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◇技术方法◇
人脾脏巨噬细胞的分离与纯化
闫 峰,李宗芳,张 澍,杨建辉,李爱民,刘效恭
(西安交通大学第二医院普外科,陕西西安 710004)
摘要:目的 探索分离纯化大量人脾脏巨噬细胞(MΦ)的方法.方法 选取10例手术切除的脾脏,机械研磨法获得
脾脏组织细胞混悬液.采用贴壁培养的方法进行MΦ的分离与纯化,相差显微镜下动态观察,明确贴壁培养的合适
时间,详细记录MΦ分离纯化过程各步骤所需时间.收获的MΦ,台盼蓝染色判定活力并计数,统计出平均每克脾脏
组织收获的MΦ数及其纯度.相差显微镜,透射电镜观察分离纯化MΦ的形态特征.结果 分析贴壁培养各时间段
的细胞纯度及活力,确定MΦ培养的合适时间为2～3h.贴壁培养纯化后,平均从每克脾脏组织可收获(0. 25±0. 03)
×108个MΦ,纯度为(90±5)% ,细胞活力≥99 % ,细胞结构及各种细胞器结构均完整.结论 贴壁培养方法分离纯
化人脾脏MΦ是成功可行的,收获的MΦ数量大,纯度高,活力好,为脾脏MΦ功能的深入研究奠定了基础.
关键词:脾脏;巨噬细胞;贴壁培养;分离方法
中图分类号:R318. 1 文献标识码:A 文章编号:167128259(2004)0520513204
Isolation andpurif ication of macrophages from human spleen
Yan Feng , Li Zongfang , Zhang Shu , Yang Jianhui , Li Aimin , Liu Xiaogong
(Depart ment of General Surgery , Second Hospital of Xipan Jiaotong U niversity , Xipan 710004 , China)
ABSTRACT :Objective To de vel op a n ovel me t h od of is ola ti ng a n dp urifyi ng agre a t num be r of mac r op hages
f r o m h uma n sp lee n .Metho ds Te n cases of e xcisi o nal h uma n sp lee n we re select e d . I n or de r t o obt ai n a sp lee n cell
s usp e nsi o n , h uma n sp lee ns we re c ut i nt o s mallp ieces , mec ha nicallygr oun d i n c ult ure me di um of R PM I21640a n d
f ilt e re d. M ac r op hages we re is ola t e d a n dp urif ie d by a nc h ori ng c ulti va ti o n , a n d we re obse r ve d c o nsec uti vely un de r
p hase2c o nt r ast mic r osc op e t o i de ntify t he op ti mal ti me of c ulti va ti o n . M e a nw hile , t he ti me nee de d duri ng e ac h
p r oce dure w as rec or de d i n de t ail . The via bility ofp urif ie d mac r op hages w as assesse d wit h t ryp a n bl ue e xcl usi o n , a n d
t he a ve r ageyiel dp e rgr a m of sp lee n a n dp urity of mac r op hages we re calc ula t e d . M orp h ol ogical c ha r act e ristics of
is ola t e d mac r op hages we re de t ect e d byp hase2c o nt r ast mic r osc op e a n d t r a ns missi o n elect r o n mic r osc op e .Re sult s
The op ti mal ti me of a nc h ori ng c ulti va ti o n w as c o nf i r me d t o be2～3h ours . The a ve r ageyiel d of mac r op hages
is ola t e d f res hly w as(0.25±0.03)×108p e rgr a m of sp lee n ,p urity w as90%±5% , a n d t he via bility w as c o nst a ntly
≥99%. Cell st r uct ure a n d orga nelle ult r ast r uct ure of mac r op hages we re i nt act .Conclusion Agre a t num be r of
mac r op hages wit h high degree ofp urity a n d via bility ca n be s uccessf ully is ola t e d a n dp urif ie d f r o m h uma n sp lee n by
a nc h ori ng c ulti va ti o n . This n ovel me t h od of is ola ti o n a n dp urif ica ti o n will un doubt e dly f acilit a t e t he f uncti o nal
i nvestiga ti o n of mac r op hages i n h uma n sp lee n .
KEY WORDS :sp lee n ; mac r op hage ; a nc h ori ng c ulti va ti o n ; is ola ti o n me t h od
收稿日期:2004202226 修回日期:2004204216
基金项目:国家自然科学基金项目(No . 30170909);教育部\"优秀青年
教师资助计划\"项目(2003).
通讯作者:李宗芳, Tel :(029)87678116 ; E2mail : lzf2568 @vip . sina.
com.
作者简介:闫峰(19772),男(汉族),博士研究生,研究方向:门脉高压
症和恶性肿瘤的治疗. E2mail :yanyisheng- ricky @tom. com
巨噬细胞(macrop hage ,MΦ)功能及其在疾病发
生过程中的作用是目前研究的热点问题之一.脾脏
是重要的MΦ储存器官, MΦ作为主要的抗原递呈
细胞,在门脉高压症<B style=\'color:black;background-color:#ffff66\'>脾功能亢进等脾脏疾病中理应发
挥着重要作用,本研究小组曾针对此问题作过初步探
讨 1 .但是,对于脾脏MΦ的功能及其分子调控机
制,人们所知的信息甚少.这很大程度上是由于分离
纯化脾脏MΦ的技术难度造成的.鉴于此,我们研
究探索出一种分离纯化大量人脾脏MΦ的方法,现
报道如下.
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验对象 自2003年6月至2004年2月,
选取10例手术切除的脾脏进行MΦ的分离与纯化,
第2 5卷第5期
2 0 0 4年1 0月
西安交通大学学报(医学版)
J our nal of Xipa n J ia ot o ng U ni ve rsity(M e dical Scie nces)
V ol .25N o .5
Oct .2004
其中8例来自西安交通大学第二医院普外科门脉高
压症脾亢患者,2例来自西安交通大学第二医院急诊
外科外伤脾破裂患者.患者年龄33～64岁,平均
39. 6岁;男性6例,女性4例.
1.1.2 主要仪器 二氧化碳培养箱(Heraeus2BB16
型,德国);相差显微镜(XSZ2D型,重庆);超净工作
台(SW2CT2IC型,苏州);低速离心机(LD522A型,北
京);电子天平(AB1042N型,上海);透射电镜
(HITCH2H2600型,日本).
1.1.3 主要试剂 PBS液(平衡盐溶液),用干粉剂
(GIBCO ,美国)自行配制,高压蒸气灭菌; RPM I21640
(培养基),用干粉剂(SI GMA ,美国)自行配制,其中
加入青霉素105U L- 1,链霉素105U L- 1,胰岛素
24U L- 1,地塞米松5 mg L- 1,抽滤(双层滤膜,孔径
为0. 22μm和0. 45μm)除菌;胎牛血清(FBS),使用
前将- 20℃冻存的FBS(四季青,杭州)置于4℃冰
箱内解冻,然后于56℃水浴中灭活30 min ,按100
mL L- 1比例加入RPM I21640中.
1.2 方法
1.2.1 脾脏组织的获取与转运 手术室取手术切除
的脾脏标本组织,立即剪碎成体积约1mm3的小组织
块,移入装有预冷4℃PBS的无菌密封瓶内,迅速转
运至细胞培养室内,组织称重.
1.2.2 脾脏组织细胞混悬液的制备 将脾脏组织块
移至无菌操作台, PBS洗涤3次, RPM I21640洗涤
2次,以清除组织内的血液并保证组织的无菌.机械
研磨脾脏组织,这时便有大量的组织细胞悬混于RP2
M I21640液中.用200目不锈钢滤网过滤悬混有组
织细胞的RPM I21640液,滤液为脾脏组织细胞混悬
液(主要含红细胞,淋巴细胞,MΦ等).
1.2.3 脾脏组织细胞混悬液中红细胞的裂解 脾脏
组织细胞混悬液用RPM I21640液洗涤离心(1 000 r
min- 1,3 min),以去除细胞碎屑.加入Tris2N HCl4作
用5 min ,裂解红细胞.迅速离心(1 000 r min- 1,3
min),去除上清液内的裂解红细胞碎片.PBS洗涤
离心3次,RPM I21640洗涤离心1次,以清除混悬液
中残存的Tris2N HCl4,避免其影响细胞的存活.此
时,混悬液中主要含脾脏组织MΦ和淋巴细胞.
1.2.4 脾脏组织MΦ的贴壁培养 将前述混悬液
作为培养细胞原液,台盼蓝染色判定活力并计数,用
RPM I21640液调整细胞浓度为(3～5)×106 L- 1.
将调整好浓度的细胞悬液接种于玻璃培养瓶内,培养
条件为37℃,50 mL L- 1CO2,100 %湿度.分别培
养2,4,6,12,24 h ,相差显微镜下形态学观察并照相.
1.2.5 贴壁脾脏组织MΦ的消化 吸去培养上清
液,MΦ贴壁, PBS反复吹打,消化,所得细胞悬液洗
涤离心(1 000 r min- 1, 3 min),得到分离纯化的
MΦ.
1.2.6 分离纯化MΦ活力和纯度的判定 台盼蓝
染色法判定MΦ存活与否(活细胞拒染),计数100个
MΦ细胞,活MΦ所占比例为MΦ活力.光镜下MΦ
体积较大,胞浆内颗粒物质丰富,与淋巴细胞区别明
显,计数100个细胞,MΦ所占比例为MΦ纯度.结
合脾脏组织质量,计算出每克脾脏组织收获的MΦ
数.
1.2.7 透射电镜检测分离纯化的脾脏组织MΦ 贴
壁培养的MΦ经消化后得到细胞悬液,取样移入离
心管内,离心(1 000 r min- 1,3 min)后去除上清液,
加入4℃预冷的25g L- 1戊二醛4 mL ,固定2 h ,再
用10g L- 1四氧化锇固定30 min ,置入系列丙酮内
在室温下逐级脱水.树脂包埋,超薄切片机切片,醋
酸铀和柠檬酸铅双重染色,在透射电镜下观察MΦ
超微结构.
1.2.8 统计学处理 采用SPSS10. 0统计软件进行
数据分析,所有数据均以均数±标准差( x±s)表示.
组间比较用t检验,P<0. 05为有显著性差异.
2 结 果
2.1 MΦ贴壁培养的合适时间 倒置显微镜下动态
观察显示,培养2～3 h ,贴壁MΦ较多且较牢固,细
胞活力好;培养4 h ,贴壁MΦ较多且较牢固,细胞活
力好,但少数淋巴细胞也贴壁;培养6 h ,贴壁MΦ较
多且较牢固,细胞活力好,但大部分淋巴细胞也贴壁;
培养12,24 h ,贴壁MΦ多数已脱落,活力明显下降.
因此,确定MΦ贴壁培养的合适时间为2～3 h.
2.2 MΦ分离纯化过程各步骤所需时间 在进行细
胞贴壁培养前的一系列步骤中,脾脏组织的机械研磨
和脾脏组织细胞混悬液中红细胞的裂解是两个主要
的限速步骤.而这两个步骤所需时间都取决于脾脏
组织的质量.以10g脾脏组织为标准,各步骤所需
时间见表1.
2.3 MΦ分离纯化过程各阶段收获的细胞量 机械
研磨获得的脾脏组织细胞混悬液,裂解红细胞后的细
胞混悬液以及贴壁培养纯化后的消化液,其各自所含
的细胞种类不同,细胞数量也有明显差异(P<0. 01,
表2).
2.4 分离纯化后MΦ的纯度及产量 贴壁培养纯化
后,平均从每克脾脏组织可收获(0. 25±0. 03)×108个
MΦ,纯度为(90±5)% ,细胞活力≥99 %.
415 西安交通大学学报(医学版)第25卷
表1 分离纯化过程各步骤所需时间
Table 1 The time needed during eachprocedure of isolation and
purification
ProcedureTime needed/ min
Obtaining and transpot of splenic tissue10
Weighing of splenic tissue5
Washing of splenic tissue5
Mechanicalgrinding of splenic tissue45
Disruption of eryt hrocytes30
Vitality assessment and concentration
adjust ment of innoculated cells
10
Anchoring cultivation of cells120～180
Digestion of adherent cells20
表2 分离纯化过程各阶段收获的细胞数量
Table 2 The total cellyieldpergram of spleen during eachpro2
cedure of isolation andpurification
ProcedureMain kind of cell
Cellpop ulatio n(n= 10,
108 g- 1splenic tissue)
Cell suspensio n of
splenic tissue
Eryt hrocyte ,
lymp hocyte , MΦ3. 22±0 . 383
Cell suspensio n af ter
disrup tio n of
eryt hrocytes
Lymp hocyte ,
MΦ1. 81±0 . 123
Cell suspensio n af ter
digestio n of adherent
andp urified cells
MΦand a small
percentage of
lymp hocyte
0. 28±0 . 023
3P< 0 . 01
2.5 分离纯化MΦ的形态特征
2.5.1 相差显微镜观察MΦ的形态特征 相差显
微镜下可见贴壁培养的MΦ多为圆形或椭圆形,少
数呈梭形或多边形.细胞体积较大,细胞膜完整,细
胞核清晰可见,胞浆内容物丰富(图1).
图1 贴壁培养的MΦ
Fig. 1 Phase2contrast microscopic micrograp h of anchoring cul2
tured macrop hages ×400
2.5.2 透射电镜观察MΦ的超微结构 透射电镜
下MΦ多为圆形或椭圆形,细胞表面有少量的微绒
毛样突起,细胞核位于中央,其形态不规则,核内常染
色质分布均匀,异染色质在核膜下聚集,核仁可见.
细胞质内可见到圆形或椭圆形线粒体,少量管状的粗
面内质网及游离核糖体,高尔基复合体发达,另有数
量不等的溶酶体,残体,细胞内还可见到被吞噬的细
胞碎片,细胞膜附近可见到少量的吞饮小泡(图2).
图2 分离纯化MΦ胞浆内吞噬的细胞碎片
Fig. 2 TEM micrograp h of t hep hagocytosis of cell f ragment in
cytoplasm of isolated andpurified macrop hages ×8 000
Cell membrane and st ruct ure of mitochondrion were intact ; rough endo2
plasmic reticulum and lysosome had a clear appearance ; t he nucleus was
intact ; and Golgi complex wasprosperous. Phagocytosis of cell f ragment
in cytoplasm of macrop hage could be seen obviously.
3 讨 论
由于对MΦ功能及其在疾病发生过程中作用的
重视,有关分离纯化MΦ的研究日渐增多.但组织
内MΦ数量相对较少,且往往与其他细胞(如淋巴细
胞等)相混合,因而相对于肝细胞 2 等实质细胞的分
离而言,MΦ的分离纯化是相当困难的.研究人员尝
试从不同种类的动物体内分离纯化MΦ,主要包括人
类,大鼠,兔 3 等,其中最常见的研究对象为大鼠.
此外,由于研究目的不同,分离纯化MΦ的组织或器
官也不尽相同,主要包括血液,腹膜腔液,肺泡 4 ,肝
脏 5 ,脾脏 6 ,腹膜组织 7 ,小肠黏膜 8 等.对于人
类而言,由于活体组织取材的难易程度不同,组织内
的细胞种类不同以及所含MΦ数量不同等原因,报
道最多的是自血液和腹膜腔液分离MΦ,其他组织
(包括脾脏)的相关报道则很少.
迄今为止,研究报道的MΦ分离方法主要包括
贴壁法,密度梯度离心法,酶消化法,流式细胞仪法
等.它们各自有不同的优缺点以及适应的器官或组
织类型.密度梯度离心法主要适用于外周血液中
MΦ的分离, Timo等 6 曾尝试应用此方法从大鼠脾
脏分离纯化MΦ,结果显示获得的MΦ纯度及产量均
很低.Phillip等 8 应用中性蛋白酶消化法从人小肠
黏膜分离纯化MΦ,但此种方法显然不适合于含有较
多胶原纤维的脾脏组织,且此方法耗费的蛋白酶多,
成本较高.应用流式细胞仪分离似乎是较为理想的
5155期闫 峰,李宗芳,张 澍,等.人脾脏巨噬细胞的分离与纯化
分离纯化细胞的方法,但需要大量价格昂贵的用以识
别细胞表面抗原的单克隆抗体 9 ,此外,对于人脾脏
MΦ而言,要探索出其适合的单克隆抗体同样也是一
项极其困难的工作.贴壁法较前述几种方法而言,是
较为经典的一种细胞纯化方法,缺点是相对费时费
力,但结果可靠,对细胞损害较小,成本低廉.基于以
上认识,我们从实际出发选择贴壁法来分离纯化人脾
脏MΦ.
倒置显微镜下动态观察贴壁培养的MΦ,培养2～
3 h ,贴壁MΦ较多且较牢固,细胞活力好;随着培养时
间的延长,淋巴细胞也开始贴壁,这就使得最终收获
MΦ的纯度降低;而培养24 h后,MΦ多数已脱落,活
力明显下降.这些结果说明,MΦ贴壁培养的合适时
间为2～3 h.众所周知,自细胞(细胞株除外)离体至
接种入培养瓶进行培养箱内培养的这段时间极为关
键.这段时间越短,细胞的缺氧时间较短,受到的损伤
较小,受污染的可能性也大大降低,从而后继培养细胞
的活力就越高.分析MΦ分离纯化过程各步骤所需时
间,MΦ贴壁培养的合适时间(2～3 h)是确定的,在进
行细胞贴壁培养前的一系列步骤中,机械研磨和红细
胞裂解是两个主要的限速步骤,而这两个步骤所需时
间又都取决于脾脏组织的质量.因而能否设计制造出
一种自动化仪器,取代人力来进行前述两项关键步骤,
是我们进一步研究的努力方向之一.
贴壁培养纯化后,平均从每克脾脏组织可收获
(0. 25±0. 03)×108个MΦ,纯度较高,细胞活力好,
明显优于采用密度梯度离心法从大鼠脾脏分离纯化
MΦ的结果 6 .此外,结合MΦ分离纯化过程各阶段
收获的细胞量,认为MΦ约占人脾脏组织细胞总量
的7 %～8 %.相差显微镜观察MΦ的形态特征,可
见MΦ体积较大,细胞膜完整,细胞核清晰可见,胞
浆内容物丰富;透射电镜观察分离纯化MΦ的超微
结构,显示各种细胞器结构完整,特征性的溶酶体清
晰可见.说明分离纯化MΦ的培养环境接近于体内
状况,从而保证了MΦ功能的正常发挥,为后继的
MΦ功能研究奠定了基础.
综合以上结果,证实我们分离纯化人脾脏MΦ
的方法是成功可行的.该方法具有:节省经费;不需
要特殊的消化酶或单克隆抗体;收获的MΦ数量大,
纯度高,活力好等优点.该方法必将有力促进脾脏
MΦ功能的深入研究.
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(编辑 邱 芬)
(上接第469)
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(编辑 邱 芬)
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闫 峰,李宗芳,张 澍,杨建辉,李爱民,刘效恭
(西安交通大学第二医院普外科,陕西西安 710004)
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×108个MΦ,纯度为(90±5)% ,细胞活力≥99 % ,细胞结构及各种细胞器结构均完整.结论 贴壁培养方法分离纯
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关键词:脾脏;巨噬细胞;贴壁培养;分离方法
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p hase2c o nt r ast mic r osc op e t o i de ntify t he op ti mal ti me of c ulti va ti o n . M e a nw hile , t he ti me nee de d duri ng e ac h
p r oce dure w as rec or de d i n de t ail . The via bility ofp urif ie d mac r op hages w as assesse d wit h t ryp a n bl ue e xcl usi o n , a n d
t he a ve r ageyiel dp e rgr a m of sp lee n a n dp urity of mac r op hages we re calc ula t e d . M orp h ol ogical c ha r act e ristics of
is ola t e d mac r op hages we re de t ect e d byp hase2c o nt r ast mic r osc op e a n d t r a ns missi o n elect r o n mic r osc op e .Re sult s
The op ti mal ti me of a nc h ori ng c ulti va ti o n w as c o nf i r me d t o be2～3h ours . The a ve r ageyiel d of mac r op hages
is ola t e d f res hly w as(0.25±0.03)×108p e rgr a m of sp lee n ,p urity w as90%±5% , a n d t he via bility w as c o nst a ntly
≥99%. Cell st r uct ure a n d orga nelle ult r ast r uct ure of mac r op hages we re i nt act .Conclusion Agre a t num be r of
mac r op hages wit h high degree ofp urity a n d via bility ca n be s uccessf ully is ola t e d a n dp urif ie d f r o m h uma n sp lee n by
a nc h ori ng c ulti va ti o n . This n ovel me t h od of is ola ti o n a n dp urif ica ti o n will un doubt e dly f acilit a t e t he f uncti o nal
i nvestiga ti o n of mac r op hages i n h uma n sp lee n .
KEY WORDS :sp lee n ; mac r op hage ; a nc h ori ng c ulti va ti o n ; is ola ti o n me t h od
收稿日期:2004202226 修回日期:2004204216
基金项目:国家自然科学基金项目(No . 30170909);教育部\"优秀青年
教师资助计划\"项目(2003).
通讯作者:李宗芳, Tel :(029)87678116 ; E2mail : lzf2568 @vip . sina.
com.
作者简介:闫峰(19772),男(汉族),博士研究生,研究方向:门脉高压
症和恶性肿瘤的治疗. E2mail :yanyisheng- ricky @tom. com
巨噬细胞(macrop hage ,MΦ)功能及其在疾病发
生过程中的作用是目前研究的热点问题之一.脾脏
是重要的MΦ储存器官, MΦ作为主要的抗原递呈
细胞,在门脉高压症<B style=\'color:black;background-color:#ffff66\'>脾功能亢进等脾脏疾病中理应发
挥着重要作用,本研究小组曾针对此问题作过初步探
讨 1 .但是,对于脾脏MΦ的功能及其分子调控机
制,人们所知的信息甚少.这很大程度上是由于分离
纯化脾脏MΦ的技术难度造成的.鉴于此,我们研
究探索出一种分离纯化大量人脾脏MΦ的方法,现
报道如下.
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验对象 自2003年6月至2004年2月,
选取10例手术切除的脾脏进行MΦ的分离与纯化,
第2 5卷第5期
2 0 0 4年1 0月
西安交通大学学报(医学版)
J our nal of Xipa n J ia ot o ng U ni ve rsity(M e dical Scie nces)
V ol .25N o .5
Oct .2004
其中8例来自西安交通大学第二医院普外科门脉高
压症脾亢患者,2例来自西安交通大学第二医院急诊
外科外伤脾破裂患者.患者年龄33～64岁,平均
39. 6岁;男性6例,女性4例.
1.1.2 主要仪器 二氧化碳培养箱(Heraeus2BB16
型,德国);相差显微镜(XSZ2D型,重庆);超净工作
台(SW2CT2IC型,苏州);低速离心机(LD522A型,北
京);电子天平(AB1042N型,上海);透射电镜
(HITCH2H2600型,日本).
1.1.3 主要试剂 PBS液(平衡盐溶液),用干粉剂
(GIBCO ,美国)自行配制,高压蒸气灭菌; RPM I21640
(培养基),用干粉剂(SI GMA ,美国)自行配制,其中
加入青霉素105U L- 1,链霉素105U L- 1,胰岛素
24U L- 1,地塞米松5 mg L- 1,抽滤(双层滤膜,孔径
为0. 22μm和0. 45μm)除菌;胎牛血清(FBS),使用
前将- 20℃冻存的FBS(四季青,杭州)置于4℃冰
箱内解冻,然后于56℃水浴中灭活30 min ,按100
mL L- 1比例加入RPM I21640中.
1.2 方法
1.2.1 脾脏组织的获取与转运 手术室取手术切除
的脾脏标本组织,立即剪碎成体积约1mm3的小组织
块,移入装有预冷4℃PBS的无菌密封瓶内,迅速转
运至细胞培养室内,组织称重.
1.2.2 脾脏组织细胞混悬液的制备 将脾脏组织块
移至无菌操作台, PBS洗涤3次, RPM I21640洗涤
2次,以清除组织内的血液并保证组织的无菌.机械
研磨脾脏组织,这时便有大量的组织细胞悬混于RP2
M I21640液中.用200目不锈钢滤网过滤悬混有组
织细胞的RPM I21640液,滤液为脾脏组织细胞混悬
液(主要含红细胞,淋巴细胞,MΦ等).
1.2.3 脾脏组织细胞混悬液中红细胞的裂解 脾脏
组织细胞混悬液用RPM I21640液洗涤离心(1 000 r
min- 1,3 min),以去除细胞碎屑.加入Tris2N HCl4作
用5 min ,裂解红细胞.迅速离心(1 000 r min- 1,3
min),去除上清液内的裂解红细胞碎片.PBS洗涤
离心3次,RPM I21640洗涤离心1次,以清除混悬液
中残存的Tris2N HCl4,避免其影响细胞的存活.此
时,混悬液中主要含脾脏组织MΦ和淋巴细胞.
1.2.4 脾脏组织MΦ的贴壁培养 将前述混悬液
作为培养细胞原液,台盼蓝染色判定活力并计数,用
RPM I21640液调整细胞浓度为(3～5)×106 L- 1.
将调整好浓度的细胞悬液接种于玻璃培养瓶内,培养
条件为37℃,50 mL L- 1CO2,100 %湿度.分别培
养2,4,6,12,24 h ,相差显微镜下形态学观察并照相.
1.2.5 贴壁脾脏组织MΦ的消化 吸去培养上清
液,MΦ贴壁, PBS反复吹打,消化,所得细胞悬液洗
涤离心(1 000 r min- 1, 3 min),得到分离纯化的
MΦ.
1.2.6 分离纯化MΦ活力和纯度的判定 台盼蓝
染色法判定MΦ存活与否(活细胞拒染),计数100个
MΦ细胞,活MΦ所占比例为MΦ活力.光镜下MΦ
体积较大,胞浆内颗粒物质丰富,与淋巴细胞区别明
显,计数100个细胞,MΦ所占比例为MΦ纯度.结
合脾脏组织质量,计算出每克脾脏组织收获的MΦ
数.
1.2.7 透射电镜检测分离纯化的脾脏组织MΦ 贴
壁培养的MΦ经消化后得到细胞悬液,取样移入离
心管内,离心(1 000 r min- 1,3 min)后去除上清液,
加入4℃预冷的25g L- 1戊二醛4 mL ,固定2 h ,再
用10g L- 1四氧化锇固定30 min ,置入系列丙酮内
在室温下逐级脱水.树脂包埋,超薄切片机切片,醋
酸铀和柠檬酸铅双重染色,在透射电镜下观察MΦ
超微结构.
1.2.8 统计学处理 采用SPSS10. 0统计软件进行
数据分析,所有数据均以均数±标准差( x±s)表示.
组间比较用t检验,P<0. 05为有显著性差异.
2 结 果
2.1 MΦ贴壁培养的合适时间 倒置显微镜下动态
观察显示,培养2～3 h ,贴壁MΦ较多且较牢固,细
胞活力好;培养4 h ,贴壁MΦ较多且较牢固,细胞活
力好,但少数淋巴细胞也贴壁;培养6 h ,贴壁MΦ较
多且较牢固,细胞活力好,但大部分淋巴细胞也贴壁;
培养12,24 h ,贴壁MΦ多数已脱落,活力明显下降.
因此,确定MΦ贴壁培养的合适时间为2～3 h.
2.2 MΦ分离纯化过程各步骤所需时间 在进行细
胞贴壁培养前的一系列步骤中,脾脏组织的机械研磨
和脾脏组织细胞混悬液中红细胞的裂解是两个主要
的限速步骤.而这两个步骤所需时间都取决于脾脏
组织的质量.以10g脾脏组织为标准,各步骤所需
时间见表1.
2.3 MΦ分离纯化过程各阶段收获的细胞量 机械
研磨获得的脾脏组织细胞混悬液,裂解红细胞后的细
胞混悬液以及贴壁培养纯化后的消化液,其各自所含
的细胞种类不同,细胞数量也有明显差异(P<0. 01,
表2).
2.4 分离纯化后MΦ的纯度及产量 贴壁培养纯化
后,平均从每克脾脏组织可收获(0. 25±0. 03)×108个
MΦ,纯度为(90±5)% ,细胞活力≥99 %.
415 西安交通大学学报(医学版)第25卷
表1 分离纯化过程各步骤所需时间
Table 1 The time needed during eachprocedure of isolation and
purification
ProcedureTime needed/ min
Obtaining and transpot of splenic tissue10
Weighing of splenic tissue5
Washing of splenic tissue5
Mechanicalgrinding of splenic tissue45
Disruption of eryt hrocytes30
Vitality assessment and concentration
adjust ment of innoculated cells
10
Anchoring cultivation of cells120～180
Digestion of adherent cells20
表2 分离纯化过程各阶段收获的细胞数量
Table 2 The total cellyieldpergram of spleen during eachpro2
cedure of isolation andpurification
ProcedureMain kind of cell
Cellpop ulatio n(n= 10,
108 g- 1splenic tissue)
Cell suspensio n of
splenic tissue
Eryt hrocyte ,
lymp hocyte , MΦ3. 22±0 . 383
Cell suspensio n af ter
disrup tio n of
eryt hrocytes
Lymp hocyte ,
MΦ1. 81±0 . 123
Cell suspensio n af ter
digestio n of adherent
andp urified cells
MΦand a small
percentage of
lymp hocyte
0. 28±0 . 023
3P< 0 . 01
2.5 分离纯化MΦ的形态特征
2.5.1 相差显微镜观察MΦ的形态特征 相差显
微镜下可见贴壁培养的MΦ多为圆形或椭圆形,少
数呈梭形或多边形.细胞体积较大,细胞膜完整,细
胞核清晰可见,胞浆内容物丰富(图1).
图1 贴壁培养的MΦ
Fig. 1 Phase2contrast microscopic micrograp h of anchoring cul2
tured macrop hages ×400
2.5.2 透射电镜观察MΦ的超微结构 透射电镜
下MΦ多为圆形或椭圆形,细胞表面有少量的微绒
毛样突起,细胞核位于中央,其形态不规则,核内常染
色质分布均匀,异染色质在核膜下聚集,核仁可见.
细胞质内可见到圆形或椭圆形线粒体,少量管状的粗
面内质网及游离核糖体,高尔基复合体发达,另有数
量不等的溶酶体,残体,细胞内还可见到被吞噬的细
胞碎片,细胞膜附近可见到少量的吞饮小泡(图2).
图2 分离纯化MΦ胞浆内吞噬的细胞碎片
Fig. 2 TEM micrograp h of t hep hagocytosis of cell f ragment in
cytoplasm of isolated andpurified macrop hages ×8 000
Cell membrane and st ruct ure of mitochondrion were intact ; rough endo2
plasmic reticulum and lysosome had a clear appearance ; t he nucleus was
intact ; and Golgi complex wasprosperous. Phagocytosis of cell f ragment
in cytoplasm of macrop hage could be seen obviously.
3 讨 论
由于对MΦ功能及其在疾病发生过程中作用的
重视,有关分离纯化MΦ的研究日渐增多.但组织
内MΦ数量相对较少,且往往与其他细胞(如淋巴细
胞等)相混合,因而相对于肝细胞 2 等实质细胞的分
离而言,MΦ的分离纯化是相当困难的.研究人员尝
试从不同种类的动物体内分离纯化MΦ,主要包括人
类,大鼠,兔 3 等,其中最常见的研究对象为大鼠.
此外,由于研究目的不同,分离纯化MΦ的组织或器
官也不尽相同,主要包括血液,腹膜腔液,肺泡 4 ,肝
脏 5 ,脾脏 6 ,腹膜组织 7 ,小肠黏膜 8 等.对于人
类而言,由于活体组织取材的难易程度不同,组织内
的细胞种类不同以及所含MΦ数量不同等原因,报
道最多的是自血液和腹膜腔液分离MΦ,其他组织
(包括脾脏)的相关报道则很少.
迄今为止,研究报道的MΦ分离方法主要包括
贴壁法,密度梯度离心法,酶消化法,流式细胞仪法
等.它们各自有不同的优缺点以及适应的器官或组
织类型.密度梯度离心法主要适用于外周血液中
MΦ的分离, Timo等 6 曾尝试应用此方法从大鼠脾
脏分离纯化MΦ,结果显示获得的MΦ纯度及产量均
很低.Phillip等 8 应用中性蛋白酶消化法从人小肠
黏膜分离纯化MΦ,但此种方法显然不适合于含有较
多胶原纤维的脾脏组织,且此方法耗费的蛋白酶多,
成本较高.应用流式细胞仪分离似乎是较为理想的
5155期闫 峰,李宗芳,张 澍,等.人脾脏巨噬细胞的分离与纯化
分离纯化细胞的方法,但需要大量价格昂贵的用以识
别细胞表面抗原的单克隆抗体 9 ,此外,对于人脾脏
MΦ而言,要探索出其适合的单克隆抗体同样也是一
项极其困难的工作.贴壁法较前述几种方法而言,是
较为经典的一种细胞纯化方法,缺点是相对费时费
力,但结果可靠,对细胞损害较小,成本低廉.基于以
上认识,我们从实际出发选择贴壁法来分离纯化人脾
脏MΦ.
倒置显微镜下动态观察贴壁培养的MΦ,培养2～
3 h ,贴壁MΦ较多且较牢固,细胞活力好;随着培养时
间的延长,淋巴细胞也开始贴壁,这就使得最终收获
MΦ的纯度降低;而培养24 h后,MΦ多数已脱落,活
力明显下降.这些结果说明,MΦ贴壁培养的合适时
间为2～3 h.众所周知,自细胞(细胞株除外)离体至
接种入培养瓶进行培养箱内培养的这段时间极为关
键.这段时间越短,细胞的缺氧时间较短,受到的损伤
较小,受污染的可能性也大大降低,从而后继培养细胞
的活力就越高.分析MΦ分离纯化过程各步骤所需时
间,MΦ贴壁培养的合适时间(2～3 h)是确定的,在进
行细胞贴壁培养前的一系列步骤中,机械研磨和红细
胞裂解是两个主要的限速步骤,而这两个步骤所需时
间又都取决于脾脏组织的质量.因而能否设计制造出
一种自动化仪器,取代人力来进行前述两项关键步骤,
是我们进一步研究的努力方向之一.
贴壁培养纯化后,平均从每克脾脏组织可收获
(0. 25±0. 03)×108个MΦ,纯度较高,细胞活力好,
明显优于采用密度梯度离心法从大鼠脾脏分离纯化
MΦ的结果 6 .此外,结合MΦ分离纯化过程各阶段
收获的细胞量,认为MΦ约占人脾脏组织细胞总量
的7 %～8 %.相差显微镜观察MΦ的形态特征,可
见MΦ体积较大,细胞膜完整,细胞核清晰可见,胞
浆内容物丰富;透射电镜观察分离纯化MΦ的超微
结构,显示各种细胞器结构完整,特征性的溶酶体清
晰可见.说明分离纯化MΦ的培养环境接近于体内
状况,从而保证了MΦ功能的正常发挥,为后继的
MΦ功能研究奠定了基础.
综合以上结果,证实我们分离纯化人脾脏MΦ
的方法是成功可行的.该方法具有:节省经费;不需
要特殊的消化酶或单克隆抗体;收获的MΦ数量大,
纯度高,活力好等优点.该方法必将有力促进脾脏
MΦ功能的深入研究.
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615 西安交通大学学报(医学版)第25卷
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