓涂片镜检及淋巴结,脾,肝穿刺或印片镜检可见数量不等的形态特殊的戈谢细胞.此类细胞体大,形态为卵圆形或不规则形;胞核较不偏位,1-3个或更多,染色质粗糙,偶见核仁;胞质丰富,含有大量与细胞长轴平行的粗暗条纹样结构,交织成网,如洋葱皮样或蜘蛛网状.戈谢细胞的糖原,酸性磷酸酶及苏丹黑B染色阳性或强阳性,过氧化物酶和碱性磷酸酶染色阴性.而β-葡萄糖脑苷脂酶的活性测定对诊断有决定性意义.
(2)尼曼-匹克病的特点及实验室诊断:尼曼-匹克病又称为鞘磷脂病,为组织中鞘磷脂酶明显缺乏所致单核-吞噬细胞系统和其他组织的细胞中鞘磷脂积聚的常染色体隐性遗传性疾病.
尼曼-匹克病的实验室诊断主要是骨髓,肝,脾和淋巴组织中可见成堆的尼曼-匹克细胞.此类细胞胞体大,圆形,椭圆形或三角形;核较小偏位,1-2个;胞质丰富,内有大量泡沫状的颗粒,故又称\"泡沫细胞\".尼曼-匹克细胞PAS染色空泡壁呈弱阳性,脂类染色阳性,酸性磷酸酶,碱性磷酸酶染色为阴性.
戈谢细胞与尼曼-匹克细胞的比较:
表10-3 戈谢细胞与尼曼-匹克细胞的区别
戈谢细胞 尼曼-匹克细胞
胞体 大,直径20-100μm 大,直径20-90μm
胞核 可多个,染色质较致密 常1个,染色质较疏松
胞质 丰富,呈洋葱皮样或网状 丰富,呈空泡状或泡沫状
含葡萄糖脑苷脂 含神经鞘磷脂
吞噬现象 有 无
细胞化学染色
糖原 强阳性 仅空泡壁呈弱阳性
酸性磷酸酶 强阳性 阴性
6.脾功能亢进
(1)脾功能亢进的概念:脾功能亢进是指原因不明或继发于不同疾病的脾肿大和血细胞减少的综合征.其临床特点为脾大,血细胞减少而骨髓造血细胞相应增生,脾切除后血象有好转或恢复正常.
(2)脾亢的诊断依据:经查体及影像学检查证实的脾肿大;外周血至少有一类细胞减少;骨髓增生活跃或明显活跃,可出现轻度造血细胞成熟障碍;脾切除后可使外周血接近或恢复正常;51Cr标记红细胞或血小板注入体内后,检测提示血细胞在脾内过度破坏或滞留.
第十一章 血栓与止血疾病的检查
1.血管性紫癜的概述和检验
血管性紫癜是指血管壁通透性或脆性增加所引起的紫癜,包括过敏性紫癜,单纯性紫癜,老年性紫癜,遗传性出血性毛细血管扩张症等.
(1)过敏性紫癜
[概述] 过敏性紫癜(allergic purpura,AP)是一种常见的血管变态反应性出血性疾病,本病又称出血性毛细血管中毒症或许蓝-享诺(Schonlein-Henoch)综合征.由于机体对某些致敏原引起速发型变态反应和抗原-抗体复合物反应,损害了小血管,引起广泛的毛细血管炎,甚至出现坏死性小动脉炎,使血管壁通透性和脆性增高,导致皮下组织,黏膜下组织及内脏器官出血,水肿.
本病的致敏原种类有细菌,病毒,寄生虫,高蛋白质的食物,药物,寒冷,花粉等.多见于儿童及青少年多见,春秋季发病居多.起病前1～3周常有上呼吸道感染史,临床表现随着病变的部位不同而异,最常见的首发症状为皮肤紫癜,有的以关节肿胀,疼痛或腹痛或肾炎为主要临床表现,因此临床上根据病变累及部位分为五型:单纯紫癜型,关节型,腹型,肾型,混合型(指存在前四型中的两型或二型以上).
[检验] 本病实验室检查可由以下方面的异常,但缺乏特异性.外周血白细胞数可增加,嗜酸性粒细胞增加;束臂试验阳性;血清IgA和IgG常增高;血管免疫荧光检查可见IgA 或C3沉积,此对确诊本病较有价值.
(2)其他血管性紫癜
1)单纯性紫癜
单纯性紫癜(purpra simplex) 多见于青春期女性,自诉常无受外伤情况下而在大腿,臀部及上臂出现大片瘀斑,压之不痛或隐痛,一般无黏膜出血.瘀斑常反复发作,不经治疗可自行消退,预后良好,一般认为与血管脆性增高有关.
2)老年性紫癜
老年性紫癜见于老年人,尤其是伴有营养不良者为多见.本病是由于血管脆性增加,胶原组织和脂肪组织萎缩,松弛所致.在无外伤的情况下出现瘀斑,多见于面部,前臂,手背等部位,特别在阳光爆晒下尤其易发,瘀斑吸收慢,且反复发作.
3)遗传性出血性毛细血管扩张症
[概述] 遗传性出血性毛细血管扩张症(hereditary hemorrhagic telangiectasia,HHT)是一种少见的常染色体显性遗传性疾病.主要病理缺陷是部分毛细血管壁中层缺乏弹力纤维及或平滑肌.本病的主要临床表现为上半身皮肤,颜面及唇,舌,口腔,齿龈,鼻腔等黏膜毛细血管扩张,呈红色或暗红色,压之退色;而且反复同一部位的出血,病情随年龄增加加重,幼年时多见鼻衄,齿龈出血,成年后有消化道,泌尿道,呼吸道出血.
[检验] 血液学检查无特异性异常.初期止血检查可异常(CFT阳性,甲皱毛细血管镜检查异常BT延长);病变部位组织病理学检查可见毛细血管壁缺乏弹力纤维和或平滑肌是确诊的佐证.
2.血小板减少症的概述和检验
血小板减少症是指血小板数量减少所引起的疾病,包括特发性血小板减少性紫癜,新生儿同种免疫性血小板减少性紫癜,输血后紫癜,血栓性血小板减少性紫癜-溶血性尿毒症综合症等.
(1)特发性血小板减少性紫癜
[概述] 特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP)是一种常见的疾病,由于存在抗血小板抗体导致血小板破坏增加,使血小板减少的疾病. 目前多数认为与自身免疫有关,所以又称为自身免疫性血小板减少性紫癜,以前由于病因不明称为原发性血小板减少性紫癜,少数病人合并自身免疫性溶血性贫血,即成为伊文氏综合征(Evans syndrome).
根据起病情况及病程长短分为急性型ITP和慢性型ITP.急性型ITP病因为风疹,水痘,麻疹,流行性腮腺炎,传染性单核细胞增多症等.
急性型多见于3～7岁婴幼儿,男女发病率相近.起病前l一3周常有呼吸道感染史,因此秋冬季发病最多.起病急骤,可有发热,皮肤紫癜,黏膜和内脏出血等,少数有颅内出血,脾脏常不肿大.病程多为自限性,多数在半年内自愈,少数迁延而转为慢性.
慢性型多见于青壮年,以女性为多见,男,女发病率为1:3～4.起病隐匿,症状较轻,主要表现为皮肤紫癜,黏膜出血及月经量增多,脾脏不肿大或轻度肿大.
[检验]
1)血象 血小板数持续下降或明显下降,急性ITP在20×109/L以下,慢性ITP为(30～80)×109/L,平均血小板体积(MPV)及血小板分布宽度(PDW)增加.血液涂片上可见大血小板,巨大血小板,畸形血小板,胞质中颗粒减少及幼稚血小板.
2)骨髓象 骨髓增生活跃至明显活跃,巨核细胞系统增生或明显增生伴成熟障碍(即产血小板型巨核细胞明显减少或缺如,而且血小板也明显减少).有时巨核细胞可见胞体小,核不分叶等形态改变,粒细胞系统,红细胞系统一般无明显异常.
3)血小板相关抗体,补体检测 急性ITP患者血小板相关抗体(PAIgG,PAIgM,PAIgA)均可增高,其中PAIgG增高者占95%.慢性型可伴有血小板相关补体(PAC3,PAC4)的增高.
4)其它检查 血小板寿命缩短(急性型为1～6小时,慢性型为12～48小时),血小板对ADP增强或下降,出血时间可延长,血块收缩不良,束臂试验阳性等.
(2)同种免疫性血小板减少性紫癜
1)新生儿同种免疫性血小板减少性紫癜
[概述] 新生儿同种免疫性血小板减少性紫癜(neonatal alloimmune thrombocytopenia,NAT)是由于孕妇与胎儿的血小板同种抗原不合所致的血小板减少性疾病.胎儿血小板膜上有来自父亲的某一抗原,但孕妇无此抗原,当胎儿血小板通过胎盘进入母体后,母体即可能产生该抗原的抗体使血小板减少.新生儿在出生时通常正常,但产后数小时后开始出现全身散在的出血点和紫癜,并常有消化道或泌尿道出血.
[检验] 外周血血小板数量明显减少(常低于30×109/L以下);新生儿的母亲血中可检测到抗新生儿的血小板抗体.
2)输血后紫癜
[概述] 输血后紫癜(post-transfusion purpura,PTP) 是指输血后引起的急性免疫性血小板减少性紫癜.患者输注含血小板成份的血液后,患者突然出现血小板减少,可能是缺乏某种血小板特异抗原的受者接受了该抗原阳性的血液后产生的同种免疫反应,导致本病的致敏抗原90%以上为PLA1.病人有不同程度皮肤,黏膜出血.
[检验] 外周血血小板数常小于10×109/L;用经氯喹处理的血小板免疫荧光试验等方法可检测到特异的血小板同种抗体.
(3)血栓性血小板减少性紫癜-溶血性尿毒症综合征
[概述] 血栓性血小板减少性紫癜-溶血性尿毒症综合征(thrombotic thrombocytopenic purpura-hemolytic uremic syndrome,TTP-HUS)是一种临床上较少见且病因,机理不明的血栓性微血管病(thrombotic microangiopathies,TMA).以前认为TTP和HUS是两种不同的疾病,但大量研究表明两者发病机理相似,不能绝对分开,而是同一疾病的不同临床表现,因此称为TTP-HUS.本病的典型病理改变为微动脉和毛细血管透明血栓形成(主要由血小板和少量纤维蛋白组成), TTP病变累及全身所有器官, HUS病变主要累及肾脏.
典型者的临床表现为TTP五联症和HUS三联症.TTP五联症是指发热,中枢神经系统损害症状,微血管病性溶血性贫血,出血及肾功能损害,HUS三联症即TTP五联症中的后三者.根据临床表现的不同可将本病分为三型:①腹泻型HUS:多数是由于感染大肠杆菌O127 ,H7等所致,常以血性腹泻为前驱症状,好发于婴幼儿;②非腹泻型HUS:多数为原发性的,常有轻度病毒感染的前驱症状,多见于成年人;③TTP:常具有TTP五联症,以神经系统症状最为明显,多见于成年人.
[检验] 外周血血小板数多数在20×109/L以下,白细胞数正常或增加,Hb常降低,血涂片中见碎裂的红细胞和网织红细胞数明显增高;血小板寿命及红细胞寿命缩短等.
(4)继发性血小板减少性紫癜
继发性血小板减少性紫癜(secondary thrombocytopenic purpura)又称获得性血小板减少症,是指继发于全身性疾病引起血小板破坏增加或消耗增加或生成障碍所致的血小板减少紫癜,涉及的病种相当多.
1)药物性免疫性血小板减少性紫癜
临床上有数百种药物可引起血小板减少,常见的有肝素,奎宁,喹尼丁,利福平,青霉素,头孢菌素,磺胺类,阿司匹林,消炎痛,保泰松,扑热息痛,安定,苯妥英钠,卡马西平,速尿,甲基多巴,磺脲类等.
2)感染性血小板减少性紫癜
EB病毒,微小病毒B19,流行性腮腺炎病毒,麻疹病毒,巨细胞病毒HIV-1及某些细菌等感染可引起血小板减少,感染引起的血小板减少机制包括血小板直接被破坏,骨髓造血功能抑制,免疫反应等.
3)其他继发性血小板减少性紫癜
多种疾病可导致血小板减少,如白血病,恶性淋巴瘤,多发性骨髓瘤,恶性组织细胞病,骨髓增生异常综合征,骨髓纤维化,巨幼细胞性贫血,再生障碍性贫血,阵发性睡眠性血红蛋白尿症,脾功能亢进,弥散性血管内凝血,免疫性疾病,射线,苯中毒,某些药物等.
3.血小板功能异常疾病的概述和检验
血小板功能异常疾病是一组由于血小板功能异常所引起的出血性疾病,根据病因分为遗传性和继发性.
(1)遗传性血小板功能异常疾病
1)血小板无力症(thrombosthenia):也称为Glanzmann病,是一种常染色体隐性遗传的出血性疾病,本病主要缺陷是GPⅡb/Ⅲa量或质的异常.此病仅纯合子才有症状,多见于新生儿,主要临床表现为皮肤,黏膜出血为主.患者未抗凝血的血涂片中血小板呈散在分布;血小板GPⅡb/Ⅲa(CD41b/CD61)减少,缺乏或质量异常;在血小板聚集试验中,血小板对瑞斯托霉素有聚集反应,而对其他无聚集反应或聚集反应明显减低;出血时间延长,PF3有效性下降.
2)巨大血小板综合征(Bernard-Soulier syndrome,BSS) 是一种常染色体隐性遗传的出血性疾病.本病主要缺陷是GPⅠb/Ⅸ复合物量或质的异常,该复合物由GPⅠbα,GPⅠbβ,GPⅨ,GPⅤ四种多肽按2:2:2:1的比例组成,前三者为该复合物表达所必须的成份.由于患者血浆中高分子量的vWF多聚体减少,故本病又称为假性vWD或血小板型vWD.本病主要表现为轻度至中度皮肤和黏膜出血.患者外周血血小板数减少,血小板增大增加;出血时间延长;在血小板聚集试验中,瑞斯托霉素不能诱导血小板聚集反应;血小板黏附试验可减低;血小板GPⅠb/Ⅸ复合物(CD42b,CD42c/CD42a)减少,缺乏或质量异常.
3)贮存池病(storage pool disease) 是指血小板中颗粒缺乏或其内容物释放障碍.根据缺陷的颗粒种类分为①α-贮存池病:又称为灰色血小板综合征(gray platelet sydrome,GPS),为常染色体显性遗传.患者外周血血小板减少,外周血涂片中有颗粒缺少的大型灰色血小板,血小板对胶原,凝血酶诱导的聚集反应常降低;②δ-贮存池病:多数患者出血时间延长,ADP和肾上腺素诱导的血小板第一相聚集波正常,但第二相聚集波异常;③α,δ贮存池病:指同时有α血小板第3因子缺乏症 又称为Scott综合征或血小板病(thrombopathia),为常染色体隐性遗传,患者血小板膜磷脂的结构或成份有缺陷,致使血小板不能有效地提供凝血催化表面.α颗粒,δ颗粒缺乏,但以后者为主.
4)实验室检查患者凝血酶原消耗不佳,PF3有效性减低,其它血小板功能正常.
(2)继发性血小板功能异常
继发性血小板功能异常又称为获得性血小板功能异常,是指某些疾病或药物通过不同机制导致血小板功能异常的一组疾病的总称.临床上导致血小板功能异常的有骨髓增殖性疾病,骨髓增生异常综合征,白血病,多发性骨髓瘤,恶性淋巴瘤,尿毒症,肝脏疾病,糖尿病,弥散性血管内凝血,某些药物等.此类疾病表现为皮肤,黏膜出血或无出血症状,实验室检查血小板计数常正常,但有血小板功能异常.
4.遗传性血液凝固缺陷
(1)血友病
1)血友病的定义,分类:血友病是一组遗传性因子VIII和IX 基因缺陷,基因突变,基因缺失,基因插入等导致激活凝血酶原酶的功能发生障碍所引起的出血性疾病.包括血友病A或称血友病甲,因子VIII缺乏症;血友病B或称血友病乙,因子IX缺乏症.
2)血友病的诊断:A型和B型血友病为性连锁(伴性)隐性遗传.其临床特点是:自发性或轻微外伤后出血难止;出血常发生于负重的大关节腔内(膝,踝,肘,腕,髋,肩关节)和负重的肌肉群内(肱三头肌,股四头肌,腓肠肌,腰大肌).
凝血试验是诊断和鉴别本类疾病的重要方法,可按照下列检验程序,作一个完整的血友病检测,表11-1.
表11-1 血友病和因子XI缺乏症的检验和鉴别
血友病A 血友病B 因子XI缺乏症
重型 中型 轻型 亚临床型 重型 中型 轻型 亚临床型 纯合子型 杂合子型
筛检试验
CT普通试管法 ↑ N N N ↑ N N N N/↑ N
涂硅试管法 ↑ ↑ ↑ ↑/N ↑ ↑ ↑ ↑/N ↑ N
ACT ↑ ↑ ↑ ↑/N ↑ ↑ ↑ ↑/N ↑ N
APTT ↑ ↑ ↑ ↑/N ↑ ↑ ↑ ↑/N ↑ N
纠正试验
STGT和TGT ↑ ↑ ↑ N/↑ ↑ ↑ ↑ N /↑ ↑ N
加正常新鲜血浆(+)(+)(+)(+) (+)(+)(+)(+) (+)
加正常吸附血浆(+)(+)(+)(+) (一)(一)(一)(一) (+)
加正常新鲜血清(一)(一)(一)(一) (+)(+)(+)(十) (+)
因子促凝活性和抗原含量
FVIII:C(%) <1 2～5 6～25 26<45 N N N N N N
FVIII:Ag ↓/N ↓/N ↓/N ↓/N N N N N N N
FIX:C(%) N N N N 3%,但其百分率与DIC严重程度无相关性.
2)血小板计数 DIC时,一般为50~100×109/L;处于代偿时,可大于100×109/L,但不会超过150×109/L;在革兰纸阴性细菌所致DIC,PLT早期就可明显下降;革兰氏阳性菌败血症和其它疾病引起的DIC,PLT和Fg往往同步下降.
3)血浆纤维蛋白原含量 DIC明显降低,一般小于1.5g/L,或呈进行性下降(由于部分病人基础Fg含量较高).亦有少数因代偿过度而>4g/L.
4)血浆凝血酶原时间,活化的部分凝血活酶时间和凝血酶时间测定 DIC时均可延长,但DIC早期和慢性DIC时可以正常范围.
5)优球蛋白溶解时间(ELT)测定 DIC时因纤溶活性增高,ELT缩短,常小于70min.但在纤溶酶原代偿,尤其是外源性纤溶酶原和纤维蛋白原补充时,纠正了纤溶激活物在受检样本中的亢进作用,使ELT恢复正常,甚至超过4h,可导致判断困难.故在DIC诊断中,对ELT这一指标要综合分析.
6)血鱼精蛋白副凝固(3P)试验 在DIC失代偿时为阳性,但敏感性不佳,假阴性结果较多.
7)血清FDP测定 DIC时明显高于正常值,一般大于40mg/L.本试验被认为是DIC诊断中最敏感的指标之一.
8)其他 DIC的实验诊断指标还很多,例如血小板活化指标:血浆β-TG,颗粒膜蛋白140(GMP-140)增高;凝血指标:VIII:C降低,凝血酶原片段F1+2,纤维蛋白肽A(FPA)增高;抗凝指标:AT-III降低,凝血酶-抗凝血酶复合物(TAT)增高;纤溶指标D二聚体增高等.这些分子标志物的检测,如有条件开展,通常也只用于疑难病例的诊断.
[诊断标准]
临床表现:
①存在易致DIC的基础疾病,如感染,恶性肿瘤,病理产科,大型手术及创伤.
②有下列二项以上临床表现:Ⅰ)严重或多发性出血倾向;Ⅱ)不能用原发病解释的微循环障碍或休克;Ⅲ)广泛性皮肤,黏膜栓塞,灶性缺血性坏死,脱落及溃疡形成,或不明原因的肺,肾,脑等脏器功能衰竭;Ⅳ)抗凝治疗有效.
实验室检查符合下列条件:同时有下列三项以上异常.① 血小板计数小于100×109/L(肝病,白血病小于50×109/L)或呈进行性下降,或下列二项以上血小板活化分子标志物血浆水平升高:β-TG,PF4,TXB2,GMP-140;② 血浆纤维蛋白原含量小于1.5g/L(白血病小于1.8g/L,肝病小于1.0g/L)或呈进行性下降,或大于4.0g/L;③ 3P试验阳性或血浆FDP大于20mg/L(肝病大于60mg/L),或血浆D-二聚体水平较正常增高4倍以上(阳性);④ PT延长或缩短3s以上(肝病大于5s),APTT延长或缩短10s以上;⑤ AT-III活性<60%(不适用于肝病)或蛋白C(PC)活性降低;⑥ 血浆纤溶酶原抗原<200mg/L;⑦ 血浆因子VIII:C活性8ng/ml或凝血酶调节蛋白(Tm)较正常值高2倍以上.
疑难或特殊病例应有下列二项以上异常.① 血浆凝血酶原碎片(F1+2),凝血酶抗凝血酶III复合物(TAT)或FPA水平增高;② 血浆可溶性纤维蛋白单体复合物(SFMC)水平增高;③ 血浆纤溶酶,纤溶酶抑制复合物(PLC)水平增高;④ 血浆组织因子(TF)水平增高或组织因子途径抑制物(TFPI)水平下降.
6.血栓性疾病和抗栓治疗的监测
(1)心肌梗死的血栓止血学变化:较有价值的观察指标是分子标志物检测,见表11-4.
(2)脑梗死的血栓止血学变化:较有价值的诊断,观察指标是分子标志物检测.见表11-4.
(3)肺梗死的血栓止血学变化:血浆D-二聚体水平超过500mg/L(ELISA法)是90%以上肺栓塞和肺梗死患者的共同特点.其他有关分子标志物的检测,如ET-1,TM,vWF:Ag,TXB2,P选择素,b-TG和PF4等也已广泛应用于临床.但是血栓止血检查对于肺梗死的诊断并不重要.
(4)深静脉血栓形成(deep vein thrombosis,DVT)的血栓止血学变化:较有价值的诊断,观察指标是分子标志物检测.见表11-4.
(5)血栓前状态的概念和血栓止血学变化:也称血栓前期,是指血液有形成分和无形成分的生化学和流变学发生某些变化,这些变化可以反映:①血管内皮细胞受损或受刺激;②血小板和白细胞被激活或功能亢进:③凝血因子含量增高或被活化;④血液凝固调节蛋白含量减少或结构异常;⑤纤溶成分含量减低或活性减弱;⑥血液黏度增高和血流减慢等.在这一病理状态下,血液有可能发生血栓形成或血栓塞性疾病.而一般所指的高凝状态是仅限于体内凝血因子的血浆水平升高,及(或)凝血因子被激活,从而引起血液凝固性增强的一种病理过程.高凝状态实际上也包括在血栓前状态之内.血栓前状态仅仅是一种血栓与止血的病理状态,可以长时期存在,故临床上常无特异的症状和体征.
目前国内外都开始利用敏感和特异的分子标志物对血栓前状态和血栓性疾病进行检测,见表11-4.
表11-4血栓前状态和血栓性疾病分子标志物检测的结果
分子标志物 化学性质 病理生理过程 检测方法 心肌 脑梗死 深静脉 DIC 血栓
梗死 血栓形成 前状态
血管损伤标志物
vWF 蛋白质 各种血栓病均增高 火箭电泳或ELBA ↑ ↑ ↑ ↑ ↑/N
ET-1 蛋白肽 血管损伤时增高 ELISA或RIA ↑ ↑ ↓ ↑/↓ N
TM 蛋白质 血管损伤时增高 ELISA ↑ ↑ ↑/N
6-酮-PGF1α 蛋白质 血管损伤时降低 ELISA或RIA ↓/N ↓/N ↓ ↓/N N
血小板活化标志物
β-TG 蛋白质 α颗粒释放增多 ELISA或RIA ↑ ↑ ↑/N ↑ ↑
PF4 碱性蛋白 α颗粒释放增多 ELISA或RIA ↑ ↑ ↑/N ↑ ↑
5HT 吲哚胺 致密体释放增多 ELISA或RIA ↑ ↑ ↑/N ↑ ↑
TXB2 花生四烯酸衍生物 血小板活化增多 ELISA或RIA ↑ ↑ ↑/N ↑/N ↑
GMP-140 蛋白肽 α颗粒释放增多 ELISA或RIA ↑ ↑ ↑ ↑ ↑
凝血因子活化标志物
TF 脂蛋白 组织和血管损伤增高 ELISA ↑ ↑ ↑/↓ ↑/N
TFPI 蛋白质 由于消耗而减低 ELISA ↓ ↑/↓ ↑/↓
F1+2 蛋白肽 随凝血酶生成而增多 ELISA ↑ ↑/N ↑ ↑ ↑
FPA 蛋白肽 随纤维蛋白生成而增多 ELISA ↑ ↑/N ↑ ↑ ↑
抗凝蛋白活性标志物
TAT 蛋白质 随凝血酶生成而增高 ELISA或RIA ↑ ↑/N ↑ ↑ ↑
PCP 蛋白肽 随蛋白c活化而增高 ELISA或RIA ↑ ↑/N ↑
纤溶活化标志物
t-PA 蛋白质 血管调节时增高或降低 ELISA ↓ ↓ ↓/N ↓/↑ ↓/N
PAI 蛋白质 血管调节时增加 ELISA或RIA ↑ ↑ ↑ ↑/↓ ↑
PAP 蛋白质 随纤溶酶增加而增多 ELISA或RIA ↑ ↑/N ↑ ↑ N
Bβ15-42 蛋白肽 随纤溶激活而增多 ELISA或RIA ↑ ↑/N ↑ ↑ N
FDP 蛋白肽 随纤溶激活而增多 ELISA ↑ ↑ ↑ ↑ ↑
D-D 蛋白肽 随纤溶激活而增多 ELISA或RIA ↑ ↑ ↑ ↑ ↑
注:↑,增高;↓,降低;N,正常
(6)易栓症的定义,分类和血栓止血学变化:易栓症包括有血栓栓塞的遗传性血液凝固调节蛋白缺陷,凝血因子异常和纤溶成分缺陷或代谢障碍等疾病.本症患者临床上以反复发作性静脉或动脉血栓塞为主要表现,血栓形成或栓塞可以自发发生或诱发发生,其诱因常是妊娠,产后,手术,创伤和药物等.其分类及特征见表11-5.
表11-5易栓症的分类及其特征
发生率 遗传 血栓特征 血栓形成机制
(%)* 方式
抗凝活性缺陷
ATIII缺陷 2.6～2.8 AD 静脉血栓 不能抑制凝血磷和因子Xa
HC-II缺陷 0.75
II型 IIa ↓ N <0.75
IIb N N <0.75
蛋白S缺陷
PS:A TPS:Ag FPS:Ag
I型 ↓ ↓ ↓
II型 IIa ↓ N N
IIb ↓ N ↓
APC抵抗(FVa缺陷)
APC-SR 诊断值 参考值
纯合子型 <0.45 0.84
杂合子型 0.45～0.70 0.84
HC-II缺陷
HC-II:A HC-II:Ag
I型 ↓ ↓
II型 ↓ N
纤溶酶原缺乏
PLG:A PLG:Ag
I型 ↓ N
II型 ↓ ↓
PAI-1过多
束臂试验 PAI:A PAI:Ag t-PA
前 ↑ ↑ N
后 ↑↑ ↑↑ N/↑
注:↓,减低;↓↓,明显减低;↑,增高;↑↑,明显增高;APC-SR,活化蛋白C敏感比值;N,正常
(7)抗凝治疗的监测
抗凝治疗常用的药物是肝素和口服抗凝剂.
1)肝素监测
①APTT:是监测普通肝素的首选指标.应用小剂量肝素(5000～10000U/24h),可以不作监测.应用10000U/24h者,APTT可延长至正常值(31～43s)的1.5～1.7倍,也不至于引起出血并发症.但是在应用中等剂量(10000～20000U/24h)和大剂量(20000～30000U/24h),必需作监测试验,使APTT较正常对照值延长1.5～2.5倍.
②血浆肝素浓度监测:是肝素监测的又一较为理想的指标.在APTT为正常对照值的1.5～2.5倍时,血浆肝浓度为0.2～0.5U/ml.这种浓度的肝素是治疗的最佳选择.
③低相对分子质量肝素(LMWH)监测:目前多用抗因子Xa活性作为监测LMWH的指标.一般认为, LMWH的抗因子Xa活性维持在0.5～4.0个抗因子Xa单位/ml为佳.
④血小板计数:在应用肝素的过程中,需监测PLT使其维持在(5O～60)×109/L以上为宜.
2)口服抗凝剂监测
①PT:是监测口服抗凝剂的首选指标.在应用口服抗凝剂的过程中,使PT维持在正常对照值(12.0±1.0s)的1.5～2.0倍,使凝血酶原时间比率(prethrombin time ratio,PTR)维持在1.5～2.0为佳.目前推荐应用国际标准化比值(internationa1 normolized rotio,INR)作为监测口服抗凝剂的可靠指标.
②F1+2监测:在(0.10～1.5)nmo1/L之间对监测口服抗凝剂较为理想[参考值为(0.40±0.23)nmo1/L].
(8)抗血小板治疗的监测:应用小剂量阿司匹林(80～325mg/d),勿需作监测试验.噻氯吡啶(ticlopidine),在口服250～50Omg/d时,在开始用药的l～2周内,需每周检测血小板聚集试验1～2次,使PAgT抑制率维持在参考值的30%～50%,BT(国际标准化出血时间测定器法)延长是参考值上限(≤8min)的1.5～2.0倍,PLT减低是参考值低限(100×109/L)的50%～60%为宜.
(9)抗栓酶治疗的监测:最常用的是精制蝮蛇抗栓酶(Svate-3)和去纤酶.以Fg和PLT作为监测指标,使Fg和PLT分别维持在1.2～1.5g/L和(50～60)×109/L为宜.用APTT,PT或TT作为监测指标,依次维持在正常对照值的1.5～2.5倍,1.5～2.0倍或2.0～2.5倍为宜.
(10)溶栓治疗监测
1)Fg,TT,D-Dimer和FDP检测的应用监测:持续应用溶栓药物,如链激酶(SK),尿激酶(UK)和组织型纤溶酶原激活剂(tPA)等,可致机体处于高纤溶状态.应维持Fg在1.2～1.5g/L,TT在正常对照的1.5～3.5倍,FDP在(300～400)mg/L最为合适.D-Dimer在大剂量或持续溶栓的前三天可能单独高达4000μg/L以上,但出血的几率并不高,可作为溶栓剂量达标的指标.
2)TAT监测:TAT也可以作为观察溶栓治疗疗效的指标.当TAT>20～40μg/L时,显示发生溶栓后再栓塞.
·下一篇：文章编号:1007-8738(2005)S-0113-03